《Molecular Plant）文章中文摘要2009年第2卷第2期

题目：光合生物中的修复蛋白甲硫氨酸亚砜还原酶：基因组织、还原机理和生理作用（综述）摘要：甲硫氨酸（methionine）氧化成为甲硫氨酸亚砜（methionine sulfoxide,MetSO）是一个可逆反应,由两类专一催化MetSO的S-和R-非对映异构体A和B型甲硫氨酸亚砜还原酶（methionine sulfoxide reductase,MSR）催化。从细菌到人的许多生物中都发现了MSR基因。在这篇综述中,我们首次比较了从蓝藻到高等植物的光合生物中MSR基因家族的结构。     

小桐子类固醇还原酶基因Jc5β-StR的克隆和表达分析

以小桐子(Jatropha curcas L.)cDNA为模版,克隆了Jc5β-StR基因的CDS序列,并对其序列进行了生物信息学分析。序列分析表明该基因包含1 173 bp开放阅读框(ORF),编码390个氨基酸。预测其编码蛋白质的相对分子量为44.23 k D,理论等电点为5.22。Blast搜索结果及进化分析结果表明,Jc5β-StR与蓖麻5β-St R蛋白序列一致性最高(87%)且亲缘关系最近。Jc5β-StR是一个短链还原酶,该蛋白编码有一个短链还原酶家族(SDRs)的黄体酮5β还原酶(5β-POR),还含有SDRs的6个保守结构域。组织表达结果显示Jc5β-StR在小桐子根、茎、叶、花、果皮和种子中都有表达,在种子中表达量最高,且随种子发育过程表达量逐渐上升,在种子生长发育的后期(50 d)达到最高值后下降。非生物胁迫(PEG、Na Cl、低温和机械损伤)诱导下,Jc5β-StR的表达量都不同程度上调,推测其参与小桐子非生物胁迫响应。     

小桐子赤霉素20氧化酶的基因克隆及低温下表达分析

赤霉素20氧化酶是植物赤霉素生物合成的限速酶,决定有生物活性的GA1与GA4的合成量。基于先前获得的小桐子低温锻炼转录组数据,以小桐子幼苗的根为材料,采用RT-PCR技术克隆到小桐子赤霉素20氧化酶基因Jc GA20ox的c DNA序列(Gen Bank登录号KJ670150.1)。该c DNA全长1 307 bp,含有完整的开放阅读框(1 131 bp),编码376个氨基酸,分子量为43 k D,理论等电点为6.7。其推导蛋白属于2-ODD家族,包含2-酮戊二酸双加氧酶结构域(Fe2OG_OXY)。半定量RT-PCR表达分析显示,Jc GA20ox在小桐子各组织中都有表达,但表达水平具有组织特异性,在茎中表达量较高,且受低温诱导表达最显著,而在叶中表达量相对较低。     

小桐子肌醇半乳糖苷合成酶3的基因克隆及其生物信息学分析和功能初步验证

旨在研究可溶性糖在小桐子抗冷性形成中的作用机制及其相关抗冷基因工程的应用。克隆了小桐子肌醇半乳糖苷合成酶家族成员3基因(Jc GS3)的全长c DNA,序列长1 053 bp,包含完整的开放阅读框1 008 bp,编码由335个氨基酸组成的酶蛋白(理论分子量为38 k D、等电点为5.44,含有典型的Dx D基序)。对其相应基因组序列中启动子区域进行分析,鉴定到了TATA框、CAAT框、CRT/DRE低温响应元件以及ABA应答元件等。进一步将其在酵母中表达,发现该基因的表达能够显著提高其重组酵母菌的低温抵抗能力。     

小桐子JcLEA4基因克隆及表达和功能分析

LEA蛋白是一类跟抗逆性紧密相关的蛋白,在不同物种中都有大量发现。基于前期对小桐子叶片在干旱锻炼和干旱胁迫下的RNA-seq分析,本研究分离出一个LEA编码基因(XM_012232372.1),经序列分析可知该蛋白基因CDS序列全长为459 bp,编码蛋白由152个氨基酸组成。多重序列比对和进化分析显示该蛋白属于第四组典型亲水性LEA蛋白,暂命名为Jc LEA4。荧光定量PCR分析发现,幼苗叶片中Jc LEA4转录本的积累受到空气干旱胁迫和外源ABA处理的显著诱导。在酿酒酵母中异源表达分析显示,Jc LEA4的过表达提高了转基因酵母对PEG模拟干旱胁迫的存活率和生长速率,表现出增强的耐受性。本研究初步证实了Jc LEA4基因与抗旱性紧密相关,为以后小桐子的抗旱性遗传改良提供了良好的基因资源。     

植物Msr(methionine sulfoxide reductase)基因家族的研究进展

全球性气候变化使植物遭受多样的极端环境胁迫更加频繁,在这种条件下植物体积累超量的活性氧(ROS)会氧化损伤细胞内多糖、DNA、脂类和蛋白质等大分子。为了维持体内的氧化还原平衡和防止环境胁迫的破坏,植物体内进化出清除超量活性氧的系统,这其中就包括Msr(methionine sulfoxide reductase)家族酶系统。蛋白质中的蛋氨酸(Met)极易被活性氧氧化为甲硫氨酸亚砜(Met SO),从而导致相应蛋白质构型和活性的改变,幸运的是这种改变可以被Msr家族逆转。根据作用底物的不同,植物体内Msr家族可以分为A和B两个亚家族。本综述首先分析了Msr的发现历史、蛋白质特性和催化机制,其次综述了植物中Msr基因家族的组成,再次对Msr基因家族的生理功能的研究进展进行总结,最后对下一步研究做一简要展望。     

植物Msr(methionine sulfoxide reductase)基因家族的研究进展CSCD

全球性气候变化使植物遭受多样的极端环境胁迫更加频繁,在这种条件下植物体积累超量的活性氧(ROS)会氧化损伤细胞内多糖、DNA、脂类和蛋白质等大分子。为了维持体内的氧化还原平衡和防止环境胁迫的破坏,植物体内进化出清除超量活性氧的系统,这其中就包括Msr(methionine sulfoxide reductase)家族酶系统。蛋白质中的蛋氨酸(Met)极易被活性氧氧化为甲硫氨酸亚砜(Met SO),从而导致相应蛋白质构型和活性的改变,幸运的是这种改变可以被Msr家族逆转。根据作用底物的不同,植物体内Msr家族可以分为A和B两个亚家族。本综述首先分析了Msr的发现历史、蛋白质特性和催化机制,其次综述了植物中Msr基因家族的组成,再次对Msr基因家族的生理功能的研究进展进行总结,最后对下一步研究做一简要展望。     

信号蛋白中甲硫氨酸残基的可逆性氧化和甲硫氨酸亚砜还原酶

含硫氨基酸甲硫氨酸在体内易被胞内、外活性氧氧化为甲硫氨酸-R,S-亚砜。蛋白质肽链中的甲硫氨酸残基被氧化后,蛋白活性发生显著改变,如钙调素与钙调素结合蛋白亲和力的下降、钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的激活、钾离子通道ShC/B失活动力学的改变。多数生物都存在一个msrA基因和1～3个msrB基因,编码两种序列和结构都明显不同的酶:甲硫氨酸亚砜还原酶A(MsrA)和甲硫氨酸亚砜还原酶B(MsrB),分别还原甲硫氨酸-S-亚砜和甲硫氨酸-R-亚砜。两种酶的催化机制基本相同,其活性中心结构互为镜像。两种还原酶分布于体内不同器官及各种亚细胞结构。对于MsrA活性的研究,已有30年的历史,最初主要集中在低等生物,已发现MsrA对于延缓衰老和神经退行性疾病具有重要作用,也是致病菌的主要毒力因子。最近10年对MsrB也进行了系统研究,并取得了重要进展。人们正在逐渐认识到这些酶在细胞信号蛋白分子活性调节中的重要作用。     

小桐子MYB基因家族的鉴定及JcMYB308基因的克隆与低温表达分析

MYB转录因子家族参与植物生长发育及对环境胁迫的应答等过程。该实验基于小桐子基因组数据库,对MYB基因家族进行鉴定,克隆了小桐子Jc MYB308基因,并对其功能结构域、系统进化、基因结构及低温表达特性进行了分析。结果表明,小桐子全基因组共鉴定到213个MYB基因家族成员,聚类为6个亚家族。克隆的Jc MYB308基因片段长度为713 bp,基因结构具有较高的保守性,均含有两个外显子,进化树显示其与同属大戟科的蓖麻亲缘关系最近,序列一致性为62.7%。q RT-PCR表达分析表明,小桐子Jc MYB308基因的表达存在组织表达特异性,在根中表达量较高,而在叶片中表达量相对较低,在根与茎中低温胁迫24 h时达到最大表达量。     

麻疯树G蛋白γ亚基JcAGG3基因的克隆及表达分析

从麻疯树c DNA中克隆到一个与拟南芥AGG3同源的基因,命名为Jc AGG3。该基因开放阅读框为834bp,编码277个氨基酸,软件预测等电点为8.61,分子质量为30.514k Da。亚细胞定位预测显示其定位于细胞质膜上。在该基因的顺势作用元件上发现了与胚乳发育、激素调节、光响应和逆境胁迫相关的启动元件。荧光定量PCR(q PCR)检测发现,Jc AGG3在根、茎、叶和种子中均有表达,在发育中的种子中表达量最高,幼叶中的表达量显著高于老叶,在茎中只检测到极微量的表达;对麻疯树的幼苗进行黑暗处理后Jc AGG3基因表达显著下调,脱落酸(ABA)和干旱胁迫处理下Jc AGG3表达量显著增加。     

高羊茅春化基因FeVRN2的克隆及其在非生物胁迫下的表达

VRN2基因是受春化作用负调控的开花抑制子。为揭示非生物胁迫下高羊茅(Festuca elata)春化基因VRN2的分子调控机制,本研究以高羊茅为实验材料,采用c DNA末端快速扩增技术,克隆得到VRN2基因全长c DNA序列,命名为Fe VRN2。Fe VRN2基因c DNA全长为1 219 bp,具有一个完整的长度为657 bp的开放阅读框,编码蛋白质产物长度为218个氨基酸,并包含一个CCT保守结构域。同源性分析表明Fe VRN2与禾本科植物圆锥小麦(Triticum turgidum)、节节麦(Aegilops tauschii)、山羊草(Aegilops speltoides)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、大麦(Hordeum vulgare subsp.vulgare)的亲缘关系非常近。荧光定量PCR结果显示:Fe VRN2基因在高羊茅叶片中的表达受高温、干旱与高盐胁迫特异诱导,说明该基因参与了高羊茅对高温、干旱与高盐胁迫的适应性调控。     

橡胶树白粉菌MAT相关基因(STE2基因)的克隆及表达分析

以橡胶树白粉菌(Oidium heveae B.A.Steinm)为材料,根据同源性克隆得到一个MAT相关基因的DNA和c DNA序列,命名为OH-MAT2。生物信息学分析表明,这个基因DNA全长为964 bp,具有一个921 bp的完整开放阅读框(ORF),编码307个氨基酸。其编码的蛋白质分子量为35 584.1,等电点为9.78,且是稳定的疏水性蛋白质。氨基酸序列分析该蛋白质具有STE2家族的保守结构域。结构预测表明该蛋白质主要有α-螺旋、β-折叠及转角构成。相对荧光定量显示该基因在侵染不同时段有表达,且差异明显。     

苎麻转录因子基因BnMYB3的克隆及表达分析

该研究采用RACE技术,从苎麻中克隆到1个MYB转录因子基因(BnMYB3)的全长cDNA序列(GenBank登录号为MF741320.1)。生物信息学分析表明,BnMYB3基因cDNA全长为1 216bp,包括900bp编码区序列,编码含有299个氨基酸的蛋白,其分子量约为33.63kD,理论等电点为9.16;该蛋白质含有2个典型的MYB结构域,属于R2R3-MYB。从苎麻基因组中克隆了BnMYB3基因1 681bp启动子序列,该序列包含ABRE、GARE-motif、CGTCA-motif和TGACG-motif等多个逆境相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,BnMYB3为组成型表达基因,在茎和叶中的表达量显著高于根;BnMYB3基因能够响应镉胁迫,且表达量随镉胁迫处理时间和处理浓度的增加而显著上升。     

莲藕CBF2基因cDNA克隆及序列分析

目的:克隆莲藕CBF2基因的c DNA全长并对其进行序列分析。方法:根据已有的ESTs序列,设计3'和5'端RACE引物,运用RACE技术克隆莲藕CBF2基因c DNA全长。结果:克隆得到全长为1 560bp c DNA序列,其中包括350bp的3'非编码区和124bp的5'非编码区及一个1 086 bp的完整开放阅读框,编码362个氨基酸,序列末端有poly(A)尾。其核苷酸序列与NCBI数据库中大豆DREB2C/CBF2、马铃薯DREB2A/CBF2、黄瓜DREB2A/CBF2及花生DREB2A/CBF2的同源性较高,分别为83%、77%、76%和76%,因此把该基因命名为Lr CBF2。氨基酸序列进化树分析表明该基因与葡萄相关基因亲缘关系较近。结论:分离克隆得到莲藕CBF2基因,为进一步研究莲藕中该基因的功能奠定基础。     

黄花苜蓿SKIP同源基因cDNA的克隆与生物信息学分析

本研究利用RT-PCR方法从野生黄花苜蓿中克隆得到一个编码pre-m RNA剪切因子SKIP同源基因的c DNA片段,命名为Mf SKIP。对克隆片段的序列分析表明,该c DNA片段全长2 256 bp,包含一个1 836 bp的开放阅读框,预测编码一条含611个氨基酸的多肽,分子量约为69.1 k D,理论等电点8.78。对蛋白保守结构域的分析显示Mf SKIP具有SNW/SKIP蛋白特有SKIP的S-N-W-K-N序列,与水稻SKIP(NP_001048184.1)同源性高达85%。生物信息学分析表明,Mf SKIP属于定位在细胞核内的不含跨膜结构域且不含信号肽的亲水性蛋白,二级结构主要由无规则卷曲结构组成。系统发育分析表明,野生黄花苜蓿Mf SKIP蛋白与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的Mt SKIP、鹰嘴豆(Cicer arietinum)Ca SKIP亲缘关系较近。本研究成功克隆野生黄花苜蓿Mf SKIP基因全长c DNA片段,为研究pre-m RNA剪切因子在黄花苜蓿响应非生物逆境胁迫应答中的作用奠定基础,并为抗逆牧草新品种培育提供候选基因。     

红树植物桐花树 E F1 A 基因的克隆与表达分析

通过 RACE 方法克隆到桐花树(Aegiceras corniculatum)的一个延伸因子基因, 命名为 AcEF1A(GenBank 登录号:KC416649)。该基因的 cDNA 全长 1 778 bp, CDS 为 1 350 bp, 编码 449 个氨基酸。多序列比对结果表明该氨基酸序列与琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)EF1A 的氨基酸序列高度相似(97.7%)。基因表达分析结果显示 AcEF1A 在茎尖中的表达量最高,叶片中的表达量次之, 根中的表达量最低。低温、高盐、干旱和重金属 Cd 胁迫下, 桐花树叶片中 AcEF1A 基因的表达水平有不同程度的上调。这些结果表明 AcEF1A 基因可能参与了植物的生长发育过程及逆境响应过程。     

小桐子JcACBP基因克隆和序列分析

以小桐子(Jatropha curcas)cDNA为模板,克隆了酰基辅酶A结合蛋白(Acyl-CoA-binding Protein)基因(JcACBP)的CDS序列,对其序列进行了生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR方法,研究了JcACBP基因在小桐子不同器官和果实生长发育阶段的表达模式。结果显示:JcACBP基因完全阅读框(coding sequence,CDS)全长279bp,编码92个氨基酸。预测其编码蛋白质的分子量为10.30kD,具有ACBP家族典型的结构域。JcACBP基因推测氨基酸与油桐(Vernicia fordii,AFZ62125)的亲缘关系最近(96%)。JcACBP基因在小桐子根、茎、叶、花、发育中的胚及果实等组织中都有表达,其中在花后40d的种子中表达最高,其次是果皮,而在根中表达较少;在果实发育过程中的表达与果实油脂积累的变化趋势基本一致。     

小桐子SnRK1蛋白激酶α亚基基因的克隆及原核表达分析

植物蔗糖非发酵-1型相关蛋白激酶1(Sucrose non-fermenting-1 related protein kinase 1,SnRK1)与酵母SNF1及哺乳动物AMPK同属进化上保守的SNF1蛋白激酶家族,参与响应由胞内低能量/低糖状态所引起的信号转导过程。基于小桐子基因组数据,利用生物信息学方法鉴定到小桐子SnRK1蛋白激酶α亚基基因,并克隆到该基因的全长cDNA序列,命名为JcSnRK1α。结果表明,该cDNA序列全长1 700 bp,完整开放阅读框1 545 bp,编码514个氨基酸,分子量为58.8 kD,理论等电点为8.57。基因结构显示,其包含11个外显子与10个内含子。具有包含T-loop区域的激酶结构域、自抑制调控结构域UBA及激酶相关结构域KA1。另外,在该基因启动子序列中鉴定到TATA框、CAAT框及响应高温、低温、干旱、创伤、赤霉素等应答元件。qRTPCR分析显示,小桐子JcSnRK1α基因具有器官表达特异性,在茎与根中表达量较高,而在叶片中表达量相对较低,同时,在茎与根中都属于低温诱导表达基因,分别在低温胁迫3 h与0.5 h达到最大表达量,较对照提高2.04与3.16倍。构建其原核表达载体pGEX-4T-1-JcSnRK1α,并在Rosetta中诱导表达,得到84.8 kD的蛋白条带,与理论融合蛋白的分子量一致。本研究为开展小桐子JcSnRK1α基因的功能鉴定以及其在信号转导与逆境应答中的机制奠定了基础。     

火把梨谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆与表达

依据火把梨编码谷胱甘肽S-转移酶(GST)的EST序列设计基因特异引物,采用快速扩增cDNA末端技术,从云南火把梨中克隆到一个新的GST基因的全长cDNA序列。该基因被命名为PpGST(GenBank登录号为HQ889136)。PpGST全长cDNA为1 177bp,具有130bp 5′-UTR、696bp ORF以及351bp 3′-UTR,编码含231个氨基酸的蛋白质。与已知植物GSTs家族成员间的氨基酸序列聚类分析将PpGST聚为zeta类GST。RT-PCR分析显示,PpGST在火把梨光照的果皮和没有光照的果皮中大量表达,并且表达强度不受光照时间的影响,而在幼嫩叶片中没有表达。研究结果暗示在果皮中大量表达的PpGST可能参与维持火把梨果实发育过程中的氧化还原平衡及应答逆境胁迫。