滇龙胆GrSLS1基因的克隆与原核表达

以滇龙胆转录组为基础,采用RT-PCR技术克隆了滇龙胆幼叶裂环番木鳖苷合酶基因,命名为GrSLS1(GenBank登录号KF941191)。序列分析结果显示,GrSLS1基因开放阅读框长1 560bp,编码519个氨基酸;GrSLS1蛋白相对分子量为59.33kD,pI为8.96。生物信息学分析结果表明,GrSLS1蛋白属于SLS家族成员,其N端含有一跨膜螺旋区域(10~32);二级结构分析结果表明,GrSLS1蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲组成;系统发育分析表明,GrSLS1与帽柱木MsSLS2蛋白亲缘关系最近。构建原核表达载体pGEX-4T-GrSLS1,对GrSLS1基因进行原核表达,SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。该研究为进一步研究GrSLS1基因功能及通过在龙胆中过表达该基因提高龙胆苦苷含量奠定基础。     

羧肽酶A1全酶及其活性中心基因的克隆及原核表达

通过RT-PCR方法扩增出CPA1全酶及活性中心基因,分别克隆入载体pGEM-T easy,测序分析。将两段目的基因亚克隆于表达载体pGEX—IT-1,测序证实序列插入正确后转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组蛋白。结果表明,成功克隆了人CPA1全酶及其活性中心基因并得到了原核表达产物,为进一步分析比较CPA1全酶及其活性中心的特性、了解CPA1结构与功能的关系并最终得到CPA1最小活性结构域奠定基础。     

独一味苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

以独一味叶片为材料,采用RT-PCR和RACE方法克隆了独一味苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）的全长cDNA,命名为LrPAL基因。测序结果表明,LrPA L基因全长2 298 bp,含有1个2 145 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码714个氨基酸。蛋白序列分析表明,其包含典型的PAL活性中心序列（GTITASGDLVPLSYIA）,与其他植物的PAL蛋白有很高的同源性。系统进化树分析表明,独一味LrPAL与唇形科植物的PAL蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。用 Real-Time PCR方法检测发现,LrPAL基因在独一味的叶中表达量最高,茎中表达量最少。研究结果推测,从独一味中克隆获得的苯丙氨酸解氨酶基因（LrPAL）是典型的PAL家族成员,在独一味各组织发育过程中具有重要功能。     

蓖麻RcTUBβ1基因的克隆和原核表达

微管蛋白基因(Tubulin)具有高度的保守性,常作为目标基因相对表达量研究时的内参基因.本研究旨在通过构建蓖麻(Ricinus communis L.)RcTUBβ1基因的原核表达载体pET32a(+)-RcTUBβ1并优化表达工艺以表达融合蛋白His-RcTUBβ1.以蓖麻雌花为材料,通过RT-PCR技术,扩增得到含酶切位点BamHⅠ和Xho Ⅰ 的 RcTUBβ1 基因(GenBank Accession number:XM_002509734.3)的ORF 序列,经双酶切构建原核表达载体pET32a(+)-RcTUBβ1,将pET32a(+)-RRcTUBβ1转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中诱导表达,并考察诱导时间、诱导温度、诱导IPTG浓度对表达的影响.结果表明,所获得的蓖麻RcTTUBβ1 ORF序列与GenBank中的序列一致,长度为1 341 bp,未发生移码突变.IPTG可诱导产生分子量约为68kDa的融合蛋白,最优表达条件为诱导温度28℃、诱导时间7 h和IPTG 0.5 mmol/L,融合蛋白主要以包涵体的形式存在.这为纯化融合蛋白以制备其抗体,用以研究RcTUBβ1的免疫组织化学分布及时空表达模式提供了基础.     

独行菜LaMCT基因的克隆、序列分析与原核表达

强心苷作为药用植物独行菜( Lepidium apetalum)的活性成分,其化学和药理学研究已有良好的基础,但其生物合成途径目前仍不清楚。该研究以独行菜幼苗为材料,通过分析独行菜转录组数据,设计特异性引物,PCR扩增得到了强心苷生物合成MEP途径的关键酶2-C-甲基赤藓醇-4-磷酸胞苷酰转移酶( MCT)基因的开放阅读框( ORF),命名为LaMCT( Genbank注册号KT832554),并进行序列分析和原核表达。序列分析结果表明：LaMCT基因ORF全长为912 bp,编码304个氨基酸。亚细胞定位和保守结构域分析结果表明：LaMCT蛋白位于叶绿体中,不含信号肽,没有跨膜区,含有类异戊二烯合成酶保守结构域( isoprenoid synthase domain)。系统进化树结果表明：LaMCT蛋白与拟南芥的MCT蛋白具有94％的序列相似性,亲缘关系较近。通过构建pET-32a-LaMCT原核表达载体,成功在大肠杆菌BL21( DE3)菌株中诱导表达LaMCT重组蛋白,并得到了纯化的LaMCT重组蛋白。该研究首次从独行菜中克隆了LaMCT基因,建立其稳定的原核表达体系,为LaMCT蛋白抗体的制备以及研究LaMCT基因在独行菜强心苷类化合物生物合成途径中的功能奠定了基础。     

非洲菊GjPAL的克隆及表达分析

为了解非洲菊PAL基因编码蛋白的理化性质和表达模式,以非洲菊品种"玲珑"为材料,利用RACE和RT-PCR技术克隆获得4个PAL基因(命名为GjPAL1-GjPAL4),利用生物信息学方法研究它们的结构及其编码蛋白的特性.利用qPCR检测GjPALs在不同组织部位和不同逆境胁迫处理下的表达模式.序列分析显示:4个GjP...     

花生类受体蛋白激酶基因AhBAK1的克隆及原核表达

BAK1是富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶,参与调控植物先天免疫反应过程中的程序性细胞死亡过程。实验室已有的花生铝胁迫转录组数据揭示AhBAK1为铝胁迫响应基因。为研究其在花生抗铝机制中的作用,该文分析了铝胁迫下AhBAK1在花生耐铝品种‘99-1507’和铝敏感品种‘中花2号’(‘ZH2’)根尖中的转录变化,采用RT-PCR技术进行扩增AhBAK1的完整CDS序列,并对序列特征进行了分析。结果表明:AhBAK1显著响应铝处理,且在‘99-1507’中有着更强的诱导表达; AhBAK1包括625个氨基酸残基,属富亮氨酸重复区类受体激酶,具跨膜域和蛋白激酶催化结构域,不存在信号肽,预测定位于细胞质膜;我们进一步构建了含有AhBAK1激酶域的pGEX-6p-1-AhBAK1-CD重组质粒,体外诱导表达出约70kD可溶性蛋白,经凝胶亲和层析纯化,最终得到基于蛋白印迹实验(Western Blot)验证正确的重组蛋白。为进一步研究AhBAK1的生物学功能和生化功能奠定了基础。     

长春花Crlea基因的克隆及原核表达初步分析

晚期胚胎丰富（Late Embryogenesis Abundant, LEA）蛋白是植物在干旱胁迫下响应并被描述为具有潜在的抗旱功能的一类重要的抗旱蛋白。通过建立干旱胁迫下长春花（Catharanthus roseus）的cDNA文库并进行测序筛选分析,首次分离得到Crlea（Crlea for Catharanthus roseus late embryogenesis abundant）全长基因。该基因具有492 bp的开放读码框,编码163个氨基酸,其中偏性氨基酸含量占总蛋白的55.9%。同源性分析表明该假定蛋白与胡萝卜（Daucus carota）LEA DC3 的同源性达69%。亲水性分析表明具有极强的亲水性。为进一步验证CrLEA蛋白的功能,构建了Crlea基因的原核表达载体并在大肠杆菌中对其表达进行了分析。结果表明,原核载体成功的表达了CrLEA蛋白,亲水性实验及热稳定性实验表明CrLEA蛋白具有极强的亲水性和热稳定性。     

解淀粉芽孢杆菌YN-1抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表达

本文以解淀粉芽孢杆菌YN-1菌株为研究对象,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出编码TasA抑菌基因的全长DNA,并构建pGEX-4T2/TasA原核表达载体,获得TasA-GST融合表达的抑菌蛋白。测序结果表明,解淀粉芽孢杆菌YN-1TasA基因核苷酸序列全长为786bp(GenBank登录号:EU131674),编码261个氨基酸残基;同源性分析表明,它与解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens FZB42(YP_001421886)序列的同源性最高,达98%,预测蛋白分子量为31kD。SDS-PAGE分析表明,TasA基因能在大肠杆菌BL21中表达,Western印迹分析pGEX-4T2/TasA原核表达载体,检测到约57kD的TasA-GST融合外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相符。表达产物细胞裂解液上清经Ni柱层析,表明浓度为500mmol/L咪唑洗脱缓冲液时获得较高浓度和纯度的纯化蛋白。进一步抑菌活性分析表明表达产物对黄瓜灰霉病病原菌检测平板上显示出较好的抑菌活性。本研究结果将为今后深入研究TasA抑菌蛋白基因以及抗病转基因工程提供了参考。     

金钗石斛过氧化物酶基因的克隆及原核表达

为了获得金钗石斛(Dendrobium nobile)过氧化物酶基因(命名为DnPOD)编码序列,分析该基因的分子特征,掌握该基因原核表达数据,本研究采用同源克隆的方法,以金钗石斛cDNA为模板,设计基因特异性引物克隆DnPOD基因,分析了DnPOD基因结构,将重组质粒pET28α-DnPOD在BL21 (DE3)菌株...     

棉花4-香豆酸辅酶A连接酶基因克隆及原核表达

本研究从棉花中克隆了一个4CL基因,命名为Gh4CL2(GenBank登录号为FJ848870)。研究结果表明:Gh4CL2基因cDNA全长2332bp,具有一个1725bp的开放阅读框,5′非编码区为64bp,3′非编码区为543bp,编码574个氨基酸,预测分子量约为62.106kD,等电点为5.94。氨基酸同源性分析发现,Gh4CL2与来自白杨、大豆和紫草的4CL一致性较高。进一步研究Gh4CL2基因的功能,构建了该基因的原核表达载体pET-28a-4CL2,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE分析表明,最佳诱导表达条件为0.5mmol/LIPTG在37℃下诱导4h,重组蛋白主要以包涵体形式出现。     

棉花HSP70基因的克隆与原核表达

以抗旱性较强的棉花品种‘KK1543’为材料,采用RT-PCR技术克隆了1个棉花HSP70基因,命名为GhHSP70。研究结果表明:GhHSP70基因开放阅读框长1 997bp,编码648个氨基酸,GhHSP70蛋白相对分子量为70.94kD,等电点为4.83。氨基酸序列比对和系统进化树分析发现,GhHSP70与欧洲大叶杨HSP70的亲缘关系最近,氨基酸序列一致性达到96.4%。为进一步分析基因的功能,构建原核表达载体pGEX-4T-1-GhHSP70,并在大肠杆菌中异源表达。SDS-PAGE分析表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致,重组蛋白在37℃,0.2mmol/L IPTG诱导2h时表达量最大。研究为进一步研究棉花HSP70基因功能奠定基础。     

铁皮石斛蔗糖磷酸合成酶基因的克隆与原核表达

应用同源序列克隆法克隆了铁皮石斛蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因cDNA全长,并进行了原核表达分析,为进一步研究该基因的时空表达、功能分析及多糖合成机理提供理论依据。结果表明:(1)铁皮石斛SPS基因cDNA全长3 502bp,编码区3 186bp,GenBank登录号JF423929。该基因编码1 061个氨基酸,与文心兰的SPS基因氨基酸序列的一致性最高为93%,与其他科植物SPS基因的氨基酸序列的一致性均高于60%。(2)原核诱导表达结果显示,SPS基因在大肠杆菌中的重组蛋白分子质量约为118.7kD,其表达与序列分析推测的结论一致。(3)生物信息学分析表明,铁皮石斛SPS基因的二级结构包括了螺旋、β-折叠和无规则卷曲,是非跨膜结构的亲水性不稳定蛋白,有2个功能结构域,分别是蔗糖合成功能域及糖基转移功能域。     

板栗咖啡酸氧甲基转移酶基因CmCOMT的克隆及原核表达

该研究根据板栗(Castanea mollissima Bl.)cDNA文库分析得到EST序列,采用RT-PCR技术,克隆板栗咖啡酸氧甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferase,COMT)基因全长cDNA(CmCOMT),分析其编码蛋白的相关信息并进行原核表达研究,为板栗木质素合成关键酶基因CmCOMT的生物学功能研究与应用奠定基础。结果表明:(1)CmCOMT基因(GenBank登录号为KU365322)具有一个1 098bp开放阅读框(ORF),共编码365个氨基酸,推测蛋白分子质量为39.684 9kD,理论等电点为5.83,具有植物SAM依赖甲基转移酶的典型特征。(2)CmCOMT核苷酸序列及其编码氨基酸序列与垂枝桦(Betula pendula)和白桦(Betula platyphylla)的相应序列一致性均在90%以上;同源建模表明,CmCOMT的3D模型与苜蓿(Medicago sativa)MsCOMT的蛋白结构相似,推测其可能与MsCOMT具有相似的功能;系统发育树分析显示,CmCOMT与其他植物COMTs具有相同的进化祖先,与桦木科植物物种亲缘关系最近。(3)SDS-PAGE电泳分析表明,CmCOMT蛋白最佳诱导表达条件为0.3mmol/L IPTG在25℃下诱导6h,蛋白分子量约为44kD,其主要以可溶性蛋白的形式存在。     

大肠杆菌glgC基因的克隆及原核表达

以大肠杆菌BL21染色体DNA为模板,根据glgC基因的全序列设计了1对引物,在优化的PCR反应条件下扩增出了glgC基因片段,测序结果显示该片段大小为1296 bp,编码432个氨基酸残基。将该基因克隆到原核表达载体pET-28a-c( )中,重组载体pET-glgC转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定,得到了与理论推算的glgC基因表达产物分子质量(约53 kD)相符的特异蛋白条带。     

水稻甲基结合蛋白基因MBD701的克隆及原核表达

甲基结合域蛋白MBD作为与甲基化位点特异结合的重要反式作用因子,在植物生长发育中发挥着重要的调控作用.为了探讨MBD基因的结构与功能,利用RT-PCR方法克隆了水稻中编码甲基结合蛋白基因MBD701,构建了MBD701的原核表达载体pGEX-MBD701,并在大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株中实现了融合蛋白GST-MBD701的表达.结果表明,MBD701除了包含典型的甲基结合域(第138～212)外,还包含CW的锌指结构(第73～132);在37℃,1 mmol/L IPTG浓度条件下成功诱导表达了大小为65.87 kD的GST-MBD701融合蛋白,这为进一步开展MBD701的蛋白纯化和功能分析奠定了基础.     

金黄色葡萄球菌CHIPS基因克隆及原核表达

趋化抑制蛋白(Chemotaxis Inhibitory Protein ofStaphylococcus aureus,CHIPS)是由金黄色葡萄球菌分泌到菌体外的一种蛋白。在感染早期,它能特异性地与中性粒细胞和单核细胞上的C5a受体(C5aR)和fMLP受体(FPR)结合,从而阻止中性粒细胞和单核细胞对C5a和fMLP的结合作用,导致对病原吞噬作用的延迟。人们可以利用CHIPS对C5a-C5aR的阻止作用来研制治疗由C5a诱发的炎症性疾病的药物。将CHIPS作为免疫原防治疾病也将成为新的研究课题。实验成功构建了CHIPS蛋白的原核表达系统,为CHIPS免疫原性研究及蛋白的其他功能研究奠定了基础。     

水蕨中心体蛋白基因的克隆与原核表达

蕨类植物的精子形成是一个运动细胞器重新发生的过程,但对其精子发生的分子机制仍不甚了解。中心体蛋白(centrin)是定位于细胞中心体上的一种高度保守的钙结合蛋白,被认为可能是最早参与运动细胞器发生的蛋白质。克隆鉴定centrin蛋白为进一步分析蕨类精子发生的分子机制奠定基础。该研究从蕨类模式植物水蕨(Ceratopteris thalictroides)中克隆到了水蕨centrin基因(CtCEN),其cDNA序列全长为1 077bp,结构分析表明CtCEN基因属于EF-hand超家族的centrin基因。Centrin的系统树分析发现,藻类、蕨类以及动物等具鞭毛游动精子的生物聚为一支,而被子植物聚为另一分支,表明centrin的功能可能与运动细胞器鞭毛发生有关。原核表达和Western blot分析表明,CtCEN基因表达的蛋白能与人源centrin抗体发生结合,这一结果证实克隆到了centrin基因。