组蛋白乙酰化参与NO信号激活人肝细胞内源FⅧ重表达的研究

通过对组蛋白乙酰化和去乙酰化的研究,探索NO信号激活LO2细胞中凝血因子FⅧ(coagulation factorⅧ,FⅧ)重表达的分子机制。建立L-精氨酸激活人肝细胞LO2内源凝血因子FⅧ重表达的分子细胞模型。取对数生长期人类永生化肝细胞LO2随机分为:正常组和L-精氨酸组、组蛋白乙酰化抑制剂组和组蛋白去乙酰化抑制剂组。分别培养0、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h。用RT-PCR方法检测各组中人FⅧ基因的转录水平。构建核转录因子(nuclear factor k B,NF-k B1)flag标签质粒,转染LO2细胞,用染色质免疫共沉淀(Ch IP)检测FⅧ基因启动子区域组蛋白乙酰化水平。实验显示L-精氨酸组和组蛋白去乙酰化抑制剂组中有人FⅧ基因m RNA的转录,正常组和组蛋白乙酰化抑制剂组没有出现FⅧ基因m RNA的转录。Ch IP检测NF-k B1与FⅧ基因启动子区域结合时,FⅧ基因启动子区域组蛋白乙酰化水平提高。上述研究表明组蛋白乙酰化抑制剂能取消LO2细胞中内源人FⅧ基因的上调,而组蛋白去乙酰化抑制剂能协同LO2细胞中内源人FⅧ基因的上调。NO信号在LO2细胞中通过调节FⅧ基因启动子区域组蛋白乙酰化,招募转录因子NF-k B1激活人FⅧ基因的重表达。     

番茄JMJ524基因调控SlGLD1的DNA甲基化分析

旨在分析番茄JMJ524基因如何通过影响Sl GLD1的DNA甲基化程度来调控其表达,从而导致番茄的赤霉素不敏感的矮化。利用生物信息学和BSP(Bisulfite sequencing PCR)分析JMJ524抑制系和野生型的Sl GLD1的DNA甲基化程度。结果显示,分离出Sl GLD1的启动子序列,发现其启动子区域含有3个GA响应的顺式作用元件;Sl GLD1的启动子区域和编码区的DNA是高度甲基化的,而且在不同组织部位和突变体中的甲基化模式是不一样的;在基因的编码区发现了两个GC岛,推测Sl GLD1的甲基化可能发生在基因的编码区;针对这两个GC岛进行的BSP分析结果表明:Sl GLD1的这两个区段的DNA Cp G是高度甲基化的,而且在JMJ524抑制系中,DNA的整体甲基化,特别是Cp G甲基化程度显著低于野生型对照M82。JMJ524抑制表达导致了Sl GLD1的基因甲基化程度降低,从而激活这个基因的表达,可能是导致番茄植株矮化的一个因素。     

人类基因组DNA甲基化数据分析的研究现状

作为人类基因组最为典型的表观遗传现象,DNA甲基化在多种关键生理活动中扮演重要角色.系统分析基因组尺度的DNA甲基化概况意义重大.从Cp G岛等基本定义出发,阐述了高通量DNA甲基化的检测技术以及针对芯片技术与下一代测序技术的低水平数据处理方法;重点对比了基于机器学习理论对Cp G位点及Cp G岛甲基化水平的预测算法,以及所利用的特征对预测效果的影响与发展趋势;并对DNA差异甲基化在组织特异性、癌症等多种疾病中的计算分析进行了全面的综述.     

重组人凝血因子Ⅷ表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的:构建含有B区缺失型(△760aa-1639aa)人凝血因子Ⅷ(B domain-deleted human FⅧ,BDDhFⅧ)的真核表达质粒,转染HepG2细胞使其稳定表达人凝血因子Ⅷ。方法:将BDDhFVIII基因片段插入pcDNA4/v5-his空载体中构建重组真核表达质粒,测序正确后电转入HepG2细胞,经Ni-NTA纯化,利用Western blot检测凝血因子Ⅷ在HepG2细胞中的表达,持续培养获得稳定表达BDDhFⅧ蛋白的细胞株。结果:经限制性酶切和测序鉴定均证实重组真核表达质粒pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ成功构建,在转染HepG2细胞后,Western blot检测证实人凝血因子Ⅷ可以在HepG2细胞中正确表达。结论:成功构建了人凝血因子Ⅷ的稳定细胞株,并能在HepG2细胞表达目的蛋白。     

亚硫酸氢钠测序法检测水稻FIE基因CpG岛甲基化状态

建立了适用于水稻基因组特定基因甲基化检测的亚硫酸氢钠测序法,并利用此方法对FIE2A基因CpG岛部分片段的甲基化差异进行了研究。采用CTAB法提取水稻叶片和胚乳细胞的基因组DNA,经亚硫酸氢钠化学修饰后,针对已修饰的FIE基因序列设计特异引物并结合巢式PCR扩增,TA载体克隆、测序,最后对测序结果进行分析。结果表明巢式PCR能够增加特异性产物的产生,FIE基因CpG岛在对称的CG和CNG位点甲基化水平较高,而在非对称CNN位点甲基化水平最低,此外在叶片中的平均甲基化水平较高。由此表明本研究建立的亚硫酸氢钠测序法适用于水稻基因组特定基因甲基化状态的检测。     

小鼠骨髓细胞中p16和Ralb基因启动区CpG岛的甲基化位点分析

抑癌基因p16和白血病致癌因子Ralb与白血病的发生密切相关,其启动子区CpG岛的甲基化对基因表达具有重要作用.本文旨在分析p16、Ralb基因启动子区CpG岛甲基化位点信息,并比较这两个基因在小鼠骨髓细胞和原代培养的骨髓细胞中甲基化状态的差异.运用"MethPrimer"软件预测p16、Ralb基因启动子区的CpG岛,设计甲基化特异性引物.利用重亚硫酸盐测序法(BSP)检测甲基化位点信息.结果显示,p16有1个CpG岛,岛上21个CpG位点全部未发生甲基化;Ralb有2个CpG岛,CpG岛1上的5个CpG位点全部呈甲基化状态,而CpG岛2上的17个CpG位点全部呈非甲基化状态,且小鼠骨髓细胞和体外原代培养的骨髓细胞中两基因的甲基化状态一致.表明p16、Ralb基因甲基化状态未受外界培养条件的影响而改变,提示在与两基因甲基化相关的研究中体外试验可替代体内试验.     

人TCF7L2基因启动子生物信息学分析

[目的]探讨人TCF7L2基因启动子特征。[方法]从UCSC数据库获得人TCF7L2基因5'调控区2 000 bp序列,利用多种在线软件对启动子、转录因子结合位点、Cp G岛、SNP等进行分析。[结果]5'调控区2 000 bp序列正义链上至少存在5个潜在的启动子,其中-242～-192 bp、-853～-803 bp之间可能包含核心启动子。查找到1个TATA盒,存在1个长度为499 bp的Cp G岛。Ali Baba2. 1、PROMO和JASPAR软件分别预测到241、944、1 035(正义链)个转录因子结合位点。利用conreal程序在人和小鼠TCF7L2基因启动子保守区域内预测到207个共同的转录因子结合位点,涉及到66种转录因子。启动子区发现2个SNP位点。[结论]对人TCF7L2基因启动子进行了生物信息学分析,获得了启动子特征。     

焦磷酸测序法检测OCT4启动子在大鼠骨髓源性肝干细胞分化中的甲基化变化

骨髓间充质干细胞具有分化成为肝细胞的潜能已得到证实,但其分化的调控机理还不完全清楚。通过检测大鼠骨髓源性肝干细胞(rat bone marrow-derived liver stem cells,RBMLSCs)诱导分化为肝细胞过程中OCT4启动子甲基化的变化,来探讨启动子甲基化调控细胞分化的机制。RBMLSCs用25μg/L重组人肝细胞生长因子和0.1 nmol/L地塞米松进行诱导,在诱导之后不同时间点(0 d,7 d,14 d)提取细胞的DNA及RNA。用荧光定量PCR法检测白蛋白(albumin,Alb)和OCT4的m RNA表达水平,应用焦磷酸测序法定量检测OCT4基因的启动子中4个Cp G位点的甲基化变化。结果表明:在RBMLSCs分化过程中,Alb m RNA持续增高(P0.05),但OCT4 m RNA表达在7 d及14 d明显减少(P0.005);同时OCT4启动子上游的Cp G 1-2-3甲基化频率显著上升(P0.001),但Cp G 4甲基化无明显变化。这些结果说明OCT4启动子高甲基化可能导致其m RNA表达减少,RBMLSCs多能性消失,但Cp G 4并不参与这一分化调控过程。     

水稻愈伤组织形成过程中甲基化对OsMAPK2的表达调控

利用MSAP方法从经过5-azaC处理和未处理的水稻愈伤组织中获得了1个存在甲基化位点的片段。测序后比对分析表明,该片段为水稻MAPK家族OsMAPK2基因的5′端区域。该基因5′端区域有一个CpG岛,与拟南芥AtMAPK12基因序列高度相似。利用实时定量PCR和HpaII-McrBC PCR分析了在水稻芽段受生长素刺激后形成愈伤组织过程中OsMAPK2基因的表达与甲基化的关系。结果表明:该基因表达量与基因5′端甲基化水平相对应,甲基化调控基因的表达。在愈伤组织形成过程中2.0mg/L的2,4-D诱导该基因5′端区域去甲基化,使基因表达,而长时间(100h)的诱导后或导致重新甲基化,基因表达量降低;低浓度的2,4-D(0.5和1.0mg/L)也可以产生同样的趋势,但是基因的表达量低于2.0mg/L的2,4-D的诱导;高浓度的2,4-D(5.0mg/L)可以在较短的时间内完成对基因的诱导和抑制。     

HLA-DRB5基因甲基化与维吾尔族饲鸽者肺相关性研究

目的:探讨HLA-DRB5基因甲基化与维吾尔族饲鸽者肺的相关性。方法:根据纳入及排除标准收集资料,总纳入60例,其中饲鸽者肺组20例、阴性对照组(饲鸽未患病组)20例及正常对照组(健康体检组)20例,对纳入者的全血标本进行DNA提取、亚硫酸氢盐转化、PCR扩增、体外转录和RNase A特异性酶切,并行基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术检测HLA-DRB5基因甲基化情况。结果:检测到HLA-DRB5片段的18个Cp G位点,Cp G1、Cp G2/3/4、Cp G5/6/7、Cp G8/9/10、Cp G11/12/13、Cp G14、Cp G16/17/18/19,各个位点在三组样本中的甲基化率比较差异不具有统计学意义(P0.05);结论:未发现HLA-DRB5基因甲基化与维吾尔族饲鸽者肺之间存在关联。     

牛早期胚胎发育中AID基因的表达及其调节区DNA甲基化的动态变化北大核心CSCD

以具有DNA主动去甲基化作用的活化诱导胞苷脱氨酶(Activation-induced cytidine deaminase,AID,亦称为AICDA)基因为研究对象,检测其在牛卵母细胞及体外受精胚胎发育不同阶段的表达变化及其调节方式,揭示细胞重编程分子机制。应用Real-time PCR、BSP(Bisulfite Sequencing PCR)和免疫荧光化学等方法分析DNA甲基化对牛早期胚胎发育中AID基因表达的影响。结果显示,AID基因在牛早期胚胎发育中受DNA甲基化的调控,AID基因的T-DMR(tissue-dependent and differentially methylated region)位于其转录起始位点-88 bp--431 bp。在牛卵母细胞成熟过程中,T-DMR第2和第3号Cp G位点的DNA甲基化明显去除,而其他位点都未发生变化。卵母细胞在成熟过程中AID基因的积累与DNA甲基化状态变化相关。在牛体外受精胚发育早期的各阶段,尽管AID基因的表达不同,但AID基因T-DMR除第2和第3号CpG位点一直都维持去甲基化状态外,其他位点始终维持甲基化状态。推测其表达的变化可能是胚胎基因组激活有关。以上研究表明,AID基因T-DMR的低甲基化与其表达存在一定的相关性。通过免疫荧光检测发现,从卵母细胞成熟期到桑椹胚期,AID蛋白都是均匀分布于细胞核和细胞质中。而囊胚时期大量AID蛋白集中于内细胞团,这可能对于内细胞团多能性的维持起重要作用。综上所述,牛卵母细胞成熟中积累的AID作用于受精过程,其启动子区的DNA去甲基化与AID基因的表达有关,胚胎基因组激活后AID基因的表达可能与胚胎发育有关。     

牛早期胚胎发育中AID基因的表达及其调节区DNA甲基化的动态变化

以具有DNA主动去甲基化作用的活化诱导胞苷脱氨酶(Activation-induced cytidine deaminase,AID,亦称为AICDA)基因为研究对象,检测其在牛卵母细胞及体外受精胚胎发育不同阶段的表达变化及其调节方式,揭示细胞重编程分子机制。应用Real-time PCR、BSP(Bisulfite Sequencing PCR)和免疫荧光化学等方法分析DNA甲基化对牛早期胚胎发育中AID基因表达的影响。结果显示,AID基因在牛早期胚胎发育中受DNA甲基化的调控,AID基因的T-DMR(tissue-dependent and differentially methylated region)位于其转录起始位点-88 bp--431 bp。在牛卵母细胞成熟过程中,T-DMR第2和第3号Cp G位点的DNA甲基化明显去除,而其他位点都未发生变化。卵母细胞在成熟过程中AID基因的积累与DNA甲基化状态变化相关。在牛体外受精胚发育早期的各阶段,尽管AID基因的表达不同,但AID基因T-DMR除第2和第3号CpG位点一直都维持去甲基化状态外,其他位点始终维持甲基化状态。推测其表达的变化可能是胚胎基因组激活有关。以上研究表明,AID基因T-DMR的低甲基化与其表达存在一定的相关性。通过免疫荧光检测发现,从卵母细胞成熟期到桑椹胚期,AID蛋白都是均匀分布于细胞核和细胞质中。而囊胚时期大量AID蛋白集中于内细胞团,这可能对于内细胞团多能性的维持起重要作用。综上所述,牛卵母细胞成熟中积累的AID作用于受精过程,其启动子区的DNA去甲基化与AID基因的表达有关,胚胎基因组激活后AID基因的表达可能与胚胎发育有关。     

宫颈癌患者血浆和组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态的研究

为了检测宫颈癌患者血浆和组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态, 以找到无创伤性诊断宫颈癌的新指标, 选取151例宫颈癌患者的血浆和30例患者的宫颈癌组织为研究对象,用MSP的方法检测FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态, 并对MSP产物进行克隆和测序。结果在宫颈癌患者血浆和组织中, FHIT基因5′端CpG岛甲基化率为30.46%和53.33%, 血浆和组织的总体符合率为80%。而对照中均未检测到甲基化状态。随着患者临床分期和组织学分级的增加, FHIT基因甲基化的检出率也在逐渐的增加。表明宫颈癌患者的血浆和肿瘤组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化的发生是高频事件, 使用FHIT基因作为标记可以对宫颈癌患者进行无创伤诊断和预后的评估。     

宫颈癌患者血浆和组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态的研究

为了检测宫颈癌患者血浆和组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态, 以找到无创伤性诊断宫颈癌的新指标, 选取151例宫颈癌患者的血浆和30例患者的宫颈癌组织为研究对象,用MSP的方法检测FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态, 并对MSP产物进行克隆和测序。结果在宫颈癌患者血浆和组织中, FHIT基因5′端CpG岛甲基化率为30.46%和53.33%, 血浆和组织的总体符合率为80%。而对照中均未检测到甲基化状态。随着患者临床分期和组织学分级的增加, FHIT基因甲基化的检出率也在逐渐的增加。表明宫颈癌患者的血浆和肿瘤组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化的发生是高频事件, 使用FHIT基因作为标记可以对宫颈癌患者进行无创伤诊断和预后的评估。     

癌症DNA甲基化调控位点的识别

DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰,在基因的转录调控方面具有重要的作用。异常的DNA甲基化可以导致癌症等复杂疾病发生,癌基因相关的DNA甲基化调控位点的识别对于解析癌症的发生发展机制及识别新的癌症标记具有重要意义。本研究通过整合The Cancer Genome Atlas(TCGA)的泛癌症基因组的高通量甲基化谱和基因表达谱,识别癌基因相关的DNA甲基化调控位点。对于每种癌症分批次计算Cp G位点甲基化与相关基因表达之间的相关性,并筛选调控下游基因的Cp G位点(包括强调控位点、弱调控位点和不调控位点),结果表明仅有一半的Cp G位点对下游基因具有调控作用;对癌症间共享的调控位点的分析发现不同癌症间共享的调控位点不尽相同,表明癌症特异的甲基化调控位点的存在。进一步地,对差异甲基化和差异表达基因的功能富集分析揭示了受甲基化调控的基因确实参与了癌症发生发展相关的功能。本研究的结果是对当前甲基化调控位点集的重要补充,也是识别癌症新型分子标记特征的重要资源。     

EcoRⅡ甲基化酶基因在小鼠NIH3T3细胞中的表达

CG外甲基化在哺乳动物细胞中的生物学意义仍不清楚。建立了特定位点CCWGG（W＝A／T）甲基化的哺乳动物细胞株。来自大肠杆菌的EcoRⅡ甲基化酶（催化CCWGG→CmCWGG）基因经定点诱变后重组到真核表达载体pCI－neo上,采用脂质体介导的方法将其转染小鼠NIH3T3细胞,经G418筛选获得有效表达的细胞株,酶切证实该细胞株基因组DNA上的大部分EcoRⅡ识别位点已被甲基化,PCR鉴定EcoRⅡ甲基化酶基因已稳定整合到细胞染色体上。     

NDRG2基因启动子甲基化与肺腺癌细胞中mRNA表达相关性的实验研究

目的:探讨肺腺癌细胞中NDRG2基因启动子甲基化状态及其与基因表达的关系。方法:甲基化焦磷酸测序技术检测启动子区域甲基化状态,荧光定量PCR技术检测不同药物浓度下培养细胞中NDRG2基因mRNA的表达水平,分析启动子区域甲基化与基因表达之间的关系。结果:在体外培养细胞中检测到NDRG2基因启动子区域呈现不同程度的甲基化,甲基化频率分别为肺癌A549细胞71.8%、GLC-82细胞86.1%、人脐静脉内皮ECV-304细胞36.8%、胃上皮GES-1细胞42.9%。NDRG2基因mRNA表达与其启动子甲基化程度成反比,甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)作用于细胞后,A549和GLC-82细胞中NDRG2基因的mRNA转录明显上调,至72 h差异显著(P0.05)。结论:肺腺癌细胞中NDRG2基因启动子CpG岛存在高甲基化,甲基化程度与该基因的表达具有负相关性,5-Aza-CdR能在一定程度上提高NDRG2的转录水平。     

胎盘IGF-1的表达及其DNA甲基化与IUGR的相关性分析

为探究胎盘中胰岛素样生长因子1的浓度和基因甲基化变化与宫内生长受阻(IUGR)发生的关系。选择56名正常妊娠足月分娩的产妇和新生儿为对象,其中27名IUGR患儿,29名正常出生体重儿,收集产妇及新生儿的基本信息和胎盘样本。用实时荧光定量PCR检测IGF-1 m RNA表达量,用BSP分析胎盘IGF-1基因启动子区Cp G位点的甲基化水平。IUGR组IGF-1 m RNA的ΔCT值为(7.483±1.406),对照组为(5.642±1.323),经t检验,t=3.567,p=0.001(p0.01),提示IUGR患者胎盘IGF m RNA表达低于对照组。胎盘IGF-1启动子区Cp G位点均呈高甲基化状态,两组间平均甲基化率的差异无统计学意义,但两组中男性和女性IGF-1甲基化率存在差异。IGF-1在IUGR的发生中起着重要的作用,一定水平的IGF-1对维持胎儿生长是至关重要的,其表达量的高低均与处于高甲基化状态的胎盘IGF-1的甲基化程度无关,与性别有关。     

PNPLA3在实验性非酒精性脂肪性肝病中的表达及其CpG岛甲基化状态的研究

目的:探讨PNPLA3在非酒精性脂肪性肝病中的表达水平及其Cp G岛甲基化状态,探讨PNPLA3在NAFLD发生、发展中的作用。方法:1.采用10μg/m L的油酸作用于人正常肝细胞株L02建立脂肪肝细胞模型,72 h后经油红O染色,观察正常组、脂肪肝模型组及给药组细胞内脂滴形成情况,并用荧光定量PCR检测PNPLA3在三组肝细胞中的表达情况。2.采用专用DNA提取试剂盒分别提取正常组、脂肪肝模型组、给药组细胞中DNA,经亚硫酸转化后行PCR扩增目的基因,并用焦磷酸测序方法检测不同组PNPLA3 Cp G岛中甲基化水平,探讨其在非酒精性脂肪肝中的作用。结果:1、脂肪肝模型组肝细胞PNPLA3 m RNA的表达高于正常组,经姜黄素给药后,其表达降低,差异均有统计学意义(P0.05)。2、在PNPLA3启动子区6个检测位点中,脂肪肝组位点2甲基化水平高于正常组,姜黄素给药后甲基化水平降低,差异均有统计学意义(P0.05),在其余各检测位点中甲基化水平无差异。结论:1、油红O染色后,脂肪肝模型组细胞内发现有大量红色脂滴积聚,而正常组基本上未见脂滴,姜黄素给药组脂滴较模型组减少,表明用10μg/m L的油酸诱导能成功建立体外肝细胞模型。2、PNPLA3 m RNA在肝细胞中高表达及其启动子区甲基化状态异常参与非酒精性脂肪肝发病。3、抑制肝脏PNPLA3活性或降低肝细胞PNPLA3 m RNA的表达水平可能是今后治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的一个新的治疗方法。