烟草tga1a基因的表达对外源基因在植物中表达的影响

烟草DNA结合蛋白TGA1a可特异地作用于CaMV35S增强子的激活序列as-1(-83~-63), 并表现为转录激活功能. 为了研究tga1a基因的表达对外源基因在植物中表达的影响, 将它置于维管束特异性启动子rolC下游, 并与CaMV35S启动子控制的报道基因串联成一种反式调控系统, 构建了植物表达载体, 同时, 以CaMV35S和rolC分别控制的报道基因构建植物表达载体为阳性对照. 通过农杆菌介导方法转化烟草和分子鉴定, 证明报道基因存在于转化烟草基因组中, 分别测定了不同转基因单株的GUS活性, 结果表明: rolC控制下的tga1a的表达显著增强了CaMV35S控制下的报道基因表达, 其GUS活性明显高于CaMV35S或rolC单独调控报道基因的转化植株, 单株的最高GUS活性达到两个阳性对照的10倍以上. 组织化学定位证实该串联系统使GUS蛋白主要集中在维管束组织. 这一研究结果为提高外源基因在转基因植株中的表达水平和外源基因的组织特异性表达创立了一个新模式.     

油菜质膜水孔蛋白BnPIP1基因启动子区的克隆及初步的功能分析

利用双链接头介导PCR的染色体步行技术, 克隆了油菜质膜水孔蛋白BnPIP1基因上游1.6 kb的调控区域(GenBank登录号为AF472487). 序列分析表明, 该片段中含有种子萌发特异性序列及维管束特异性序列. 将其全长片段及5′端不同长度的缺失片段与gus(uidA)基因连接构建植物表达载体, 转化烟草. GUS组织化学染色表明, 全长1.6 kb片段具有较强的启动子活性. GUS染色主要分布在细胞迅速增生的部位及维管束组织中. 启动子缺失试验的GUS染色结果表明, -1610~-1030 bp区段的缺失使gus基因的表达明显变弱, 推测该区段含有启动子的正调控元件; -1030~-902 bp可能存在强烈抑制基因表达的负调控元件; -902~-19 bp的片段亦可驱动gus基因的高水平表达.     

NAC1上游调控区表达特征及其与侧根激素诱导的关系

从拟南芥(Arabidopsis thaliana）中克隆到与侧根原基发生相关的转录因子基因NAC1上游调控区序列,构建由该序列驱动β-葡聚糖苷酶基因(GUS)的植物表达载体并转化烟草(Nicotiana Tabaccum),经筛选获得了在根组织高GUS活性而地上部痕量表达的转基因烟草植株。对转基因植株进行GUS活性和染色分析,结果表明NAC1上游调控区驱动的GUS基因表达具有根部组织特异性,在侧根顶端分生组织区、侧根原基基部和幼嫩侧根基部表达。用IBA,GA₃,GA₄₊₇处理转基因植株根部,NAC1上游调控区驱动的GUS表达均增强,表明生长素、赤霉素可显著诱导NAC1上游调控区的表达,并参与侧根发生的调控。     

甘蓝型油菜BcNA1基因启动子在转基因烟草中对GUS基因表达的调控

通过PCR扩增,从甘蓝型油菜（Brassica napus)品种H165中克隆了种子贮藏蛋白基因BcNAl的启动子,将此启动子与GUS基因相连构建了植物表达载体,利用农杆菌介导法将其导入烟草,对转基因烟划GUS基因检测分析表明,BcNAl基因启动子能特异地启动GUS基因在种子中的表达;而且GUS酶的活性随着转基因烟草种子的发育而变化。同时还间接证明BcNA1基因的启动子在转基因烟草中的遗传传递方式符合盂德尔遗传定律。     

一个光合组织特异表达强启动子的分离及功能分析

用接头PCR技术克隆了长度为1415 bp的PNZIP基因启动子, 该启动子具有真核生物启动子的典型特征, 引物延伸实验证明转录起始位点位于翻译起始位点上游122 bp处. 根据PNZIP基因启动子的序列特征, 利用PCR技术对该启动子进行了有目的的缺失, 将5个长度不同的启动子片段分别与报告基因GUS相连接, 构建植物表达载体, 转化烟草. 荧光定量检测结果表明: 5个不同长度的PNZIP启动子均能驱动GUS基因在光合组织中专一表达, 它们的活性随着启动子5′端的逐步缺失而不断地下降; 在叶片组织中长度为1415 bp的PNZIP启动子活性比35S启动子高9倍; PNZIP启动子中存在2个可能与光合组织特异表达有关的新的顺式作用元件, 即GAAATA和GATACT, GATACT元件可能决定基因的光合组织特异性表达, 而GAAATA可能作为增强子提高基因在光合组织的表达强度.     

玉米淀粉分支酶基因启动子的克隆与功能分析

以玉米品种“吉糯1号”的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到玉米淀粉分支酶基因的启动子序列,克隆到pMD18-TVector上,经测序,该启动子大小为934bp。与已报道的序列比较仅有14个核苷酸发生改变,同源性为98.5%。用该启动子取代植物表达载体pBI121的35S启动子,与GUS基因编码区连接,构建成融合质粒pSBE-GUS。经农杆菌介导法转化烟草,获得了转基因植株。GUS活性检测结果表明,由该启动子序列引导的GUS基因能在种子中表达,而在其他组织中表达微弱或未表达,证实该启动子具有种子特异性表达的功能。     

棉花半乳糖苷酶基因启动子的分离及其在转基因烟草中的表达

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, EC 3.2.1.23)由植物中广泛分布的一类糖基水解酶组成, 被认为与细胞壁多糖的代谢相关. 棉花(Gossypium hirsutum) β-半乳糖苷酶基因已被成功分离, 被命名为GhGal1. RNA杂交实验显示该基因在棉花纤维发育的伸长期优势表达. 为了分析GhGal1基因的时空表达调控, 本研究构建了GhGal1启动子区域(1770 bp)与β-葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase, GUS)基因融合的双元载体, 通过农杆菌转化烟草植株. 对转基因植株分析的结果表明: 此转基因果实中的GUS活性比阴性和阳性对照的活性高. GUS组织定位分析表明: β-半乳糖苷酶基因能在根组织的分生区、子叶、维管束组织、果实和表皮毛中表达. 此外, 调控区域的序列分析揭示该序列含有一些果实/种子特异表达以及与表皮毛表达相关的保守元件. 这些结果显示了GhGal1启动子在转基因烟草植株中的时空表达特征, 并提供了GhGal1基因参与棉花纤维发育的一些重要线索.     

转双抗虫基因烟草的研究

用改造的雪花莲凝集素基因GNAmm与合成的苏云金芽孢杆菌(Bt)毒蛋白cry1Ac基因构建了带有双价基因的植物表达载体,在该表达载体中这两个基因的转录分别受笋瓜PP2启动子(SPP2P)和CaMV 35S启动子的调控。通过根癌土壤杆菌介导转化法,获得了一批抗卡那霉素的转化再生烟草植株。PCR检测及基因组DNA Southern blot\,Slot blot杂交分析的结果表明Gna基因和Bt基因已整合到烟草总DNA中。用Bt毒蛋白抗血清进行Western blot分析,转基因植株均有Bt杀虫蛋白的不同程度的表达。对转化再生烟草的虫试结果表明,在所受试的19株烟草中60%的植株上的棉铃虫在5天内死亡率达到100%,而且存活幼虫的生长发育受到明显抑制;蚜虫抑制生长试验表明,多数转化再生植株具有较强的抗蚜活性,平均能够抑制桃蚜50%～60%的蚜口密度,有的高达80%以上。以上结果表明利用这两个改造过的抗虫基因可以获得既抗虫又耐蚜的转双抗虫转基因植物。     

水稻EPSP合酶第一内含子增强外源基因的表达

分离并克隆了水稻5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因的第一内含子(EPI). 序列分析表明, EPI长704 bp, GC含量为36.2%. 为进一步研究EPI序列在转基因植物中对外源基因表达水平的影响, 将EPI序列插入CaMV35S启动子和报导基因β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase, GUS)基因(gus)之间. 采用基因枪法转化烟草叶片, gus基因瞬时表达表明, EPI序列的存在可以使GUS的表达水平提高. 利用农杆菌法转化烟草, 获得了gus基因稳定表达的植株. GUS活性检测表明EPI内含子的存在可以显著提高GUS基因的表达(P<0.01). Northern blot 分析表明, 在转录水平上gus基因在含EPI内含子的转基因植株中的表达高于不含EPI gus基因的表达, 并且成熟的gus mRNA中EPI被正确剪取掉了, 表明是一种非转译的内含子. GUS定量检测表明, EPI存在可以使GUS的平均表达水平提高3倍, 最高单株可提高6倍.     

玉米醇溶贮藏蛋白基因启动子PCR扩增及其驱动GUS基因在转基因烟…

以玉米黄化苗为材料,利用ＰＣＲ技术扩增了玉米１９ｋＤａ醇溶贮藏蛋白基因（ｚｅｉｎ）起始密码子上游启动子片段,序列分析结果表明,克隆的－１￣－６９４片段具有１９ｋＤａ Ｚｅｉｎ启动子特点,与同一家族中其它基因的对应区段同源性达９０％以上。将启动子插入ｐＰＫＧＴ的ＧＵＳ基因及ＮＯＳ终止子上游构成表达载体。经农杆菌转化烟草,得到了转化植株。转化的烟草的ＰＣＲ扩增及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明目的片段已整合到     

Isolation and characterization of <Emphasis Type="Italic">Brittle2</Emphasis> promoter from <Emphasis Type="Italic">Zea Mays</Emphasis> and its comparison with <Emphasis Type="Italic">Ze19</Emphasis> promoter in transgenic tobacco plants

ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) represents a key regulatory step in starch synthesis. A 0.9 kb of 5′ flanking region preceding Brittle2 gene, encoding the small subunit of maize endosperm AGPase, was cloned from maize genome and its expression pattern was studied via the expression of β-glucuronidase (GUS) gene in transgenic tobacco. Analysis of GUS activities showed that the 0.9 kb fragment flanking Brittle2 gene was sufficient for driving the seed-preferred expression of the reporter gene. The activity of the 0.9 kb 5′ flanking fragment was compared with that of the tandem promoter region from a zein gene (zE19, encoding a maize 19 kDa zein protein). The results indicated that both promoters were seed-preferred in a dicotyledonous system as tobacco and the activity of zE19 promoter was three to fourfold higher than that of the 0.9 kb fragment flanking Brittle2 gene in transgenic tobacco seeds. At the same time, zE19-driven GUS gene expressed earlier than Brittle2 promoter during seed development. Histochemical location of GUS activity indicated that both promoters showed high expression in embryos, which is different from similar promoters tested in maize.     

甘蓝型油菜BcNA1基因启动子在转基因烟草中对GUS基因表达的调控

通过PCR扩增,从甘蓝型油菜（Brassica     

棉纤维蔗糖合酶基因SS3上游调控序列的克隆及其表达分析

棉纤维蔗糖合酶基因SS3在棉纤维发育过程中起着重要作用.采用YADE技术克隆了该基因5′上游1717bp的调控区,该调控区含有典型的启动子核心元件TATA box ,以及TATC box、G box、GCN4 -motif、Prolamin box、Skn 1 likemotif、TCA element、HSE和O2 site等各种顺式调控元件和其他一些反应元件.将此序列和报告基因GUS融合在烟草、棉花中表达.组织化学分析结果显示棉花SuSyR序列启动GUS基因在烟草的子房、胎座、种子以及在棉花花蕾与棉铃中表达.在棉花花蕾蕾长为3mm、6mm、9mm和15mm花蕾中表达主要存在于雄蕊及雄蕊管、胎座等器官;在棉铃中,1DPA棉铃的花柱、花药、子房及胚珠中出现了蓝色,6DPA棉铃的子房及胚珠被染成蓝色,在2 0DPA的棉铃中蓝色只出现在胚珠及其纤维中、在胚珠中只有珠心被染成蓝色,在4 0DPA胚珠中只有纤维呈蓝色.研究结果揭示,棉花的SuSyR调控序列启动GUS基因主要在子房、胚珠和纤维等器官和主叶脉、茎微管束等输导组织中表达,在棉花中尤为明显,表明棉纤维蔗糖合酶基因SS3除参与棉花蕾铃发育、纤维素的合成外,还参与了光合产物的运输与分配过程.     

玉米19kD醇溶贮藏蛋白基因启动子种子特异性表达控制区段的分析

为研究玉米（Ｚｅａｍａｙｓ　Ｌ．）１９ｋＤ醇溶贮藏蛋白（ｚｅｉｎ）基因启动子种子特异性表达的控制区段,将全长６９４ｂｐ的启动子进行５’端缺失,共得到６个缺失突变体,长度分别为４８８ｂｐ、３７８ｂｐ、３０２ｂｐ、１５２ｂｐ、１２４ｂｐ和８５ｂｐ。将６个片段分别与报告基因ｇｕｓ连接构建成表达载体ｐＤＧＢ系列,经土壤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介导转化,引入烟草。ＧＵＳ活性检测证明,４８８ｂｐ启动子片段能促使ｇｕｓ基因在种子中特异表达。３７８ｂｐ、３０２ｂｐ、１５２ｂｐ和１２４ｂｐ片段启动子引导的ｇｕｓ基因在烟草根、叶柄、种子中均可表达。     

水稻谷蛋白GluA-2基因5′上游序列控制下的UidA基因在转基因水稻胚乳中的表达模式

为了研究谷蛋白胚乳特异性表达启动子在我国栽培稻品种中的表达模式,将UidA基因分别置于水稻谷蛋白GluA—2基因750bp和2．3kb上游序列下游,利用农杆菌转化法导人栽培稻品种中花8号并获得转基因植株。Southern blot检测表明,UidA基因已经整合到水稻基因组当中并以单拷贝存在。Northern blot检测表明,开花后13～15d和11～13d,UidA基因和水稻内源的GluA—2基因的表达量分别达到最高,随后逐渐降低。对转基因植株种子的GUS染色表明,UidA基因仅在胚乳中表达,在糊粉层中GUS表达量最高。测定了2．3kb和750bp转基因植株种子的GUS活性,结果表明前者的GUS活性是后者的2～3倍。序列分析表明,位于GluA—2基因转录启始位点上游2170bD的G-box可能是一个与表达量相关的顺式调控元件。     

Analysis of the Maize 19 kD Zein Gene Promoter Fragment Driving Seed specific Expression

A deletion works of a maize 19 kD zein gene promoter in the 5'end was performed and six promoter fragments of different length were obtained. A series of expression vectors was constructed and then transferred into tobacco ( Nicotiarta tabacum L. ) plants. GUS activity assays indicated that the expression of 488 bp promoter was tissue-specific, for which GUS was active only in transgenic tobacco seeds. The other four fragments containing 378 bp,302 bp,152 bp and 124 bp also have the activity of promoter. They could drive gus gene expressed not only in seeds but also in roots and petioles.