双链杂交分子“胰岛素—类胰岛素生长因子—I”

以去Ｂ链Ｃ端八肽胰岛素和化学合成的ＩＧＦ－Ｉ的２２－２９及２２－３２为底物,用酶促半合成方法制备了杂交分子“胰岛素－类胰岛素茵子－Ｉ”,Ｉｎｓ／ＩＧＦ－Ｉ和Ｉｎｓ－ＩＧＦ－Ｉ。研究了它们的胰岛中生物活性。结果表明,猪胰岛素Ｂ链Ｃ端Ｂ２７的Ｔｈｒ被Ａｓｎ取代,Ｂ３０的Ａｌａ被Ａｌａ被Ｔｈｒ取代同时Ｂ２５－Ｂ２６及Ｂ２８－Ｂ２９氨基酸顺序颠紧及在Ｂ链Ｃ末端延长３肽都不影响胰岛素的生物活力。     

双链杂交分子“胰岛素－类胰岛素生长因子－I

以去Ｂ链Ｃ端八肽胰岛素（ＤＯＩ）和化学合成的ＩＧＦ－Ｉ的２２～２９（８肽）及２２－３２（１１肽）为底物,用酶促半合成方法制备了杂交分子“胰岛素－类胰岛素生长因子－Ｉ,Ｉｎｓ／ＩＧＦ－Ｉ（８）和Ｉｎｓ／ＩＧＦ－Ｉ（１１）。研究了它们的胰岛素生物活性,结果表明,猪胰岛素Ｂ链Ｃ端Ｂ２７的Ｔｈｒ被Ａｓｎ取代,Ｂ３０的Ａｌａ被Ｔｈｒ取代同时Ｂ２５～Ｂ２６及Ｂ２８－Ｂ２ｋ９氨基酸顺序颠倒以及在Ｂ链Ｃ末端延长３肽（Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ）都不影响胰岛素的生物活力。     

高效融合表达中载体蛋白对hIGF－Ⅰ免疫原性结构形成的影响

利用人工全合成人胰岛素样生长因子工（ｈＩＧＦ－Ｉ）基因,构建了分别以β－半乳糖苷醇（β－ｇａｌ）的三种即含５９０、３１０、２８０个氨基酸序列片段和一种以ＰｒｏｔｅｉｎＡ的Ｂ、Ｃ结构域（ＰＡＢＣ）为载体蛋白的融合型表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了以上各种ｈＩＧＦ－Ｉ的融合蛋白产物。通过对羟胺裂解前后的ｈＩＧＦ－Ｉ产物进行放射免疫结合测定分析,结果显示以β－Ｇａｌ６９０、３１０、２８０为载体蛋白,均严重影响与其融合的ｈＩＧＦ－Ｉ的免疫原性结构形成,但在ＰＡＢＣ－ｈＩＧＦ－Ｉ融合蛋白中,载体蛋白ＰＡＢＣ无明显的影响作用。这表明在高融合表达低分子量蛋白或肽段中,需选择适宜的载体蛋白,以利于目的产物的功能性结构形成。     

人胰岛素原类似物(BKRA)基因的合成与表达

为了利用基因工程生产胰岛素,按照已知的人胰岛素Ａ、Ｂ链氨基酸序列和大肠杆菌偏爱的氨基酸密码子设计并合成了人胰岛素原类似物（ＢＫＲＡ）基因,其中以赖（Ｋ）－精（Ｒ）二肽编码区取代人胰岛素原Ｃ肽编码区．为了避免其编码蛋白在大肠杆菌中表达时被降解,通过人工接头将２个ＢＫＲＡ基因串联起来,接头部分氨基酸序列为Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ．将串联的ＢＫＲＡ基因克隆到表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）,实现了在大肠杆菌中的融合表达,表达产物以包含体形式存在,约占细菌总蛋白２４％．表达产物氨基末端具有六组氨酸肽段,以ＨｉＴｒａｐ凝胶进行亲和层析,一步纯化可达纯度９５％以上．放射免疫测定表明,纯化的融合蛋白具有胰岛素抗原活性．表明已构建成人胰岛素原类似物的高效表达菌株     

[A_(15)Asn,A_(17)Pro,A_(21)Ala]-胰岛素的体内外生物活性

对胰岛素的研究使得许多生命科学中的重要问题被认识．然而对于胰岛素结构和功能关系,仍有许多不清楚的地方．在胰岛素Ａ链的Ｎ端和Ｃ端各有一个螺旋区：Ａ２－８和Ａ１２－１８．杨士珍［１］的研究表明：缺失Ａ１２－１８肽段的Ａ链类似物虽然能和天然Ｂ链重组,但其重组产物只保留了天然胰岛素的约６％的体内外生物活性．这说明Ａ１２－１８对胰岛素的生物活性十分重要．但是这一结果还不能说明是Ａ１２－１８螺旋还是Ａ１２－１８肽段对胰岛素的生物活性十分重要．根据Ｃｈｕｏ－Ｆａｓｍａｎ法,在含有Ａｓｎ和Ｐｒｏ的肽段中不能形成…     

重组人胰岛素研究的回顾和展望

胰岛素（ｉｎｓｕｌｉｎ）是由Ａ和Ｂ两条多肽链组成的蛋白质激素,Ａ链含２１个氨基酸残基,Ｂ链由３０个氨基酸残基组成,共有三个二硫键,其中两个连接Ａ链和Ｂ链,一个在Ａ链内。胰岛素是在胰岛的β细胞中被合成和分泌,随血液循环到达靶组织,通过与其专一膜受体结合表现出生理功能的。胰岛素用于临床已有７０多年［１］,由于它是治疗糖尿病的特效药物和糖尿病患者在人口中的比例相当高,所以对胰岛素的需求量很大。这是促使人们不断改进老工艺和采用新的科技成果生产胰岛素的动力。ＤＮＡ重组技术的出现为胰岛素的生产开创了新的途径。第一个重组ＤＮＡ分子［２］报道后不久,Ｕｌｌｒｉｃｈ等［３］,Ｉｔａｋｕｒａ及其同事（１９７８）以及Ｖｉｌ－ｌａ－Ｋｏｍａｒｏｆｆ等（１９７８）就相继报道了胰岛素在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达成功,成为最早在微生物中被表达的哺乳动物蛋白质之一。人胰岛素是第一个被投放市场的生物工程蛋白质药物［４］。十多年来,人们在胰岛素基因的制备,表达体系的选择和改进,表达产物的加工处理等方面进行了卓有成效的探索和研究。不仅实现了人胰岛素在微生物中的生物合成并推向市场,而且推动和加快了其他哺乳动物蛋白质基因工程的研究进程。     

去B链羧端七肽人胰岛素的分离纯化及性质研究

在大肠杆菌温度诱导体系中以非融合方式进行去Ｂ链羧端七肽人胰岛素原基因的表达,获得去Ｂ链羧端七肽人胰岛素原,表达产物占细胞总蛋白量的１３％,表达产物经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０柱层析分离及胰蛋白酶和羧肽酶Ｂ的酶促转化等步骤,可得到纯度达９４％以上的去Ｂ链羧端七肽人胰岛素,其氨基酸组成与预期值相符,受体活性是标准猪胰岛素的１％．     

从基因工程小C肽人胰岛素原类似物（B－R2－A）制备人胰岛素

以融合蛋白的形式,在Ｅ．ｃｏｌｉ中经温度诱导表达了小Ｃ肽人胰岛素原类似物（Ｂ－Ｒ２－Ａ）．表达的融合蛋白可占细胞总蛋白６８％．经磺酸解,及初步分离Ｓ－磺酸型融合蛋白,再经ＣＮＢｒ裂解后,进行还原重组,ＨＰＬＣ分离纯化等步骤,每升发酵液可得到Ｂ－Ｒ２－Ａ约５０ｍｇ。经酶促转化及ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－２５纯化,得重组人胰岛素约２０ｍｇ,其氨基酸组成与人胰岛素相同,并具有与猪胰岛素相同的生物活性．     

用富集文库克隆人胰岛素基因组基因

通过构建可富集人胰岛素基因的λ噬菌体文库,克隆了人胰岛素基因组基因．首先从中国人血液白细胞中提取到人基因组ＤＮＡ,用ＥｃｏＲⅠ和ＢｇｌⅡ对基因组ＤＮＡ进行全酶切,经０．４％琼脂糖凝胶电泳,特异回收９．５ｋｂ左右的ＤＮＡ片段．将该片段与λＥＭＢＬ３／ＢａｍＨⅠ臂连接,构建成一个特殊的人基因组λ噬菌体文库（富集文库）,效价为２×１０４．同时采用ＰＣＲ方法及用引物Ⅰ：５′ＧＧＡＣＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧ３′,引物Ⅱ：５′ＣＴＧＣＧＴＣＴＡＡＴＴＧＣＡＧＴＡＧＴＴＣ３′,从人基因组ＤＮＡ中扩增出一段含胰岛素基因的１．３６ｋｂＤＮＡ片段,做为放射性标记探针,对文库进行了噬菌斑原位杂交筛选,从１×１０４个噬菌斑中筛选到一个含人胰岛素基因组基因的阳性克隆,并进一步完成了亚克隆和该基因１７３２ｂｐＤＮＡ序列的测定．结果该基因的１７３２ｂｐＤＮＡ序列包括部分５′端和３′端与国外发表的人胰岛素α型等位基因的序列相同     

从基因工程小C肽人胰岛素原类似物（B—R2—A）制备人胰岛素

以融合蛋白的形式,在Ｅｃｏｌｉ中经温度诱导表达了小Ｃ肽人胰岛素原来似物（Ｂ－Ｒ２－Ａ）,表达的融合蛋白可占细胞总蛋白６８％。经磺酸解,及初步分离Ｓ－磺酸型融合蛋白,再经ＣＮＢｒ裂解后,进行还原重组,ＨＰＬＣ分离纯化等步骤,每升发酵液可得到Ｂ－Ｒ２－Ａ约５０ｍｇ。经酶促转化及ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ａ２５纯化,得重组人胰岛素约２０ｍｇ,基氨基酸组成与人胰岛素相同,并具有与猪胰岛素相同的生物活性。