人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的构建及表达

构建人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的表达载体,并表达得到该融合蛋白.通过设计强特异性的引物,利用重叠PCR技术,定向定量的拼接得到hPTH(1-34)二联体-HSA融合蛋白的基因;将构建好的融合基因插入表达载体pPIC9K,大量扩增重组质粒,并用Sal I线性化,电击转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷和G418抗性双重筛选得到阳性转化子;挑选阳性转化子进行甲醇诱导表达.测序结果表明得到的重组质粒pPIC9K-hPTH(1-34)二联体-HSA与目标设计完全一致;基因组PCR鉴定结果证明成功构建了hPTH(1-34)二联体-HSA融合基因的毕赤酵母(GS115)表达系统;SDS-PAGE电泳表明融合蛋白获得了表达,尿微量白蛋白试剂盒测定甲醇诱导表达3d后融合蛋白的产量为127 mg/L.     

人甲状旁腺素(1-34)衍生物在大肠杆菌中表达、纯化及其生物学活性

为研究Gly hPTH(1 34)衍生物的生物学活性 ,用重叠PCR方法合成编码hPTH(1 34)的DNA片段 ,克隆到融合表达载体pGEX 2T的缩短型谷胱甘肽转移酶基因GST6 9△的 3′末端 ,构建正确读码框架的融合基因 .在两个基因间引入蛋白质羟胺切割位点序列 ,转入E .coliJM10 9中 ,IPTG诱导表达 .该融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的 2 0 %以上 ,主要以包涵体形式存在 ,盐酸羟胺切割表达产物 .分析表明 ,80 %左右的融合蛋白被裂解为GST6 9△和Gly hPTH(1 34) .经分子筛柱层析和反相层析分离纯化获得重组Gly hPTH(1 34)衍生物 ,纯度达 98%以上 ,回收率约为 10mg/升发酵液 ,分子量为 4 177,等电点 (pI)为 8 4 0 ,N端 16个氨基酸 ,除第一个为甘氨酸外 ,其余与天然hPTH(1 34)序列一致 .Western印迹结果表明 ,Gly hPTH(1 34)衍生物具有hPTH(1 34)的免疫学活性 .体外活性测定结果表明 ,Gly hPTH(1 34)衍生物能刺激人成骨细胞HOSTE85增殖、增加细胞内胶原合成、ALP活性增高和cAMP生成量增加 ,并呈量效关系 ,提示它具有与化学合成的hPTH(1 34)相同的生物学活性 ,N端多一个Gly对其活性无明显影响 .     

(S)-羰基还原酶II于酿酒酵母孢子中表达与功能

摘要:【目的】使近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)的(S) -羰基还原酶II 表达并包埋于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae AN120)孢子中,实现了重组酶高效催化生产(S) -苯基乙二醇的转化过程。【方法】采用PCＲ 扩增技术,从近平滑假丝酵母基因组中克隆(S) -羰基还原酶II 基因,于酿酒酵母AN120中表达,以醋酸钾为唯一碳源诱导培养产生孢子,包埋(S)-羰基还原酶II。以该孢子为生物催化剂,2-羟基苯乙酮为底物进行生物转化反应,经HPLC分析,计算产物的光学纯度和得率。考察了孢子催化转化反应的最适温度和pH值,温度和pH 稳定性以及多批次使用性能。【结果】在最适反应温度40℃和pH6.0条件下,10%(W/V)子囊孢子催化6 g/L 2-羟基苯乙酮,产物(S) -苯基乙二醇的光学纯度和得率均高达99%以上。与重组大肠杆菌相比较,重组孢子合成(S)-苯基乙二醇的得率由89.7% 提高到99.0%,反应时间由48 h缩短为4 h;连续使用10批次后,其催化产物的光学纯度几乎不变,得率保持在85%以上。【结论】该研究首次实现了氧化还原酶在酵母孢子内的异源表达,为手性化合物的高效制备奠定了坚实的研究基础。     

甲状旁腺激素PTH 1-34对成骨细胞的机械应答的影响

目的：探讨PTH对成骨细胞在机械载荷状态下的功能影响。方法：人成骨样细胞株MG63复苏培养,采用163mOsm低渗液作为刺激源,实验分为三组,A组为单纯用DMEM培养基培养;B组为低渗液对成骨细胞分别作用0．5h、2h、4h和6h;C组为低渗处理同期加入hPTH1-34（20ng／L）。检测细胞内钙离子浓度[Ca2＋]、细胞凋亡指数以及增殖活力的变化。所得结果采用单因素方差分析法。结果：随着培养时间延长,[Ca2＋]i升高,以B组升高最为明显,（与A组比较p〈0．05）,A组和C组比较p〉0．05;细胞凋亡指数在B组4h和6h为最高（29．38±0．336;54．87±0.781）,明显高于A组和C组,且与两组相比均p〈0．05,C组4h凋亡率低于A组（p〈0．05）,其它时间组统计学比较p〉0．05。细胞增殖活力随着培养时间增加逐渐增加,与A组和C组同期相比,B组较低,且p〈0.05。结论：过强的低渗牵张作用对细胞有损害作用,[Ca2＋]i降低,凋亡率增加且降低增殖活性;PTH通过维持[Ca2＋]i浓度,对细胞的功能具有保护作用。     

HIV-1 gp160截短蛋白在酿酒酵母中的表达

利用PCR技术从pNL-43上扩增出截短的编码gp160蛋白的基因片断,克隆到酿酒酵母表达载体YEpFLAG-1上构建表达质粒YEp-gp160Δ12,电转化到酿酒酵母中,用缺色氨酸的SC培养基筛选出阳性克隆,重组子经YP培养基诱导后进行全菌蛋白的SDS-PAGE和Western Blotting分析,筛选出高表达菌株.纯化后的重组gp160Δ12(rgp160Δ12)蛋白经ELISA鉴定显示具有良好的生物活性.     

酿酒酵母by1.1b产D-(-)-扁桃酸脱氢酶的发酵条件优化

对一株产D-(-)-扁桃酸对映选择性脱氢酶的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae sp. strain by1.1b)发酵产酶条件进行了优化。研究各种碳源、氮源及无机盐对产酶的影响, 应用正交试验优化发酵培养基组成, 结果为: 蛋白胨 60 g/L, 麦芽糖 30 g/L, MgSO4 0.5 g/L, ZnSO4 0.01 g/L, KCl 1.0 g/L。优化后酶产量提高了7.9倍(由2.56 U/mL增至20.21 U/mL)。摇瓶培养最佳条件为: 装液量40 %, 发酵pH 6.5, 接种量10 %, 发酵温度30 ℃。考察了细胞生长及产酶的时间进程, 最佳培养时间为25 h。     

甲状旁腺激素PTH1—34对成骨细胞的机械应答的影响

目的：探讨PTH对成骨细胞在机械载荷状态下的功能影响。方法：人成骨样细胞株MG63复苏培养,采用163mOsm低渗液作为刺激源,实验分为三组,A组为单纯用DMEM培养基培养;B组为低渗液对成骨细胞分别作用0．5h、2h、4h和6h;C组为低渗处理同期加入hPTH1-34（20ng／L）。检测细胞内钙离子浓度[Ca2＋]、细胞凋亡指数以及增殖活力的变化。所得结果采用单因素方差分析法。结果：随着培养时间延长,[Ca2＋]i升高,以B组升高最为明显,（与A组比较p〈0．05）,A组和C组比较p〉0．05;细胞凋亡指数在B组4h和6h为最高（29．38±0．336;54．87±0.781）,明显高于A组和C组,且与两组相比均p〈0．05,C组4h凋亡率低于A组（p〈0．05）,其它时间组统计学比较p〉0．05。细胞增殖活力随着培养时间增加逐渐增加,与A组和C组同期相比,B组较低,且p〈0.05。结论：过强的低渗牵张作用对细胞有损害作用,[Ca2＋]i降低,凋亡率增加且降低增殖活性;PTH通过维持[Ca2＋]i浓度,对细胞的功能具有保护作用。     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)半乳糖可诱导表达系统特性的研究

把大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因克隆到带有酵母半乳糖可诱导启动子GAL1的穿梭表达质粒pYESZ中,并把得到的重组质粒分别转化到两种不同遗传性状的宿主菌中,其中一株菌为蛋白酶活性缺失90％以上的pep4－3突变菌株。通过比较两株重组菌产生的β-半乳糖苷酶活性水平发现在所述实验条件下,蛋白酶缺失突变菌株中产生的β-卜半乳糖苷酶活水平不仅均要高于另一对照菌株,并且pep4-3突变菌株表现出受葡萄糖阻遏的严紧程度高及对诱导反应迅速等特点。此外,带有重组质粒的pep4－3突变菌株在葡萄糖阻遏培养基中最大生长量和重组对照菌株基本相同,但β-半乳糖苷酶在pep4－3突变菌株中的表达对细胞生长的影响明显小于对照菌株。     

人肺表面活性相关蛋白A1在酿酒酵母中表达、纯化及活性分析

将编码正常人肺表面活性物质相关蛋白A1基因的cDNA克隆至酿酒酵母的分泌表达载体pVT102U/α中,构建了重组质粒pVT102U/α-SP-A1,转化酵母宿主菌S-78,通过改变培养基的pH值水平,经摇瓶培养,SDS-PAGE结果显示,培养上清中SP-A1表达量达400mg/L以上,表达产物分子量为62kD和32kD。分别以二聚体和单体形式出现。ELISA和Western blot实验表明表达产物能被抗体特异性识别。生物学活性检测证实其具有调理肺巨噬细胞吞噬E.coli的功能。     

随机-半理性组合突变改造ω-转氨酶催化合成(R)-1-(1-萘基)乙胺

(R)-1-(1-萘基)乙胺是合成拟钙剂药物盐酸西那卡塞的关键手性中间体,利用ω-转氨酶不对称还原1-萘乙酮合成(R)-1-(1-萘基)乙胺具有较好的应用前景。文中针对节杆菌属Arthrobacter sp.来源的ω-转氨酶,采用随机突变和半理性设计相结合的策略,获得了催化效率和热稳定性提高的突变酶F225M、C281I和F225M/C281I。与WT相比,双突变体F225M/C281I的kcat提高85%,Km下降56%,催化效率kcat/Km提高3.42倍。此外,F225M/C281I催化10mmol/L1-萘乙酮反应24h的转化率提高了22%。分子对接和分子动力学模拟结果表明,F225M/C281I相比于WT增加了与底物1-萘乙酮之间的Pi-Pi相互作用力,导致其催化效率的提高;而且突变酶F225M/C281I的134–139位点残基的均方根波动(RMSF)相比WT明显降低,与半衰期的略微提高相关。     

酿酒酵母by1.1b产D-(-)-扁桃酸脱氢酶的发酵条件优化

对一株产D-(-)-扁桃酸对映选择性脱氢酶的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae sp.strain by1.1b)发酵产酶条件进行了优化.研究各种碳源、氮源及无机盐对产酶的影响,应用正交试验优化发酵培养基组成,结果为:蛋白胨60 g/L,麦芽糖30 g/L,MgSO4 0.5 g/L,ZnSO4 0.01 g/L,KCl 1.0 g/L.优化后酶产量提高了7.9倍(由2.56 U/mL增至20.21 U/mL).摇瓶培养最佳条件为:装液量40%,发酵pH 6.5,接种量10%,发酵温度30℃.考察了细胞生长及产酶的时间进程,最佳培养时间为25 h.     

透明颤菌血红蛋白的表达对酵母中麦角固醇合成的影响

构建了含透明颤菌（Vistreoscilla）血红蛋白基因vgb和酵母遗传霉素（G418）抗性基因的重组质粒pVgbkanMX4,转化至酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1190中,经过分析,基因vgb在酵母细胞中得到表达。对重组菌和野生菌进行了摇瓶培养及5 L发酵罐培养的研究。在摇瓶实验中,重组菌的麦角固醇产量比野生菌有显著提高,在野生菌中的含量为0.573%、而在重组菌中的产量为1.07%。 经过30 h发酵罐培养的实验,野生菌中麦角固醇含量为0.9%,重组菌中其含量为1.38%,验证了摇瓶实验的结果。结果证明vgb基因有利于酵母中麦角固醇的合成。     

TPS1 Terminator Increases mRNA and Protein Yield in a Saccharomyces cerevisiae Expression System

Both terminators and promoters regulate gene expression. In Saccharomyces cerevisiae, the TPS1 terminator (TPS1t), coupled to a gene encoding a fluorescent protein, produced more transgenic mRNA and protein than did similar constructs containing other terminators, such as CYC1t, TDH3t, and PGK1t. This suggests that TPS1t can be used as a general terminator in the development of metabolically engineered yeast in high-yield systems.     

酵母细胞中Pil1的磷酸化与细胞压力抵抗的关系

在外界因素处理下,细胞将启动一系列保护措施以适应各种环境改变,磷酸化调节是蛋白功能调节的主要方式. 为了探讨酵母细胞中Pil1的磷酸化与细胞压力抵抗的关系,实验应用Pil1突变细胞检测在过氧化氢或热处理后细胞的生长情况,用免疫印记法检测热处理后Pil1的表达. 结果表明,相比野生细胞,Pil1突变细胞对抗过氧化氢和热的能力强,热处理后 Pil1的磷酸化水平增高, Pil1的丝氨酸273对于其磷酸化发生至关重要.     

A Role for Saccharomyces cerevisiae Tpa1 Protein in Direct Alkylation Repair

Alkylating agents induce cytotoxic DNA base adducts. In this work, we provide evidence to suggest, for the first time, that Saccharomyces cerevisiae Tpa1 protein is involved in DNA alkylation repair. Little is known about Tpa1 as a repair protein beyond the initial observation from a high-throughput analysis indicating that deletion of TPA1 causes methyl methane sulfonate sensitivity in S. cerevisiae. Using purified Tpa1, we demonstrate that Tpa1 repairs both single- and double-stranded methylated DNA. Tpa1 is a member of the Fe(II) and 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase family, and we show that mutation of the amino acid residues involved in cofactor binding abolishes the Tpa1 DNA repair activity. Deletion of TPA1 along with the base excision repair pathway DNA glycosylase MAG1 renders the tpa1Δmag1Δ double mutant highly susceptible to methylation-induced toxicity. We further demonstrate that the trans-lesion synthesis DNA polymerase Polζ (REV3) plays a key role in tolerating DNA methyl-base lesions and that tpa1Δmag1revΔ3 triple mutant is extremely susceptible to methylation-induced toxicity. Our results indicate a synergism between the base excision repair pathway and direct alkylation repair by Tpa1 in S. cerevisiae. We conclude that Tpa1 is a hitherto unidentified DNA repair protein in yeast and that it plays a crucial role in reverting alkylated DNA base lesions and cytotoxicity.