黄鳝转铁蛋白受体1基因的克隆及表达分析

旨在研究黄鳝转铁蛋白受体1基因的功能及其组织表达特异性,采用同源克隆结合RACE技术从黄鳝肝脏中分离其转铁蛋白受体1基因,用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,用半定量RT-PCR技术研究各组织中Tf R1表达水平。结果表明,克隆获得黄鳝Tf R1,Gen Bank注册序列号为KF819396。该c DNA全长2 839 bp,5'UTR长134 bp,3'UTR长380 bp,编码一个长774个氨基酸的多肽链。氨基酸多序列比对结果表明,黄鳝Tf R1基因推断的氨基酸序列同其他鱼类的同源性较高,达55.68%-68.41%;而同哺乳动物的Tf R1基因同源性较低。半定量RT-PCR分析表明,黄鳝Tf R1基因转录本在不同组织表达量有明显差异;在血细胞中表达量最高,而在肾脏、脾脏和小肠中表达中等,在肝脏、胃、皮肤、脑、心脏和肌肉中表达量很低。     

海州香薷Actin基因片段克隆及表达分析

通过克隆海州香薷Actin基因片段并分析其组织表达,为研究海州香薷重金属抗性相关基因的表达调控奠定基础。根据Gen Bank中其他植物Actin基因保守序列设计兼并引物,以海州香薷根总RNA为模板,利用RT-PCR技术分离得到Actin基因片段。序列分析结果表明,海州香薷Actin基因片段长576 bp,编码192个氨基酸,与其他植物同源基因的氨基酸序列相似性为84%-97%,所克隆的序列为Actin基因的同源片段,将其命名为Eh ACT,在Gen Bank中提交序列,获得登录号AGT37260。半定量RT-PCR分析结果表明,Eh ACT在海州香薷的根、茎和叶中表达相对稳定,初步表明其可作为研究海州香薷基因表达的内参基因。     

马氏珠母贝STA RDL3基因的克隆与表达性分析

采用RACE技术克隆获得马氏珠母贝STARDL3基因c DNA全长序列(Pm-STARDL3);利用荧光定量技术检测Pm-STARDL3基因在各个组织中的表达量。结果表明,Pm-STARDL3基因c DNA序列全长3 655 bp,开放阅读框(ORF)长1 491 bp,编码496个氨基酸,5'非翻译区(5'UTR)长110 bp,3'UTR长2 054 bp。PmSTARDL3氨基酸序列同源比对分析显示与华贵类栉孔扇贝(Mimachlamys nobilis)STARDL3的序列的相似度最高。SMART软件分析得出,Pm-STARDL3有STARD类蛋白特有的结构域。荧光定量PCR检测结果表明Pm-STARDL3在肝胰腺中表达量最高,其后依次是外套膜、鳃与闭壳肌,各组织的表达量差异具统计学意义(p0.05)。     

孟氏隐唇瓢虫细胞色素P450基因的克隆与序列分析

采用同源克隆和RACE技术,从孟氏隐唇瓢虫Cryptolaemus montrouzieri Mulsant中克隆到细胞色素P450CYP9Z401基因的c DNA全序列(Gen Bank number:KP164813)。c DNA全长1722 bp,包含3'非编码区域(UTR)为86 bp和5'UTR为49 bp,开放阅读框(ORF)长1587 bp,编码528个氨基酸。预测的分子量为61.27 k D,理论等电点为6.58,无信号肽结构,在2-20氨基酸处存在跨膜螺旋。该基因拥有细胞色素P450特征序列螺旋C、螺旋K和Meander区域,另外还有血红素结合区(1个氨基酸差异)和螺旋I区(2个氨基酸差异)。与其他昆虫的CYP9家族基因比较,与赤拟谷盗Tribolium castaneum同源性最高,为47%,系统发育分析也表明两者的亲缘关系最近。CYP9Z401基因的克隆和比较分析为进一步深入研究孟氏隐唇瓢虫的细胞色素P450基因功能及其进化具有重要意义。     

牦牛KLF3基因克隆及组织表达分析

旨在克隆牦牛KLF3基因序列,并获得其生物学特征,同时阐明其组织表达规律。选取4-6周岁的健康麦洼牦牛6头,采集脾、肺、肾、皮下脂肪和背最长肌组织样品,提取组织总RNA,利用RT-PCR方法克隆KLF3基因序列,同时利用荧光定量PCR(q PCR)技术检测该基因在不同组织中的表达情况。结果表明,获得牦牛KLF3基因序列1 137 bp(Gen Bank登录号:KX964630),其中CDS为1 041 bp,5'UTR 32 bp和3'UTR 64 bp,编码346个氨基酸,牦牛KLF3氨基酸序列与普通牛(XP_010820342.1)的氨基酸序列同源性达100%。KLF3 m RNA在牦牛肺脏和肝脏的表达水平较高,极显著高于其他组织(P0.01)。     

观赏向日葵ζ-胡萝卜素脱氢酶基因HaZDS的克隆与表达分析

采用RT-PCR和RACE技术,从观赏向日葵新品种闽葵3号黄色花瓣中克隆获得类胡萝卜素合成途径关键酶基因ZDS,命名为Ha ZDS(Gen Bank No.KF263657),该基因c DNA全长2069 bp,具有一个1761 bp的完整开放阅读框(ORF),编码587个氨基酸。推导氨基酸序列分析表明,Ha ZDS蛋白在N-末端区域含有一个叶绿体转运肽序列,含有一个典型的氨基氧化酶结构域和NAD(P)结合结构域,存在一个特征序列。系统发育分析表明,观赏向日葵Ha ZDS与万寿菊、菊花蛋白的同源性分别达96.4%、90.1%,亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR技术分析结果显示,Ha ZDS基因在盛花期表达量最高,不同组织中的表达量舌状花瓣绿色管状花苞片叶片黑色管状花,随着花瓣黄色的加深,基因表达量逐渐增加。推测Ha ZDS基因在转录水平上参与观赏向日葵花色形成的调控。     

大眼长蝽卵黄原蛋白基因克隆、序列分析及表达研究

旨在为研究大眼长蝽(Geoco ris pallidipennis)卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg)分子特性及其基因生理功能。利用RT-PCR、RACE及ELISA方法对大眼长蝽Vg基因进行克隆、序列分析和表达研究。该基因c DNA全长5 667 bp(Gen Bank登录号:KP688587),编码1 848个氨基酸残基,N-末端的前19个氨基酸为信号肽。氨基酸序列中有两个保守的多聚丝氨酸区域和RXXR酶切位点,接近C-末端有GLAG基序,其后有5个保守的半胱氨酸残基,DGYR基序位于GLAG上游18个氨基酸残基处。该基因编码氨基酸序列与其它半翅目昆虫Vg氨基酸序列相似度较高,氨基酸序列分析显示它有Vg的典型特征,表明克隆的c DNA序列是大眼长蝽的Vg基因序列。ELISA检测发现随着发育时间的延长,卵黄原蛋白表达量逐渐增加,羽化后22 d达到高峰,随后开始下降,结果表明大眼长蝽雌虫卵黄原蛋白的表达量与大眼长蝽产卵量紧密相关。     

甜瓜CmERFIII-1转录因子基因cDNA的克隆与表达分析

根据甜瓜ERF亚家族成员聚类结果,选取第三亚群的Cm ERFIII-1(甜瓜基因组数据库登录号MELO3C005465)基因为研究对象,根据其c DNA序列设计基因特异引物,应用RT-PCR技术从甜瓜品种河套蜜瓜果实的总RNA中克隆得到Cm ERFIII-1基因c DNA,序列长711 bp,编码236个氨基酸组成的多肽。序列比对及系统发育分析表明,Cm ERFIII-1 c DNA编码的蛋白质氨基酸序列与黄瓜中ERF亚家族两个成员的序列(Gen Bank登录号:XP_004143677.1、XP_004158119.1)亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明,该基因在甜瓜根、茎、叶和授粉后不同时期果实中均有不同程度表达,在叶片中表达量最高。     

梭梭NAC转录因子HaNAC38、HaNAC42克隆及表达分析

本研究从梭梭中克隆得到2个NAC转录因子,分别命名为Ha NAC38和Ha NAC42。Ha NAC38读码框长879 bp,编码292个氨基酸;Ha NAC42读码框长582 bp,编码198个氨基酸。序列比对显示Ha NAC38和Ha NAC42均含有NAC家族的A、B、C、D、E保守结构域。荧光定量PCR分析结果显示,梭梭(Haloxylon ammodendron,H.ammodendron)幼苗中Ha NAC38和Ha NAC42基因在干旱、高盐、IAA、ABA处理以及高温胁迫条件下的表达模式并不完全相同,为进一步研究梭梭NAC转录因子功能和调控机制打下基础。     

野生茄子（Solanum torvum）抗黄萎病相关基因Sto Vel的克隆与分析

采用RT—PCR和RAcE技术从野生茄子中扩增克隆到一个抗黄萎病相关基因,命名为StoVel,其cDNA全长3400bp,含有3153bp的完整开放阅读框,编码1051个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与刚果野茄、类番茄和番茄Vel编码的氨基酸序列同源性分别为82％、81％和80％,且有很高的功能区段保守性。将该cDNA全长序列提交Gen Bank,登陆号为DQ020574。半定量PCR表明该基因为组成型表达,在根中表达最多,叶中最少。     

甘蔗SoNIN1基因结构及其内含子信息分析

根据前期克隆得到的So NIN1基因的全长c DNA和部分启动子序列设计引物,应用PCR技术从甘蔗叶片g DNA中克隆So NIN1基因,并利用生物信息学方法分析基因的结构。结果表明,So NIN1基因的DNA序列长4 938 bp,包含6个外显子和5个内含子,Gen Bank登录号KF563902。在该基因5'非翻译区存在一个268 bp内含子序列,同时5个内含子序列中含有与低温、干旱和激素等胁迫响应相关的作用元件,这些可能对So NIN1基因转录表达起调控作用。依据So NIN1蛋白聚类和外显子-内含子基因结构可以将植物NINs分为两类。     

烟草胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆及表达分析

采用电子克隆的方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术,首次从烟草(Nicotiana tabacum)中克隆到1个胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)基因的c DNA序列,命名为Nt6PGDH(Gen Bank登录号:KM211534)。该基因c DNA全长1 932bp,开放阅读框1 455 bp,编码484个氨基酸,与番茄(Solanum lycopersicum)和马铃薯(Solanum tuberosum)的6PGDH氨基酸序列一致性最高,为95%。生物信息学分析表明,Nt6PGDH氨基酸序列不存在信号肽和转运肽,无跨膜结构域,定位于细胞质。对烟草不同发育时期Nt6PGDH基因的表达情况分析发现,Nt6PGDH基因在烟草旺长期根、茎、叶中的表达量均高于苗期,并且在同一发育时期,烟草根中表达量最强,茎次之,叶片最弱。     

珙桐CAC基因的克隆及其作为内参基因的评价

从珙桐(Davidia involucrata Baill.)中克隆到一个编码网格蛋白衔接蛋白复合物(Clathrin adaptor complexes,CAC)的基因,命名为DiCAC(Gen Bank登录号为KX268525)。该基因开放阅读框全长1 317 bp,编码438个氨基酸。同源序列比对与聚类分析表明,该基因与其它15种植物的CAC氨基酸序列的相似度达到94%以上,其中与葡萄CAC的氨基酸序列同源性最高。为评价该基因作为珙桐内参基因的可行性,结合5个珙桐管家基因(ACT7、EF1a、GAPDH、β-TUB、18S rRNA),采用半定量PCR和实时荧光定量PCR对DiCAC基因在珙桐不同组织以及不同发育阶段苞片中的表达稳定性进行分析,并与常见管家基因的稳定性进行比较,结果表明,该基因在珙桐不同组织以及不同发育阶段苞片中均为稳定表达,且表达稳定性优于常见管家基因,可以作为相关基因表达研究中的内参基因。首次克隆到珙桐CAC基因,并且明确了其作为内参基因的可行性,为深入研究珙桐相关基因的表达分析提供了候选内参基因资源。     

藏山羊FGF1基因克隆、生物学特征及组织表达分析

本研究旨在克隆藏山羊FGF1基因的CDS序列,并获得其生物学特征,同时阐明其组织表达规律。选取2.5周岁健康公藏山羊6头,采集皮下脂肪、背最长肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织样品,提取组织总RNA,利用RT-PCR方法克隆FGF1基因序列,同时利用实时定量PCR检测其m RNA在不同组织中的表达水平。结果表明,获得藏山羊FGF1基因序列1 165 bp(Gen Bank登陆号:KX509990),其中CDS为468 bp,5'UTR 255 bp和3'UTR 422 bp,编码155个氨基酸,藏山羊FGF1基因与山羊(KT899959)的核苷酸同源性为99.57%,氨基酸同源性为99.35%。FGF1 m RNA在藏山羊皮下脂肪组织中的表达水平较高,极显著高于其他组织(p0.01)。本研究将为进一步研究藏山羊FGF1基因的结构和功能提供参考资料。     

新型小鼠淋巴组织特异性肌动蛋白结合蛋白相关序列cDNA克隆

 应用抑制性差减杂交技术 ( SSH)克隆两种不同小鼠胸腺基质细胞的差异表达基因 ,获得新基因片段 C55.通过 Gen Bank检索及 RT- PCR扩增出一个全长 1 .4kb的 c DNA.杂交分析认为它是一个完整的 c DNA序列 .c DNA序列分析表明 ,它拥有一个 636bp的开放读码框架 ,编码 2 1 2个氨基酸 .同源序列比较发现 ,它编码一个肌动蛋白相关蛋白的新成员 ,该序列与多种已知的肌动蛋白相关蛋白 SM2 2 α及其同源蛋白在氨基酸水平上有 62 %～ 95%的同源性 .Northern杂交分析显示 ,该基因 m RNA转录本在两种不同胸腺基质细胞中的表达存在显著差异 . RT- PCR分析显示 ,该基因特异表达于小鼠淋巴相关组织中 ,而在非淋巴组织中无表达 .     

梭梭中HaDREB2A的克隆与表达分析

脱水响应元件结合蛋白(DREB)转录因子在应激反应相关基因的调控中起重要作用。本研究利用RT-PCR方法从梭梭组织中获得Ha DREB2A基因开放阅读框(ORF)全长(Gen Bank登录号为:KP765243)。生物信息学分析表明,该基因ORF长1 083 bp,编码360个氨基酸,蛋白的分子量为40.5 k D,理论等电点(p I)为5.07,该蛋白在90(K)~143(R)区域含有一个典型的AP2保守结构域。通过物种间系统发育树可以看出Ha DREB2A与Sb DREB2A进化关系最接近,二者属于同一进化分支。半定量RT-PCR表达模式分析显示,该基因在梭梭同化枝、根、茎、花和种子中均有表达,且在同化枝中的表达量最高,并且受干旱、高盐和外源ABA的诱导。     

虾夷扇贝热休克蛋白60基因克隆及表达特性研究

旨在探讨虾夷扇贝高温应激的分子机理并为解决该种夏季死亡问题打下基础。基于HSP60的转录组序列设计特异引物,采用RACE技术成功克隆获得虾夷扇贝热休克蛋白60(My HSP60)c DNA全序列。其c DNA序列全长3 368 bp,包括68 bp的5'UTR,1 569 bp的3'UTR和1 731 bp的开放阅读框,共编码576个氨基酸。利用基因步移技术扩增My HSP60基因启动子区域序列并测序,获得My HSP60基因启动子区域序列1 236 bp,该区域包含2个TATA盒,4个CCAAT盒,3个热激元件。基于氨基酸序列构建的系统进化树与传统物种进化规律基本吻合。通过实时PCR检测发现HSP60在虾夷扇贝各组织中均有表达,升温后肾脏中该基因的转录量升高极显著,而肝胰腺、外套膜、血淋巴和闭壳肌中的转录量升高显著(P0.05),说明该基因在热应激过程中发挥一定作用。     

山药Actin基因片段的克隆及表达分析

通过山药Actin基因的克隆和表达分析,为研究山药生长发育中肌动蛋白的作用及其他基因的表达和调控奠定基础。根据Gen Bank中已经公布的其他植物肌动蛋白基因(Actin)的保守序列设计一对简并引物,采用RT-PCR技术从山药块茎中分离出1个Actin基因cDNA片段,命名为DoActin。片段长度为1 091 bp,编码357个氨基酸,并提交Gen Bank(登录号:KU669295)。与NCBI核酸和蛋白质数据库序列比对,该序列与其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在83%以上,氨基酸序列的同源性均在97%以上。进化分析结果显示,DoActin与海枣Actin-2、木本棉Actin-7的亲缘关系最近。实时定量PCR结果显示,DoActin在山药叶片、地上茎和地下块茎以及不同发育期的块茎和叶片中表达量相对稳定,表明其适宜作为山药的内参基因。     

山药Actin基因片段的克隆及表达分析北大核心CSCD

通过山药Actin基因的克隆和表达分析,为研究山药生长发育中肌动蛋白的作用及其他基因的表达和调控奠定基础。根据Gen Bank中已经公布的其他植物肌动蛋白基因(Actin)的保守序列设计一对简并引物,采用RT-PCR技术从山药块茎中分离出1个Actin基因cDNA片段,命名为DoActin。片段长度为1 091 bp,编码357个氨基酸,并提交Gen Bank(登录号:KU669295)。与NCBI核酸和蛋白质数据库序列比对,该序列与其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在83%以上,氨基酸序列的同源性均在97%以上。进化分析结果显示,DoActin与海枣Actin-2、木本棉Actin-7的亲缘关系最近。实时定量PCR结果显示,DoActin在山药叶片、地上茎和地下块茎以及不同发育期的块茎和叶片中表达量相对稳定,表明其适宜作为山药的内参基因。     

棉花粉蚧化学感受蛋白基因PsCSP10的克隆及表达谱分析

本研究克隆出了棉花粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley化学感受蛋白(CSPs)基因Ps CSP10的全长c DNA(Gen Bank登录号:KT958555),其核苷酸序列长640 bp,编码128个氨基酸,预测其成熟蛋白分子量14.99 k D,等电点6.61,且含有4个保守的半胱氨酸,符合昆虫CSPs的典型特征。该基因编码的氨基酸序列和其他昆虫化学感受蛋白基因编码的氨基酸序列相似性为50%-56%。应用Real-time PCR测定的结果表明棉花粉蚧各发育阶段中Ps CSP10均有表达,但在雄成虫中的相对表达量显著高于其他发育阶段。在分别用扶桑Hibiscus rosa-sinensis L.、棉花Gossypium hirsutum L.、马缨丹Lantana camara L.饲养获得的雄成虫中Ps CSP10相对表达量不存在差异。研究结果为进一步明确棉花粉蚧中Ps CSP10的功能奠定了基础。