产酸克雷伯氏菌赖氨酸脱羧酶的异源表达及粗酶性质

赖氨酸脱羧酶,可以催化赖氨酸脱羧生成戊二胺。戊二胺是重要的平台化合物,可以合成新型聚酰胺材料、脂肪族异氰酸酯等新材料。本研究对来自于产酸克雷伯氏菌的赖氨酸脱羧酶进行异源表达。以pUC18质粒为载体,将来源于产酸克雷伯氏菌的赖氨酸脱羧酶基因ldc克隆到大肠杆菌,得到菌株LN18。在添加0.5 mmol/L IPTG的LB培养基中,对LN18进行摇瓶培养,发酵液酶活可达到35 U/g发酵液,从发酵液制备的赖氨酸脱羧酶粗酶蛋白的酶活可以达到30 000 U/g粗蛋白。产酸克雷伯氏菌赖氨酸脱羧粗酶蛋白大小约80 kDa,粗酶的最适温度和pH值分别为55℃和5.5,与文献中报道的大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶Cad A在pH 8.0几乎没有酶活不同,产酸克雷伯氏菌的赖氨酸脱羧酶在pH 8.0的酶活达到最优pH下酶活的30%以上。金属离子对酶活有一定的影响,Mg~(2+)对酶活有促进作用,Fe~(2+)、Zn~(2+)、Ca~(2+)有一定的抑制作用。     

产γ-氨基丁酸屎肠球菌的鉴定及其谷氨酸脱羧酶酶学性质

目的:鉴定1株产γ氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的乳酸菌HS3,并研究了其谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)粗酶酶学性质。方法:根据形态培养特征、生理生化特征和16S rDNA序列比对及系统发育分析对菌株HS3进行了鉴定。采用菌体细胞破碎后的粗酶液,研究了温度、pH和金属离子对酶活的影响。结果:菌株HS3的形态培养和生理生化特征符合肠球菌属(Enterococcus)特征,其16S rDNA序列与Enterococcus faecium(EU717962)16S rDNA序列同源性达99%,鉴定菌株HS3为屎肠球菌(Enterococcus faecium),菌株HS3 GAD最适作用温度为40℃,最适作用pH4.5。酶的热稳定较好,50℃处理4h,在pH3.5～6.0酶活基本稳定。Ca2+对酶有激活作用,5mmol/L和50mmol/L浓度酶活分别提高了37.41%和17.43%。Ba2+和Zn2+在5mmol/L浓度时激活作用明显,而Mg2+在5mmol/L浓度激活作用较好。结论:菌株HS3的GAD活力较高,稳定性较好,为生物合成GABA提供了新的微生物菌种资源。     

低温淀粉酶菌株C2的分离鉴定及其产低温淀粉酶的酶学性质

获得低温淀粉酶高产菌株,确定该菌株所产淀粉酶的酶学性质.从大黑山(大连)污泥中筛选菌株,通过菌株的形态特征、生理生化和16S rDNA序列鉴定确定其种属,对其酶学性质进行初步研究.获得1株低温淀粉酶高产菌株C2,经鉴定其为微小杆菌属,C2所产低温淀粉酶最适反应温度为25℃,酶的热稳定性比较差,最适pH为7.5,Ca2+和Fe2+对该酶有激活作用,Cu2+、Ni2+、Go2+等抑制酶活性.经薄层层析(TLC)鉴定酶解产物为葡萄糖,说明该菌株具有产生低温淀粉糖化酶的能力.菌株C2所产淀粉酶符合低温淀粉酶性质,值得进一步研究.     

南极产低温脂肪酶菌株Psychrobacter sp. 7195 的 选育、发酵条件及酶学性质研究

从南极普里兹湾深海沉积物中筛选到一株产低温脂肪酶的菌株7195,细菌学形态鉴定及16S rDNA序列分析表明该菌株属于嗜冷杆菌属 (Psychrobacter). 生长特性研究表明该菌株属于耐冷菌,其最适生长温度范围为5～15°C, 7195菌株能利用多种碳、氮源产酶.粗酶液经硫酸铵盐析、DEAE cellulose-52 柱层析进行初步分离纯化后进行酶学性质的研究. 该菌株所分泌的脂肪酶最适作用温度为30°C,最适pH值为9.0,对热敏感,60°C热处理10min剩余酶活为30%,是典型的低温酶. Ca2+、Mn2+、Cu2+对该酶有较为明显的激活作用,而Co2+、Zn2+、Hg2+、Rb2+、Cd2+、Fe3+、EDTA则能抑制酶活,此外该脂肪酶能在高浓度的SDS、CHAPS、Triton X-100、Tween 80、Tween20等变性剂中表现出较好的稳定性.     

一株产耐酸性α-淀粉酶菌株的鉴定及其酶学性质研究

随着现代淀粉工业的发展,寻找耐酸性新型α-淀粉酶成为研究热点。实验室分离到一株高产耐酸性α-淀粉酶菌株AF1。通过形态学观察法、生理生化特征与16Sr DNA序列分析鉴定出AF1菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。对其酶学性质进行初步研究发现,该酶最适作用温度为75℃,p H为5.0;在温度60℃以下,p H 5.0~7.0范围内酶活比较稳定;Cu2+对酶活有明显抑制作用,K+、Li+、Fe3+则对酶活有轻微抑制作用,Na+、Ca2+、Ba2+、Mg2+和EDTA则对酶活没有明显影响。可见,本研究中的α-淀粉酶是一种不依赖于Ca2+的耐酸性α-淀粉酶,在淀粉加工过程中,不仅不用加Ca2+以维持酶的活性,同时可以不用p H调节,实现在弱酸性条件下淀粉液化和糖化同步进行,从而精简工序,节约成本。     

一株产低温β-半乳糖苷酶微杆菌的筛选鉴定、产酶条件及其酶学特性

【背景】低温β-半乳糖苷酶能在低温下仍保持较高的乳糖水解活性,筛选酶学特性适合在牛乳体系中高效水解乳糖的β-半乳糖苷酶生产菌株,是低乳糖牛乳加工产业关注的焦点。【目的】对天山中国一号冰川沉积物中分离的一株产低温β-半乳糖苷酶菌株的产酶条件和酶学特性进行研究。【方法】结合X-Gal平板法初筛和测定粗酶液酶活复筛,获得产低温β-半乳糖苷酶的菌株。通过形态学、生理生化试验及16S rRNA基因测序分析对筛选菌株进行鉴定,单因素摇瓶实验优化菌株的产酶条件,硫酸铵分级沉淀初步纯化β-半乳糖苷酶并对其酶学特性进行分析。【结果】通过形态学、生理生化特征和16S rRNA基因鉴定,确定菌株LW106为微杆菌属(Microbacterium)菌株;该菌株最适产酶温度为25°C,最佳产酶碳源为可溶性淀粉,培养基初始pH为7.0,接种量为3%;对初步纯化的低温β-半乳糖苷酶酶学性质的研究表明,LW106所产β-半乳糖苷酶的最适pH为6.0,最适反应温度为35°C,4°C时酶活为最大酶活的78%,4°C和pH 7.0时的稳定性最好,10 mmol/L的Na+对酶活性基本没有抑制作用,Ca~(2+)对酶活性具有一定的激活作用。【结论】菌株LW106所产低温β-半乳糖苷酶的酶学特性表明该酶在乳品低温加工领域具有进一步研究和应用的价值。     

胶原蛋白酶产生菌的筛选及酶的分离纯化

从堆积骨骼的土样中筛选出高产胶原蛋白酶的MBL13菌株,经鉴定为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。对其所产的胶原蛋白酶BCC进行分离纯化,并进行酶学性质的研究。从菌株的发酵液中纯化出分子量约为38.0kDaBCC酶。酶反应的最适温度为40℃,最适pH为8.0。在50℃以下稳定,60℃保温1h酶活仅保留10%;在pH7.0～8.5活性较稳定;金属离子Ca2+、Zn2+、Mg2+对酶有激活作用,金属离子Cu2+对酶有显著的抑制作用。EDTA和EGTA能抑制该酶,表明BCC酶为一种金属蛋白酶。酶的底物特异性表明该酶为骨胶原蛋白酶,且对Ⅰ型骨胶原蛋白水解能力极显著高于Ⅱ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白。将纯化的BCC酶应用于骨胶原蛋白的水解可以得到不同链长的多肽,其水解能力高于标准品胶原酶Ⅰ型。本研究为工业酶提供了新的菌株和新型胶原蛋白酶,为胶原蛋白酶的开发提供了重要的理论依据。     

鲤源产β-甘露聚糖酶Bacillus velezensis HF-14109的分离鉴定及其酶学和生物学特性研究

【目的】以黄河鲤为材料,从其肠道内分离具有产β-甘露聚糖酶功能的益生菌。【方法】采用平板水解圈法初筛,摇瓶发酵法复筛获得产β-甘露聚糖酶的菌株,通过形态学观察、生理生化试验、16S r RNA基因序列和比较基因组分析对该菌株进行鉴定,并用DNS定糖法测定酶学活性,用耐高温、耐酸、耐胆盐和平板打孔扩散法对其益生特性进行研究,用滤纸片法、腹腔注射法等对其生物安全性进行评价。【结果】本研究通过刚果红染色从鲤肠道中分离筛选出产β-甘露聚糖酶的细菌62株,其中HF-14109菌株产酶能力最强。通过形态学观察、生理生化试验、16Sr RNA基因序列和比较基因组分析对该菌株进行鉴定,确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。酶学性质研究发现,该酶最适反应温度为45°C、最适p H为6.0,在温度20–80°C、p H 4.0–9.0范围内都较为稳定;Cu²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Ba²⁺对该酶具有激活作用,而Mn²⁺、Ca²⁺对该酶具有抑制作...     

赖氨酸脱羧酶分子改造及固定化合成1,5-戊二胺研究进展

1,5-戊二胺又名尸胺,是一种重要的生物基聚酰胺生产原料,可以与二元羧酸缩合生成生物基聚酰胺PA5X,其性能可以与石油基聚酰胺材料媲美。生物基聚酰胺以可再生能源为底物,如淀粉、纤维素、植物油等,符合绿色可持续发展战略。1,5-戊二胺的生物合成主要包括微生物从头合成及全细胞催化两种方法,而赖氨酸脱羧酶是其生物合成中的关键酶,该酶主要包括诱导型赖氨酸脱羧酶CadA和组成型赖氨酸脱羧酶LdcC两种。赖氨酸脱羧酶是一种折叠型Ⅰ型磷酸吡哆醛(pyridoxal-5'' phosphate,PLP)依赖酶,但该酶在实际反应过程中易受环境因素影响,存在活性不高、结构不稳定等问题。因此,提高赖氨酸脱羧酶催化活性及稳定性成为该领域的研究热点,主要包括分子改造以及固定化研究。文中综述了赖氨酸脱羧酶的作用机理、分子改造技术及固定化策略的研究进展,并对未来进一步提升赖氨酸脱羧酶活性及稳定性策略进行了展望,旨在实现1,5-戊二胺的高效生物制备。     

热稳定碱性脂肪酶产生菌的筛选及发酵条件的优化

从渤海湾盐碱地被油污染的土样中分离筛选出6株产热稳定碱性脂肪酶菌株。其中菌株1-7产脂肪酶能力较强,其最高酶活为8.67U/mL。根据其16S rDNA序列分析和Biolog生理生化分析,初步鉴定为醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)。初步酶学性质研究表明该菌所产脂肪酶具有较好的热稳定性,最适作用pH为9.0。摇瓶实验表明,该菌株最适产酶培养基为(g/L):玉米粉10,黄豆饼粉20,K_2HPO_4 1,NaNO_3 5,橄榄油10。最适产酶条件为:初始pH 8.0,培养温度37℃,培养时间29 h。接种量为2%,250 mL摇瓶装液量为30 mL。     

一株产α-高温淀粉酶的地衣芽孢杆菌的分离和筛选

从西藏当雄温泉附近的土壤中用锥虫蓝平板,55℃培养,筛选到一株分泌高温淀粉酶的菌株,经生理生化初步鉴定后,克隆16s rDNA基因测序,提交GenBank比对后,鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheninformis),命名为B.licheninformis LT.通过对B.licheninformis LT的生长条件和产酶条件的研究表明:该菌高温特性良好,最高可以在65℃生长,产酶最适温度50℃;可以在pH 3.O～pH 11.0的LB培养基中生长,最佳产酶pH 10.0,LB培养基加入淀粉诱导,发酵液酶活可达80 U.对该菌所产α-高温淀粉酶的性质研究表明:酶的最适反应温度为95℃,100℃处理60 min发酵液酶活力没有明显下降,最适酶作用pH 10.0,添加1g/L的钙离子具有激活作用.     

具有酶活力高、专一性强的L-赖氨酸脱羧酶菌种的选育

L—赖氨酸脱羧酶是尸胺杆菌产生的胞内酶。用于L—赖氨酸的含量分析。其作用原理是每个分子的L—赖氨酸在其脱羧酶的作用下放出一分子的CO_2,产生的CO_2可通过检压法测定其含量。该法操作简单、结果准确。在生产上具有重要的应用价值。     

赖氨酸-尸胺反向转运蛋白cadB基因谷氨酸棒杆菌表达载体的构建及转化

旨在提高谷氨酸棒杆菌合成尸胺的能力,将CadB克隆至谷氨酸棒杆菌中,与LDC共表达,在谷氨酸棒杆菌合成尸胺的同时,帮助尸胺转运至细胞外,解除尸胺的反馈抑制作用。谷氨酸棒杆菌能够高产赖氨酸脱羧酶的底物L-赖氨酸,但不含ldc和cadB基因,因而不能够直接合成尸胺。从E.coliK12中克隆出赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因,与绿色荧光蛋白基因gfp融合构建成融合表达载体pXBG,并转化至谷氨酸棒杆菌进行诱导表达,结果表明表达的CadB蛋白可以正确的定位于谷氨酸棒杆菌的细胞膜上。将基因cadB连接到含有赖氨酸脱羧酶基因的pXMJ19-ldc上,构建成能够共表达赖氨酸脱羧酶和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白的重组质粒pXLB,并转化到谷氨酸棒杆菌中。     

中度嗜盐菌LY9的分离鉴定及其淀粉酶特性研究

目的:从运城盐湖中分离获得中度嗜盐菌,并对其进行分离鉴定及酶学特性研究.方法:采用淀粉底物平板法获得高产胞外淀粉酶的嗜盐菌株LY9.16S rRNA序列分析,结合形态学和生理生化特征分析对其进行分类鉴定.研究不同物理化学因素对淀粉酶活性的影响.结果:系统发育分析表明该菌为Halobacillus属成员,鉴定并命名为Halobacillus sp.LY9,为中度嗜盐菌.该淀粉酶最适作用温度和pH值分别为60℃和8.0,同时在较宽pH范围内(4.0～12.0)保持高活力,表现出了较强的抗酸碱能力.Cu2+可明显抑制该酶活性,其它金属离子则基本无影响;该酶不受EDTA的抑制,表明该酶不属于金属蛋白酶,但SDS却能使酶活明显降低.结论:LY9的分离鉴定及其淀粉酶特性研究对促进运城盐湖生物资源的开发利用具有重要意义.     

大熊猫肠道纤维素分解菌的分离鉴定及产酶性质

【目的】从健康大熊猫新鲜粪便中分离具有纤维素酶活性的菌株,并对其进行菌种鉴定及产酶性质研究。【方法】利用羧甲基纤维素钠培养基分离纯化具有较高纤维素酶活性的菌株,根据形态学特征、生理生化特性以及16S rDNA分析对其进行分类鉴定,研究影响该菌株纤维素酶的产酶条件,以及对不同纤维素底物的降解情况。【结果】分离得到一株纤维素酶产生菌株P2,该菌株为好氧的革兰氏阳性细菌,生长温度范围20-50℃(最适温度37℃),pH范围6.0-9.0(最适pH7.0),NaCl浓度范围0%-15%(最适2%NaCl),培养24h达到产酶高峰。16S rDNA基因序列分析显示,菌株P2与解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)NBRC15535相似性为99.66%。该菌株对四种纤维素底物(滤纸、脱脂棉、秸秆、竹纤维)均有不同程度的降解,内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和总酶活具有不同的酶活变化。【结论】本研究首次从大熊猫粪便中分离出了好氧纤维素分解菌,并鉴定为解淀粉芽胞杆菌,对上述四种纤维结构均有一定的破坏和分解作用,为进一步研究大熊猫竹纤维消化机制提供了菌源。     

镰刀菌Q7-31T内切葡聚糖酶Egn20的分离纯化鉴定及酶学特性

摘要:【目的】从镰刀菌Q7-31T燕麦秸秆诱导发酵的粗酶液中分离、纯化并鉴定内切葡聚糖酶,研究其酶学特性。为丰富和完善镰刀菌的酶系信息提供理论支持。【方法】以燕麦秸秆为碳源诱导发酵培养菌株,采用Sephacry S-100凝胶柱层析和DEAE琼脂糖弱阴离子交换柱层析对粗酶液进行分离纯化得到内切葡聚糖酶Egn20,随后对其进行了酶学性质分析和串联质谱鉴定。【结果】分离纯化得到内切葡聚糖酶Egn20,其分子量为55.37 kDa,等电点为7.44;酶学特性结果表明:Egn20对羧甲基纤维素的最适反应温度为40 ℃,最适pH为6.0,该酶在45 ℃和弱酸性环境下较稳定,Fe2+对其有激活作用,Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+和K+抑制该酶活性,Hg2+使该酶失活;酶学特性和串联质谱鉴定的结果表明Egn20属于GH7家族。【结论】从镰刀菌Q7-31T粗酶液中分离纯化得到内切葡聚糖酶Egn20,并对其进行了酶学性质的研究和串联质谱鉴定,结果表明Egn20为GH7家族内切葡聚糖酶。本研究为丰富和完善镰刀菌的酶系信息提供了理论和数据支持。     

低温生淀粉糖化酶菌株RS01分离及其酶学性质

自渤海湾海泥中分离得到一株产低温生淀粉糖化酶能力较强的菌株RS01,经形态学、生理生化特性及16S rRNA分析将其鉴定为气单胞菌属。对该菌株产的低温生淀粉糖化酶酶学性质进行初步研究,结果表明其最适酶反应温度为30℃,酶的热稳定性比较差,最适pH为5.4,经TLC鉴定酶解产物中有葡萄糖,表明该分离菌株具有产低温生淀粉糖化酶的能力。     

几丁质酶产生菌筛选鉴定及产酶性能研究

从土壤样品中筛选得到一株高产几丁质酶菌株C65-2,经形态学观察和18S rDNA序列测定,鉴定为Aspergillus fumigatus,对产酶培养基进行初步优化,测得最高酶活可达6.9U/ml,酶活力较优化之前提高了210%。酶学性质研究表明该几丁质酶分子量约为20kDa,酶在60℃下保温50min酶活降为0,最适酶反应温度是55℃,酶反应最适pH为7.0,Mg2+,Cu2+对酶反应有促进作用,Fe3+对酶反应有抑制作用。     

产β-甘露聚糖酶内生菌的筛选及酶学特性分析

采用富集培养的方法从黄豆种子中分离出17株内生菌菌株, 利用刚果红染色法筛选出3株产β-甘露聚糖酶的内生菌。摇瓶培养并分别测定其酶活力, 其中一株酶活力较高, 达54.59 U/mL。经生理生化性质测定及16S rDNA序列分析, 鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。酶学性质分析发现, 该酶最适作用温度和pH分别为30 °C?50 °C和7.0, 在50 °C保温2 h酶活仍保留68%, pH 5.0?9.0条件下保温1 h酶活仍保留64%以上; Zn2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、K+对该酶有激活作用, 其中以Ca2+的激活作用最为明显, 使酶活提高了31%, Mn2+和EDTA对该酶有抑制作用。     

一株产胆固醇氧化酶的不动杆菌的筛选鉴定及特性研究

目的：筛选鉴定产胆固醇氧化酶的菌株并对其酶的性质及发酵条件进行初步的研究。方法：利用唯一碳源的胆固醇平板筛选,酶活测定比较得酶活力最高的菌株;生理生化试验结合16S rDNA序列分析鉴定其种属,单因素及正交实验优化培养基及发酵条件。结果：所得菌株H4与产不动杆菌（Acinetobacter）有最近的亲缘关系,其胆固醇氧化酶作用的最适温度和pH分别为37℃和8.0,金属离子Mg2＋、Zn2＋、Fe2＋对该酶具有一定激活作用,菌株产酶的最适培养基为（g/L）：胆固醇1.5,蔗糖5,蛋白胨7,硝酸铵3,吐温1.0,pH7.5;最适培养条件为33℃,15mL培养基/100mL三角瓶,摇床培养（200r/min）48h,优化后发酵液酶活达135.8U/L。结论：获得了1株产胆固醇氧化酶的菌株H4,并初步鉴定为不动杆菌（Acinetobacter）。