偶联基于酮还原酶的NADH再生系统一锅法酶催化合成L-2-氨基丁酸

以廉价易得的L-苏氨酸为原料,利用在大肠杆菌中重组表达的苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶,并偶联基于酮还原酶的NADH再生系统一锅法制备L-2-氨基丁酸。以L-2-氨基丁酸的产率为指标,考察了一锅法酶催化制备L-2-氨基丁酸的最适p H、L-苏氨酸浓度及异丙醇浓度。在最适p H 7.5~8.0,L-苏氨酸浓度50g/L,添加5%的异丙醇及0.5g/L NAD+,分别加入0.6g/L苏氨酸脱氨酶、2g/L亮氨酸脱氢酶及2g/L酮还原酶,反应20h,可实现L-2-氨基丁酸的摩尔产率为99%,产量为43g/L。该结果为L-2-氨基丁酸的制备提供了一种新的思路。     

大肠杆菌全细胞转化联产L-2-氨基丁酸和D-葡萄糖酸

以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主,构建两株分别表达L-苏氨酸脱氨酶(LTD,基因来源大肠杆菌)和共表达亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/葡萄糖脱氢酶(GDH,来源枯草芽孢杆菌)的重组大肠杆菌,在此基础上,构建了一种以L-苏氨酸和D-葡萄糖为底物联产L-2-氨基丁酸(L-ABA)和D-葡萄糖酸的全细胞转化系统。通过转化条件(温度、p H、细胞通透性和菌体量)优化,并采用分批补料策略,164 g/L L-苏氨酸和248 g/L D-葡萄糖最终转化得到141.6 g/L的L-ABA和269.4 g/L的D-葡萄糖酸,时空得率分别达到7.1 g/(L?h)和13.5 g/(L?h),得率超过99%。本研究使用价格低廉的大宗化学品高效率生产出有较高附加值的产物,全细胞转化系统无需额外添加昂贵的辅酶,更适用于工业化生产。     

体外苏氨酸循环固碳途径的构建

乙酰CoA是生物体代谢过程中重要的代谢物,也是许多有价值产品合成的前体物质。然而传统途径中通过丙酮酸脱羧生成乙酰CoA碳得率较低,因此构建一条高效的乙酰CoA合成途径具有重要的意义。由于在体外验证文献报道的高碳摩尔得率合成乙酰CoA的苏氨酸循环固碳途径,有较重要的理论意义和应用价值。因此在体外构建了苏氨酸循环固碳途径合成乙酰CoA,通过分段加酶的方式将其在体外进行了验证。在体外验证时,以丙酮酸为底物,则丝氨酸脱氨酶(Tdc B)为循环途径的最后一步反应。结果表明,当加入途径中除丝氨酸脱氨酶之外的酶时,测得的乙酰CoA浓度约1.5 mmol/L,待反应达到平衡时,加入丝氨酸脱氨酶,丝氨酸转化为丙酮酸,丙酮酸再次进入循环,乙酰CoA的量增加了约0.2 mmol/L,由此得出结论在体外苏氨酸循环实现了固碳。     

三酶级联催化L-苏氨酸生产L-2-氨基丁酸

L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一种重要的化工原材料和手性医药中间体,为了实现L-ABA的高效生产,本研究在大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)中分别表达大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶(Threonine deaminase,TD)、苏云金芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶(Leucine dehydrogenase,LDH)和博伊丁假丝酵母来源的甲酸脱氢酶(Formatedehydrogenase,FDH),构建体外级联酶催化反应实现L-苏氨酸向L-ABA的转化,体系中TD、LDH和FDH添加最适比例为1∶1∶0.2。为了简化生产工艺,将3种酶在一株菌E. coli 3FT+L中共表达并实现上述配比,在30 L发酵罐中用E. coli 3FT+L全细胞转化12 h,L-ABA的产量为68.5 g/L,底物L-苏氨酸的摩尔转化率达到99.0%。该工艺路线绿色高效,为未来大规模生产L-ABA提供借鉴。     

亮氨酸脱氢酶偶联NADH再生体系合成L-2-氨基丁酸

文中以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,构建两株分别共表达亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/甲酸脱氢酶(FDH,来源水生弯杆菌)和亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/醇脱氢酶(ADH,来源红球菌)的重组大肠杆菌。通过偶联两种不同NADH再生体系,以L-苏氨酸为起始原料,利用苏氨酸脱氨酶(L-TD)与LDH-FDH或LDH-ADH一锅法合成L-2-氨基丁酸,并对LDH-FDH工艺和LDH-ADH工艺进行对比优化。LDH-FDH工艺的最适反应pH为7.5,最适反应温度为35℃,通过加入50 g/L甲酸铵、0.3 g/L NAD+、10%LDH-FDH粗酶液(V/V)和7 500 U/L的L-TD酶液,对L-苏氨酸进行分批补加,以便控制2-丁酮酸浓度小于15 g/L,反应28 h,实现了L-2-氨基丁酸的产量为161.8 g/L,产率97%。LDH-ADH工艺的最适pH为8.0,最适反应温度为35℃,通过加入0.3 g/L NAD+、10%LDH-ADH粗酶液(V/V)及7 500 U/L的L-TD酶液,分批补加L-苏氨酸及1.2倍摩尔量异丙醇,以便控制2-丁酮酸浓度小于15g...     

两种羟基氨基酸特异的颜色反应

迄今为止,组成蛋白质的20种氨基酸中,有特定鉴定方法的约10余种,如果20种氨基酸都有其特异颜色反应,将会给蛋白质研究工作带来不可低估的效益。 组成蛋白质的20种基本L-α-氨基酸(L-α-AA)中,只有两种为羟基氨基酸,即丝氨酸和苏氨酸,其结构式如下:     

利用具有低丝氨酸脱水酶活性的嗜甘氨酸棒杆状菌突变株提高 L-丝氨酸产量

<正> 以甘氨酸为前体,利用嗜甘氨酸棒状杆菌发酵法生产 L-丝氨酸中,由于减少了 L-丝氨酸被酶降解,从而提高了 L-丝氨酸产量。细胞内具有降解 L-丝氨酸能力的 L-丝氨酸脱水酶(SD)活性在不能利用 L-丝氨酸作氮源或作为生长需要的氨基酸的突变株里降低。通过遗传育种技术由 AJ-3170(ATCC21341)获得两株营养缺陷型:L-亮氨酸和 L-异亮氨酸缺陷型突变株(AJ-3414)和 L-毫氨酸和蛋氨酸缺陷型突变株(AJ-3413),前者完全缺失 SD 活性,后者 SD 活性仅为亲株的32％。这两株突变株由30mg/ml 甘氨酸作前体的培养基中分别可以累积13.8和13.9mg/ml L-丝氨酸,其生产收率也由亲株的15.3％提高到46％。     

L-丝氨酸检测技术的研究进展

L-丝氨酸作为一种非必需氨基酸,它在药物、化工产品以及食品等方面得到了广泛应用,是一种重要的工业产物,具有很重要的研究价值。快速、准确、高通量的检测L-丝氨酸含量的方法,能够为高通量菌种选育提供坚实的基础。本文介绍了目前检测L-丝氨酸含量的多种方法,包括变色酸-分光光度法、纸层析-分光光度法、荧光猝灭法、茚三酮显色法、高效液相色谱法、酶反应检测法及毛细管电泳-电致化学发光( CE-ECL)法,同时通过比较它们的优缺点,并针对L-丝氨酸检测中存在的各种问题进行讨论分析,对L-丝氨酸的检测技术进行展望。     

水稻抗氨基酸类似物突变体的筛选——Ⅰ.抗S-(2-氨乙基)L-半胱氨酸(AEC)突变体的筛选

以赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)L-半胱氨酸(AEC)为选择剂,从水稻花药培养中筛选出一个抗性突变体(R_(AEC))。突变体愈伤组织经过6个月继代培养后仍保持抗性稳定。R_(AEC)再生植株根尖诱导的愈伤组织经过3个月继代培养也保持稳定的抗性。R_(AEC)细胞内赖氨酸含量提高了近2倍,苏氨酸提高5倍多。其他氨基酸,如蛋氨酸、酪氨酸、丝氨酸等都有较大量的提高。 R_(AEC)愈伤组织对赖氨酸加苏氨酸混合物也具有抗性。突变体植株较原始类型稍矮小,巳正常结实。     

从茧衣中分离制备L-丝氨酸的试验报告

<正> 一前言 L-丝氨酸(L-Serine;L-α氨基-β-羟基丙酸)在我国目前只有少数单位在研制之中,是我国十分紧缺的氨基酸品种之一。 L-丝氨酸有着广泛的用途,它不但可以合成治疗结该病(环丝氨酸)和抗肿瘤(重氮丝氨酸)的药物,而且可作为复方氨基酸大输液的原料之一,参与体内新陈代谢和多种生理机能,对抢救外伤、烧伤和手术前后等造成人体大量出血引起的蛋白质消耗过多的垂危病人,具有特殊的治疗效果。     

LKB1及其生物学功能

LKB1基因是一种保守的抑癌基因,其编码产物LKB1即丝氨酸-苏氨酸激酶11(serine/threonine kinase,STK11)。LKB1与细胞极性调节、男性精子形成、肿瘤及细胞代谢等方面有关。本文阐述了近年来LKB1的最新研究进展。     

两种新型L-苏氨酸醛缩酶的鉴定及活性检测方法

为了实现重要医药中间体p-羟基-α-氨基酸的生物酶法合成,挖掘验证新型的L-苏氨酸醛缩酶.以pET-28a(+)作为表达载体,通过蛋白表达纯化、薄层层析色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)技术分析L-苏氨酸醛缩酶及其催化产物的性质.基于4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三氮唑(Purpald)显色试剂开发检...     

食品上的应用

942407革兰氏阴性专性甲醇营养株糖原甲基杆菌的高丝氨酸脱氢酶基因和苏氨酸合成酶基因的克隆和核苷酸顺序[英]/Motoyama,H.…//Appl.Environ.Microbi01.一1994,60(1).一;111～119E译自DBA,1994,13(7),94—04035] 通过大肠杆菌缺HD突变株的互补作用,由产氨基酸的革兰氏阴性专性甲醇营养株糖原甲基杆菌(Methylobacillus glycogenes)ATCC 21276~IATCC 21371克隆高丝氨酸脱氢酶(HD)基因(horn)和苏氨酸合成酶基因(thr c)。构建了ATCC 21276和ATCC 21371的基因库,大肠杆菌缺HD突变株Gifl02被转化。将转化细胞涂布在含有L一苏氨酸和…     

甘油酸盐酶法合成L-丝氨酸

<正> 用酶法和微生物方法生产L-丝氨酸已有过很多尝试。在使用过的大部分方法中,一般采用甘氨酸、甲醇(或甲醛)作为原材料,通过羟甲基转化酶催化作用生成L-丝氨酸。但是,反应必须非常小心,要让甲醇(或甲醛)一点一点加进去,保持其在反应物中的低浓度。我们曾报导过,传统酶合成方法是以酒     

L-缬氨酸生物合成调节机制的初步研究

比较了钝齿棒状杆菌(Corynebacterium crenatum)AS1.542及其积累缬氨酸的诱变株AS1.1001的L-苏氨酸脱氨酶(TDase)与α-乙酰羟酸合成酶(AHASase)活性,及受各种氨基酸反馈抑制的程度。AS1.1001菌TDase对苏氨酸的K_m值为4.5mM,AHASase对丙酮酸的K_m值为3.4mM。缬氨酸、异白氨酸及丁酮酸对AHASase表现出竞争性抑制,其K_i值依次为0.39、0.52及2.37mM。TDase的Hill系数随苏氨酸浓度增加,从1.2升至3.2。AHASase的Hill系数则为1.2左右。认为TDase活性降低,AHASase活性增加,缬氨酸与异白氨酸的反馈抑制程度减轻,导致了缬氨酸的过量累积。据此初步探讨了缬氨酸生物合成途径及调节机制。     

根据R基因保守区分离小麦R基因类似序列

用根据核苷酸结合位点(nucleotide binding site, NBS)和丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶域设计的2对简并性引物,以小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系的cDNA为模板进行PCR扩增.扩增产物克隆到pGEM-T载体中,经测序,共获得具有NBS结构域特征的片段克隆9个和具有丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶域特征的片段的克隆1个.将克隆之间核苷酸序列同源性高于90%的克隆归为一类,把9个NBS片段分为6类.这6类抗病基因类似序列(resistance gene analogs, RGA)均具有阅读框,并与已克隆的小麦抗条锈病基因Yr10、大麦抗白粉病基因Mla1和Mla6、拟南芥的抗病基因RPS2以及其他一些抗病基因在NBS保守区内具有高度的同源性.用小麦中国春缺体-四体初步将它们分别定位于小麦第一、第二和第五部分同源群上.进一步用5′-RACE技术获得RGA N5的5′-端,发现其编码产物的N端还具有6个亮氨酸拉链(leucine zipper, LZ),与RPS2的N-端有较高同源性.     

腺苷脱氨酶抑制巨噬细胞增殖迁移的作用研究

目的:探讨腺苷脱氨酶对鼠源巨噬细胞RAW264.7增殖、迁移、细胞周期、细胞凋亡的影响.方法:用不同浓度(0、0.25、1.25、2.5、5U/mL)的腺苷脱氨酶处理RAW264.7细胞后,用实时细胞分析系统检测细胞增殖能力,用流式细胞术检测腺苷脱氨酶对细胞凋亡和周期的影响,划痕修复实验检测RAW264.7细胞迁移能力...     

Pgk和ilvN基因对谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的影响

为增加谷氨酸棒杆菌A36的L-丝氨酸合成途径的碳流,首先过表达磷酸甘油酸激酶(pgk),以增加前体物质3-磷酸甘油酸的积累,但经发酵分析发现其对菌株A36的L-丝氨酸产量无显著影响。进一步敲除副产物L-缬氨酸合成途径的乙酰羟酸合酶(AHAS)基因ilvN,敲除该基因后L-缬氨酸只有微量积累,但重组菌并未形成营养缺陷型菌株,L-丝氨酸的产量反而下降,分析发现L-缬氨酸的存在在一定程度上有助于L-丝氨酸的生成。在培养基中分别添加不同质量浓度的L-缬氨酸,在L-缬氨酸添加量为750 mg/L时,重组菌L-丝氨酸产量达到34.19 g/L,糖酸转化率为0.34 g/g,生产强度为0.28 g/(L·h),相比出发菌株A36分别提高了11.8%、13.3%和12.0%。     

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在结核分枝杆菌致病机制中的作用

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STPK)是一类真核细胞样的蛋白激酶,是分枝杆菌生长和代谢的重要调节因子,参与其多种细胞活动(如细胞和菌落形态、葡萄糖和谷氨酰胺转运、吞噬体-溶酶体融合、转录因子活性等)的调节.结核分枝杆菌编码产生11种STPK( PknA、PknB、PknD～PknL),可分为5群(ABL群、HED群、FIJ...     

重组大肠杆菌全细胞催化L-苏氨酸合成2,5-二甲基吡嗪

2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine,2,5-DMP)在食品香料与医药方面具有重要的经济价值,工业上普遍采用环境不友好且反应条件苛刻的化学合成法来生产.文中结合代谢工程和辅因子工程策略设计高效催化L-苏氨酸合成2,5-DMP的全细胞催化剂,实现微生物转化法合成2,5-DMP.本研究首先分析了不同...