油茶CoSAD基因载体的构建、鉴定及功能分析

为揭示油茶( Camellia oleifera Abel)硬脂酰-ACP脱饱和酶( SAD)基因(即CoSAD基因)的功能,构建了该基因的原核表达载体pET28b-CoSAD、植物表达载体pBI121-CoSAD和RNA干扰载体pBI121-CoSAD RNAi,并采用PCR扩增及双酶切方法对3类载体进行鉴定;在此基础上,对原核表达载体中的CoSAD基因进行诱导表达分析,并对pBI121-CoSAD转化的拟南芥〔Arabidopsis thaliana ( Linn.) Heynh.〕sad突变体植株和pBI121-CoSAD RNAi转化的拟南芥野生型植株进行转基因鉴定和主要脂肪酸成分含量分析。 PCR扩增和双酶切结果显示：从 pET28b-CoSAD、pBI121-CoSAD和pBI121-CoSAD RNAi 载体的阳性克隆中均可获得目的条带,表明这3类载体均构建成功;用1 mmol·L-1 IPTG分别诱导0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 h,CoSAD基因均能够在pET28b-CoSAD转化的大肠杆菌BL21感受态细胞中正常表达,能够获得与预测结果相符的相对分子质量约47000的特异目的蛋白条带,且蛋白活性随诱导时间的延长而升高。从pBI121-CoSAD转化的拟南芥突变体植株和pBI121-CoSAD RNAi转化的拟南芥野生型植株中也均可扩增出目的条带。 GC-MS分析结果显示：与拟南芥野生型植株相比,其突变体植株的硬脂酸和棕榈酸含量较高、油酸和棕榈油酸含量较低;但突变体植株经pBI121-CoSAD转化后,硬脂酸和棕榈酸含量降低而油酸和棕榈油酸含量提高;野生型植株经过pBI121-CoSAD RNAi转化后,硬脂酸和棕榈酸含量提高、油酸和棕榈油酸含量降低,表明pBI121-CoSAD转化能够促进拟南芥sad突变体植株体内饱和脂肪酸向不饱和脂肪酸转化,而pBI121-CoSAD RNAi转化对拟南芥SAD基因的表达有明显的抑制作用,这2种重组质粒均可影响拟南芥植株的脂肪酸含量。研究结果表明：油茶CoSAD基因具有调控饱和脂肪酸(硬脂酸和棕榈酸)向不饱和脂肪酸(油酸和棕榈油酸)转化的功能,对茶油的脂肪酸组成具有关键的调控作用。     

转HSl^prol基因番茄植株的获得

目的：为了减少根结线虫对番茄的危害,研究并获得转抗线虫基因HSl^prol。番茄植株。方法：在鉴定表达载体之后,采用CaCl2法制作农杆菌EHAl05感受态细胞,然后用冻融法将HSl^prol基因转入农杆菌中。通过农杆菌介导法将HSl^prol基因导入无菌番茄外植体中,获得抗根结线虫转化再生植株。用卡那霉素筛选到再生植株后,提取抗性芽的基因组,利用设计好的引物进行PCR鉴定。结果与结论：目的基因已整合到番茄基因组中,获得了转HSl^prol基因番茄植株。     

转HS1prol基因番茄植株的获得

目的为了减少根结线虫对番茄的危害,研究并获得转抗线虫基因HS1prol番茄植株.方法在鉴定表达载体之后,采用CaCl2法制作农杆菌EHA105感受态细胞,然后用冻融法将HS1prol基因转入农杆菌中.通过农杆菌介导法将HS1prol基因导入无菌番茄外植体中,获得抗根结线虫转化再生植株.用卡那霉素筛选到再生植株后,提取抗性芽的基因组,利用设计好的引物进行PCR鉴定.结果与结论目的基因已整合到番茄基因组中,获得了转HS1prol基因番茄植株.     

转HS1~(pro1)基因番茄植株的获得

目的:为了减少根结线虫对番茄的危害,研究并获得转抗线虫基因HS1pro1番茄植株。方法:在鉴定表达载体之后,采用CaCl2法制作农杆菌EHA105感受态细胞,然后用冻融法将HS1pro1基因转入农杆菌中。通过农杆菌介导法将HS1pro1基因导入无菌番茄外植体中,获得抗根结线虫转化再生植株。用卡那霉素筛选到再生植株后,提取抗性芽的基因组,利用设计好的引物进行PCR鉴定。结果与结论:目的基因已整合到番茄基因组中,获得了转HS1pro1基因番茄植株。     

抗冻蛋白(afp)基因表达载体的构建及对香蕉胚性细胞悬浮系的转化

通过PCR从‘京都七寸人参'胡萝卜基因组DNA中扩增抗冻蛋白基因,测序结果表明该基因的核苷酸序列与从宁夏‘吴忠'胡萝卜中克隆的完全一致。先后将获得的胡萝卜afp基因克隆和亚克隆至pMD18-T和pBI121,构建植物表达载体pBI121-afp。通过冻融法将pBI121-afp导入根癌农杆菌EHA105中。以香蕉栽培品种‘北大矮蕉'的胚性细胞悬浮系为受体,采用农杆菌介导法将胡萝卜afp基因导入其中,然后在Kanamycin的选择压力下通过体细胞胚发生途径进行植株再生。共获得抗性再生植株9株,其中两株经PCR检测呈阳性,可初步确定目的基因已经整合到这两株转基因香蕉植株的基因组中。     

RNAi载体导入黄瓜的遗传转化体系

以黄瓜(Cucumis sativus)子叶和子叶节为外植体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法建立黄瓜遗传转化体系并进行优化,将南方根结线虫(Meloidogyme incognita)寄生相关基因的RNA干扰载体导入黄瓜,通过潮霉素(Hyg)浓度梯度筛选得到99株潮霉素抗性植株。经PCR和Southern-blot检测,获得10株目的基因以单拷贝形式整合的转基因黄瓜,子叶和子叶节的Southern-blot阳性率分别为13.9%和6.9%。该研究建立并优化了RNA干扰载体导入黄瓜的高效遗传转化体系,成功获得了转基因黄瓜植株。     

RNAi载体导入黄瓜的遗传转化体系北大核心CSCD

以黄瓜(Cucumis sativus)子叶和子叶节为外植体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法建立黄瓜遗传转化体系并进行优化,将南方根结线虫(Meloidogyme incognita)寄生相关基因的RNA干扰载体导入黄瓜,通过潮霉素(Hyg)浓度梯度筛选得到99株潮霉素抗性植株。经PCR和Southern-blot检测,获得10株目的基因以单拷贝形式整合的转基因黄瓜,子叶和子叶节的Southern-blot阳性率分别为13.9%和6.9%。该研究建立并优化了RNA干扰载体导入黄瓜的高效遗传转化体系,成功获得了转基因黄瓜植株。     

加工番茄SlAGO4A基因过表达及干扰载体构建与遗传转化北大核心

[目的]构建加工番茄SlAGO4A基因过表达及干扰载体,获得相应的转基因番茄植株。[方法]利用PCR技术从番茄c DNA文库中获得2 727 bp的加工番茄SlAGO4A基因。构建SlAGO4A基因的过量表达载体35S:SlAGO4A。以获得的SlAGO4A基因为模板,获得了SlAGO4A PIWI的220 bp的片段,构建SlAGO4A基因的RNAi干扰载体RNAi-PIWI,通过农杆菌介导的遗传转化,获得SlAGO4A过表达及干扰转基因番茄阳性植株,并利用实时荧光定量PCR(QRTPCR)技术检测过表达番茄阳性植株中的SlAGO4A基因的表达水平。[结果]经PCR鉴定获得5株独立转化的里格87-5干扰转基因加工番茄株系,获得6株独立转化的里格87-5过量表达转基因加工番茄株系,其6株SlAGO4A基因过表达的阳性植株的表达量均有不同程度的上调。[结论]为阐明SlAGO4A基因在加工番茄抗病毒信号通路中的功能奠定基础。     

加工番茄SlAGO4A基因过表达及干扰载体构建与遗传转化

[目的]构建加工番茄SlAGO4A基因过表达及干扰载体,获得相应的转基因番茄植株。[方法]利用PCR技术从番茄c DNA文库中获得2 727 bp的加工番茄SlAGO4A基因。构建SlAGO4A基因的过量表达载体35S:SlAGO4A。以获得的SlAGO4A基因为模板,获得了SlAGO4A PIWI的220 bp的片段,构建SlAGO4A基因的RNAi干扰载体RNAi-PIWI,通过农杆菌介导的遗传转化,获得SlAGO4A过表达及干扰转基因番茄阳性植株,并利用实时荧光定量PCR(QRTPCR)技术检测过表达番茄阳性植株中的SlAGO4A基因的表达水平。[结果]经PCR鉴定获得5株独立转化的里格87-5干扰转基因加工番茄株系,获得6株独立转化的里格87-5过量表达转基因加工番茄株系,其6株SlAGO4A基因过表达的阳性植株的表达量均有不同程度的上调。[结论]为阐明SlAGO4A基因在加工番茄抗病毒信号通路中的功能奠定基础。     

用单性结实基因2A11-iaaM转化罗汉果的研究

为了实现罗汉果生产中免除人工授粉和果实无籽化,该研究利用pBI121-Gus构建果实特异启动子2A11与生长素合成相关基因iaaM的嵌合基因(2A11-iaaM)过量表达载体,以罗汉果雌株叶盘为材料,采用农杆菌介导法建立罗汉果高效遗传转化体系,转化和创制单性结实罗汉果种质,通过基因特异引物对的PCR扩增,初步检测出转基因阳性植株,将之移栽大田,观察转基因植株的单性结实性的表现。结果表明:构建罗汉果单性结实性相关的pBAI-Gus植物双元表达载体获得成功;建立了农杆菌介导的罗汉果叶盘遗传转化优化体系,即农杆菌菌液OD_(600)值为0.3～0.5,侵染10 min,最优选择培养基为MS+TDZ 0.7 mg·L~(-1)+IBA 0.5 mg·L~(-1)+Kan 5 mg·L~(-1)+Cef 300 mg·L~(-1);经PCR鉴定共获得4株转基因阳性雌株;将阳性植株扩繁后移栽田间,经田间调查发现,24株阳性扩繁植株中有5株正常开花,占总植株数的20.8%,且其子房未经人工授粉发育成幼果,表现单性结实性。在载体构建和农杆菌介导的罗汉果遗传转化体系优化的基础上,将外源单性结实相关嵌合基因整合进罗汉果基因组并得到表达,为后续研究单性结实罗汉果的遗传生理,创制转基因罗汉果单性结实新种质,以及克服其产业化中需要人工授粉和无籽化提供了理论和应用基础。     

外源基因在烟草绿色组织中的高效表达研究

研究外源基因在受体绿色组织中的特异表达情况,分别构建由棉花PsbP启动子驱动的GUS基因及CP4 epsps 基因的植物表达载体pBI121-P、pBI121-PE.农杆菌介导法转化到烟草中,获得20株转pBI121栽体、40株转pBI121-P栽体和32株转pBI121-PE载体的烟草阳性植株.组织化学染色分析表明,GhPsbP启动子驱动的GUS基因只在转基因烟草的叶片和茎中表达,在根中不表达;Real-time PCR分析表明,PsbP启动子驱动CP4 epsps基因在叶和茎中的表达量分别是根中的15倍和10倍;草甘膦抗性试验证明,PsbP启动子驱动的CP4 epsps基因在烟草叶及茎的绿色组织中的表达量足以忍受1%浓度草甘膦的毒害.证明GhPsbp启动子可以有效地驱动外源基因在烟草的绿色组织中高效特异的表达.     

基因枪法获得GAI转基因橡胶树植株的研究

将含有Camv35S启动子、卡那霉素抗性基因和GUS报告基因,目的基因为GAI基因的转化载体质粒pBI121,通过基因枪轰击巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell-Arg.)花药愈伤组织,50 mg L~(-1)卡那霉素的继代培养基进行抗性筛选.获得了抗性再生植株,经过PCR、Southern检测结果表明:GAI基因已经成功转入橡胶树基因组中.     

基因枪法获得GAI转基因橡胶植株的研究

将含有Camv35S启动子、卡那霉素抗性基因和GUS报告基因,目的基因为GAI基因的转化载体质粒pBI121,通过基因枪轰击巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell-Arg.)花药愈伤组织,50 mg L~(-1)卡那霉素的继代培养基进行抗性筛选.获得了抗性再生植株,经过PCR、Southern检测结果表明:GAI基因已经成功转入橡胶树基因组中.     

ACS和ACO基因克隆及植物转化

根据已知序列设计PCR引物,分别扩增氨基环丙烷羧酸合酶（ACS）和氨基环丙烷羧酸氧化酶（ACO）基因并克隆到中间载体,经限制性内切酶酶切图谱分析、部分序列分析以及Southern印迹鉴定后,将两个基因单个或相互串联后反向亚克隆至植物表达载体pBI121。经农杆菌LBA4404转化番茄子叶,在抗性培养基上得到8株ACS基因反义转化的生根小苗以ACS基因的酶切小片段作为探针,经Southern印迹分析,证明获得了两株阳性转化株。     

人干扰素α-2b 基因在烟草中的表达研究

应用PCR的技术从质粒pAIFN中扩增人干扰素α-2b（Human interferon α-2b,HuIFN α-2b）编码基因,将其连接到pBI121双元载体构建植物真核表达载体pBIFN;用冻融法将该载体转染根癌农杆菌LBA4404;并用叶盘浸染法转化烟草叶片,经转化的烟草叶片的组织培养,诱导愈伤获得再生植株。通过应用PCR,RT-PCR,Wes-tern blot和WISH/VSV方法检测获得的烟草再生植株,结果表明HuIFN α-2b基因已成功整合进烟草核基因组并表达出具有活性的HuIFN α-2b蛋白。本文对HuIFN α-2b基因在烟草核系统中的表达进行了研究,为进一步在烟草叶绿体系统中该基因的表达研究奠定了基础。     

蓖麻毒蛋白A链基因RNAi转化研究

通过基因沉默技术调控蓖麻毒蛋白A链基因的表达,以期获得低毒蓖麻新材料.利用基因克隆技术获得蓖麻毒蛋白A链基因762 bp片段,命名为RTA基因.进一步利用该基因构建了植物RNAi表达载体pBI-RTA-S-AS,通过农杆菌介导法转化蓖麻子叶节,用卡那抗性筛选转化再生植株,PCR进一步鉴定转基因植株.结果表明:克隆得到目的基因长762 bp,与预期结果一致;卡那抗性筛选和PCR鉴定结果显示,获得了3株转基因阳性植株.     

油菜BnCr4基因RNAi载体构建及植株转化

该实验构建了含甘蓝型油菜黄化相关基因BnCr4特异片段反向重复结构的RNA干扰(RNAi)载体pFGC5941-Cr4,通过根癌农杆菌介导转化油菜,获得47株抗Basta的抗性再生油菜植株,其中10株经PCR鉴定为阳性转基因植株.随机选取3株经鉴定的转基因阳性油菜植株进行半定量RT-PCR分析,结果显示,相对于非转基因的野生型油菜,3株转基因植株中BnCr4基因的表达量分别降低了78.5%、8.5%、11.8%,表明该干扰载体转入油菜能特异引起植株BnCr4基因表达量下降.     

玉米Lc基因植物表达载体构建及菊花转化

Lc基因是从玉米中分离得到的与花青素合成相关的调节基因,它在多种植物中的异源表达可以增加花青素的含量.本研究对pBI121载体Gus基因后的终止子进行2次PCR扩增,在原Sac Ⅰ酶切位点后添加了新的Sac Ⅰ酶切位点,利用组织化学染色法检测,结果表明改造后的载体上的Gus基因能正常表达,终止子功能正常,载体改造成功.用改造的pBI121N构建了含有Lc基因的植物表达载体pBl121N-Lc,利用农杆菌介导法转化菊花叶盘,获得了19株生根抗性苗.通过提取抗性苗基因组总DNA,PCR扩增Lc基因和CaMv35S启动子获得了11个阳性株系,PCR结果表明Lc基因已经转入菊花中.同时,在已获得的转基因植株中发现7个株系的根系有变红的现象.     

农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体系优化

本研究以GUS基因在子叶节区的瞬时表达为依据,通过探讨影响农杆菌转化效率的因素,优化了大豆子叶节非组织培养遗传转化体系;利用该体系对冀豆16号进行Bar基因的遗传转化,并使用针刺法对转基因植株进行草铵膦筛选.结果表明,侵染液中附加3％蔗糖、OD600=0.6、以脱脂棉作为菌液附着介质同时不添加表面活性剂Silwet L-77、侵染1次的GUS阳性率最高达到62.13％.草铵膦抗性植株经PCR检测获得T0阳性植株10个,转化率为2.5％.经PCR和RT-PCR鉴定共获得3株T1阳性植株,初步证明目的基因已整合到大豆基因组中.     

农杆菌介导的蓖麻转化体系优化

针对影响农杆菌侵染效率的主要因素进行条件优化,确立了以OD600为0.8的菌液侵染、预培养5 d后的外植体为最佳侵染条件;侵染外植体经过5 d的共培养并除菌后,转到含有250 mg/L Kan的培养基中进行再生诱导,获得了多株具有Kan抗性的再生植株;通过在共培培养基中添加20 mg/L AS,124 mg/L Na2S2O3和152.4 mg/L DTT,有效地抑制了侵染后外植体的褐化现象,提高了筛选阶段抗性芽的成活率;对具有Kan抗性的再生植株进行PCR和Southern blot验证,共获得18株包含外源基因的阳性转化株。