大肠杆菌及其L型β—葡萄糖醛酸酶活性测定

本文用改良的Ｆｉｓｈｍａｎ法对胆石症、胆系感染者的胆汁标本中分离出的２０株大肠杆菌及其Ｌ型进行β－葡萄糖酸酶活性测定。     

原发性胆管色素结石患者胆汁中大肠杆菌优势血清型的分析及各亚型产生的β-葡萄糖醛酸酶活性比较

摘要 目的：对原发性胆管色素结石患者的胆管胆汁中大肠杆菌的各个亚型产生的β-葡萄糖醛酸酶活性进行对比,进而探究导致色素结石形成的大肠杆菌优势血清型。方法：选取原发性胆管色素结石患者70例,术中无菌条件下抽取胆管胆汁行细菌培养,进行菌种鉴定及药敏试验。采用玻片凝集法鉴定胆汁中培养出的大肠杆菌的血清型,根据β-葡萄糖醛酸酶的活性与β-葡萄糖醛酸酶同底物4-硝基苯-β-D-葡萄糖苷（PNPG）反应的速率k呈正比,与反应体系的OD₆₀₀值成反比,计算大肠杆菌各亚型产生的β-葡萄糖醛酸酶活性。结果：共获得胆管胆汁标本70例,61例细菌培养阳性,阳性率为87.14%。共获得菌株73株,培养结果排名第1为大肠杆菌（34.25%）,药敏试验敏感度前5位的药物分别为阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、培南类、替加环素、头孢哌酮/舒巴坦,耐药率前5位的药物分别是四环素、左氧氟沙星、氨苄西林、氯霉素、复方新诺明。对培养出的25株大肠杆菌进行血清型鉴定,共获得13种大肠杆菌血清型,位列前3位分别为O₃₀、O₂₄、O₇₉,而O₂₄血清型大肠杆菌其时间-吸光度值曲线斜率k值明显高于其它血清型,结合其OD₆₀₀值,可得出其产生β-葡萄糖醛酸酶的活性较高。结论：原发性胆管色素结石的患者胆管胆汁中最常见细菌为大肠杆菌,血清型以O₃₀、O₂₄、O₇₉为主,其中O₂₄型血清型大肠杆菌产生β-葡萄糖醛酸酶的活性较高。     

胆汁β-葡萄糖醛酸苷酶的性质及其计算荧光法

 胆汁经Sephadex G-25分子筛层析和DEAE-纤维素吸附处理,除去其中直接胆红素及胆汁酸盐,然后对其中的β-葡萄糖醛酸苷酶(GUSB)的性质进行了详细研究:该酶的最适温度为56℃;最适pH为4.5;以4mu Gr为底物测得Km为0.68mmol/L;直接胆红素是其竞争性抑制剂,其k_i=2.04×10~(-3)mmol/L;PI_1=6.0—6.2,PI_2=7.2—7.4,MW=280kD。根据竞争性抑制的米氏方程式设计建立了一个在直接胆红素并存的条件下,定量测定胆汁GUSB的计算荧光法,准确性为97.97±1.79％,重复性CV=1.2％,测定时间大大缩短。利用本法在pH4.5和7.0条件下测定了20例胆红素胆结石和17例胆固醇胆结石患者的胆汁GUSB的真实活性。结果指出:不论在pH4.5或7.0条件下,前组活性均显著高于后组(P<0.01)。证明胆汁中高GUSB活性与胆红素胆结石的形成有密切关系。     

血清β—葡萄糖醛酸酶测定的早期肝癌诊断的意义

研究血清β－葡萄糖醛酸酶（β－G）活性测定对早期肝癌的临床意义。用ELISA技术,测定早期肝癌患血清β－G活性,并对早期肝癌患治疗前、后血清β－G活性变化进行检测。结果表明早期肝癌患血清β－G活性明显高于对照组,（P＜0.01）。早期肝癌患经手术切除或介入治疗后,血清β－G活性明显降低,（P＜0.05）。结果显示血清β－G检测对早期肝癌的诊断、治疗的判断均有一定的意义。     

血清β-葡萄糖醛酸酶测定在早期肝癌诊断的意义

研究血清 β-葡萄糖醛酸酶 (β- G)活性测定对早期肝癌的临床意义。用 EL ISA技术 ,测定早期肝癌患者血清 β- G活性 ,并对早期肝癌患者治疗前、后血清 β- G活性变化进行检测。结果表明早期肝癌患者血清 β- G活性明显高于对照组 ,(P<0 .0 1)。早期肝癌患者经手术切除或介入治疗后 ,血清 β- G活性明显降低 ,(P<0 .0 5 )。结果显示血清 β- G检测对早期肝癌的诊断、治疗的判断均有一定的意义。     

肝细胞与肝癌细胞内β-葡萄糖醛酸酶免疫电镜比较研究

β－葡萄糖醛酸酶（β－Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ,简称β－Ｇ）在正常人体组织匀浆和体液中含量很低,在人体细胞中β－Ｇ超微结构定位尚未见报道。采用低温包埋,胶体金标记、免疫电镜技术,进行了人体肝细胞和肝癌细胞内β－Ｇ的定位。实验结果表明,β－Ｇ定位于内质网,同时观察到肝癌细胞中标记β－Ｇ的金颗粒数目明显多于肝细胞中金颗粒数目。这一结果可能对肝癌的期发现,早期诊断提供一种新方法     

极耐热性β-葡萄糖醛酸酶的高效表达和酶学性质及其应用

从海栖热袍菌克隆出编码热稳定性β-葡萄糖醛酸酶基因,以热激载体pHsh为表达质粒,在大肠杆菌中得到高效表达。基因表达产物通过一步热处理后,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶酶学性质研究表明,β-葡萄糖醛酸酶的最适反应温度为80℃,最适反应pH为5．0,pH5．8～8．2之间酶的稳定性较好,80℃的半衰期为2h,SDS—PAGE结果显示分子量为65.9kD,与理论推算值相吻合。以对硝基苯-β-葡萄糖醛酸苷（pN/PG）为底物时,其动力学参数Km值0.18mmol／L,Vmax值为312u／mg。初步的应用分析表明,该重组酶能催化甘草酸转化为甘草次酸。     

通过葡萄糖醛酸酶-半乳糖苷酶-色氨酸酶(GGT)试验快速检定大肠杆菌的

本文报告用纸片法检查376株细菌产生葡萄糖醛酸酶、半乳糖苷酶和色氨酸酶的能力(GTT试验),97%的大肠杆菌,47.4%的志贺氏菌,41.1%的沙门氏菌能产生葡萄糖醛酸酶。肠杆菌科的其它细菌,包括枸橼酸杆菌,产气肠杆菌,阴沟肠杆菌,蜂窝哈夫尼亚菌,肺炎克雷伯氏菌,爱德华氏菌,沙雷氏菌属,变形杆菌,摩根氏菌属,司徒氏普鲁菲登斯菌(一株例外),雷极氏普鲁菲登斯菌和小肠结肠炎耶氏菌均不产生葡萄糖醛酸酶,假单胞菌属中的绿脓杆菌、粪产碱杆菌以及弧菌科的类志贺邻单胞菌也为阴性。132株大肠杆菌中,90.9%的菌株,其     

重组β-葡萄糖醛酸苷酶键选择性的半理性改造

为了提高Escherichia coli重组表达的β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E)的键选择性,本研究以PGUS-E结构与功能关系的推测为指导,选择了可能影响PGUS-E的键选择性的R329、T369、N467位点进行定点饱和突变,利用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)对键选择进行筛选,得到优势突变酶R329K、T369V。结果显示:与PGUS-E酶相比,突变酶R329K、T369V键选择性分别提高26.9%、34.3%。突变酶的酶学性质研究表明,突变酶的最适p H和温度与PGUS-E一致,但其酶催化效率下降。由此可见,R329、T369对酶催化的键选择性和酶的活性有显著影响。综上结果,本文应用饱和突变方法改善了PGUS-E的键选择性,为酶的结构和功能关系理解提供了实验依据。     

人肝细胞内β-葡萄糖醛酸酶定位定量研究

本实验采用抗β┐葡萄糖醛酸酶（β┐Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ,简称β┐Ｇ）抗体及胶体金探针技术对人肝细胞超微细胞内β┐Ｇ进行定位及定量研究,结果表明,β┐Ｇ定位于肝细胞中的溶酶体和内质网,并且在溶酶体内分布的量较多,与内质网中分布的量相比有显著性差异（Ｐ＜０．０１）,因此溶酶体可做为研究β┐Ｇ与肝细胞病变关系在细胞超微结构水平的形态学研究的模型     

大肠癌细胞分泌的β—葡萄糖醛酸苷酶与其侵袭力关系的研究

以Fischman法检测了6种培养的人大肠癌细胞系分泌至培养液的β-葡萄糖醛酸苷酶活力。结果显示高侵袭力细胞系分泌的该酶活力显著高于低侵袭力细胞系,提示培养的人大肠癌细胞分泌的β-葡萄糖醛酸苷酶水平可作为判断其侵袭力高低的有用指标。     

膀胱移行细胞和移行细胞癌细胞内β-葡萄糖醛酸酶免疫电镜比较研究

β－葡萄糖醛酸酶（β－Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ,简称β－Ｇ）在正常人体组织匀浆和体液中含量很低,本实验采用胶体金标记,免疫电镜技术,进行了人体正常移行细胞与移行细胞癌细胞内β－Ｇ定位研究,实验结果表明,β－Ｇ存在于移行细胞和移行细胞癌细胞中的内质网、溶酶体内,同时观察到癌细胞中标记β－Ｇ的金颗粒数量多于正常移行细胞中金颗粒的数量,本实验结果可能对于移行细胞癌的早期发现、早期诊断提供了新的依据。     

产紫青霉中β-葡萄糖醛酸苷酶的诱导表达

针对产紫青霉(Penicillium purpurogenum)Li-3发酵生产β-葡萄糖醛酸苷酶存在的碳代谢阻遏现象,研究β-葡萄糖醛酸苷酶的高效诱导表达策略。在发酵条件优化的基础上,建立了新的产酶诱导工艺:葡萄糖的初始质量浓度5 g/L,在葡萄糖耗尽时加入20%诱导剂(10 g/L GL+1.2%Tween80)进行诱导,每24 h添加1次诱导剂,诱导72 h后立即转到40℃摇床发酵48 h。采用该工艺进行发酵,菌体出现了"二次生长"现象,比酶活从647.99 U/mL提高至2 356 U/mL,提高了近3倍。     

基于膨润土的层柱黏土固定β-葡萄糖醛酸苷酶的研究

以膨润土制备的层柱黏土为载体,考察给酶量、固定化pH、温度和时间对固定化β-葡萄糖醛酸苷酶活性的影响,并对其操作稳定性进行研究。结果表明：给酶量为2700U／g,最适pH为3．6,固定化温度40℃,固定化60min条件下固定化酶催化活性较高;酶经固定化后其热稳定性及储存稳定性显著提高。     

大肠杆菌L型生物学特性及致病性的研究

我们对人工诱导的大肠杆菌L型从生物学特性、致病性以及耐药性R质粒传递等方面进行了初步的研究。结果表明:L型菌从菌体形态、菌落特征、生化反应等方面与原型菌有较大差别;原型大肠杆菌和相应的L型菌接合试验均阳性,但后者接合频率较前者明显低;将L型菌经膀胱和尾静脉感染小鼠,引起实验鼠脏器的间质性炎症,通过病理学和细菌学检查证明,L型菌可直接引起脏器感染,并非只有返祖后才能致病。     

口服三邻甲苯基磷酸酯对成年母鸡卵壳腺ATP酶及血清β—葡萄糖醛酸酶活性影响

本研究测定了成年来航母鸡口服ＴＯＣＰ（７５０ｍｇ／ｋｇ）引起的迟发性神经毒性、卵壳腺钙ＡＴＰ酶及钙镁ＡＴＰ酶的活性。在为期１０天的试验中,染毒鸡在给药后的第８～１０天出现迟发性神经毒性症状：表现为轻度步态失调,而对照鸡则自始至终未见有此类症状表现。染毒后７～１０天取样,试验鸡的卵壳腺钙ＡＴＰ酶及钙镁ＡＴＰ酶活性与对照相比无明显变化（Ｐ＞００５）,血清β葡萄糖醛酸酶活性两组间亦无明显差异（Ｐ＞００５）,以上结果表明,虽然ＴＯＣＰ可诱导成年母鸡产生迟发性神经毒性,并影响其产蛋性能,导致产包括软壳蛋在内的异常蛋,但其发生机理可能与卵壳腺的钙ＡＴＰ酶活性无直接关联,至少在接触药物７～１０天范围尚监测不到药物对卵壳腺钙ＡＴＰ酶及钙镁ＡＴＰ酶活性的影响。此外,在上述取样时间点,亦未见有血清β葡萄糖醛酸酶活性的改变,提示ＯＰＩＤＰ的发生机制不涉及β葡萄糖醛酸酶。     

口服三邻甲苯基磷酸酯对成年母鸡卵壳腺ATP酶及血清β—葡萄糖醛酸酶 …

本研究测定了成年来航母鸡口服ＴＯＣＰ（７５０ｍｇ／ｋｇ）引起的迟发性神经毒性,卵壳腺钙ＡＴＰ酶及钙镁ＡＴＰ酶的活性。在为期１０天的试验中,染毒鸡在给药后的第８－１０天出现迟发性神经毒性症状：表现为轻度步态失调,而对照鸡自至至终未见有此类症状表现。     

基于双酶偶联法合成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的研究

尿苷二磷酸（uridine diphosphate,UDP）-葡萄糖醛酸是细胞内重要的糖基供体,参与多种代谢途径,也是体外进行糖基化反应的重要糖基供体,但其价格昂贵、工艺复杂,限制了其大量使用,无法满足生产需求。基于此,利用双酶偶联法氧化UDP-葡萄糖生成UDP-葡萄糖醛酸,并研究反应产物的合成情况。以UDP-葡萄糖为底物、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）为辅因子,利用化脓性链球菌Streptococcus pyogenes源的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶（UDP-glucose dehydrogenase,UGD）、猪源的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）,双酶偶联催化合成UDP-葡萄糖醛酸,并通过高效液相色谱、质谱及核磁共振氢谱对反应产物进行检测,确定产物的结构及产物的生成量。结果表明,利用双酶偶联法氧化UDP-葡萄糖所得到的产物为UDP-葡萄糖醛酸。在UGD的作用下,氧化UDP-葡萄糖生成UDP-葡萄糖醛酸,同时辅因子NAD+在LDH的作用下实现循环再生,减少高能产物辅酶还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide,NADH）对反应的反馈抑制作用,产物的生成率约为60.17%。研究提高了产物UDP-葡萄糖醛酸产物生成量,为后续工业化制备提供了新思路。     

极耐热性b-葡萄糖醛酸酶的高效表达和酶学性质及其 应用

从海栖热袍菌克隆出编码热稳定性b-葡萄糖醛酸酶基因, 以热激载体pHsh为表达质粒, 在大肠杆菌中得到高效表达。基因表达产物通过一步热处理后, 酶纯度达电泳均一。纯化重组酶酶学性质研究表明, b-葡萄糖醛酸酶的最适反应温度为80oC, 最适反应pH为5.0, pH 5.8~ 8.2之间酶的稳定性较好, 80oC的半衰期为2 h, SDS-PAGE结果显示分子量为65.9 kD, 与理论推算值相吻合。以对硝基苯-b-葡萄糖醛酸苷(pNPG)为底物时, 其动力学参数Km值0.18 mmol/L, Vmax值为312 u/mg。初步的应用分析表明, 该重组酶能催化甘草酸转化为甘草次酸。     

利用大肠杆菌表达系统进行葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G－6－PD）的生化鉴定

利用大肠杆菌表达系统进行葡萄糖－６－磷酸脱氢酶（Ｇ－６－ＰＤ）的生化鉴定卢义钦（湖南医科大学生化教研室,长沙４１００７８）关键词葡萄糖－６－磷酸脱氢酶（Ｇ－６－ＰＤ）,大肠杆菌,表达葡萄糖－６－磷酸脱氢酶（Ｇ６ＰＤ）缺乏症在各民族人群中均有发现,据估...