圆斑蝰蛇毒七个C-型凝集素样蛋白亚基的cDNA克隆与序列分析

按照Promega公司的mRNA提取试剂盒操作手册,从圆斑蝰蛇（Daboia russellii siamensis）的毒腺中提取mRNA;利用RT-PCR的方法进行体外扩增,获得C-型凝集素蛋白的基因,克隆到pMD18-T载体中。随机挑选14个阳性克隆进行核酸测序,获得7个编码不同蛇毒C-型凝集素样蛋白亚基的cDNA,分别命名为DRS-L1、DRS-L2、DRS-L3、DRS-L4、DRS-L5、DRS-L6和DRS-L7。由基因序列推导出的氨基酸序列表明,克隆到的7个蛇毒C-型凝集素样蛋白的亚基中均有糖识别结构域存在。BLAST分析显示,仅有DRS-L1的蛋白序列与目前已知的蛇毒C-型凝集素样蛋白的α亚基相似。序列同源性比较并结合半胱氨酸位点分析,推测DRS-L1和DRS—L2可能分别是圆斑蝰蛇毒X因子激活剂的轻链LC2和LC1。DRS-L3和DRS-L4可能是高分子量的蛇毒C-型凝集素样蛋白的β亚基,而DRS-L5和DRS-L6可能是低分子量的蛇毒C-型凝集素样蛋白的β亚基。DRS—L7可能是类似于血小板膜糖蛋白Ib结合蛋白的β亚基。     

四个烙铁头蛇毒凝集素样蛋白基因的克隆与序列分析

从烙铁头蛇（Trimeresurus mucrosquamatus)的毒腺中提取mRNA,利用RT－PCR进行体外扩增,获得凝集素样蛋白基因,克隆至PMD18－T载体中,筛选出4种凝集素样蛋白基因（命名为TML-1、MTL－2、TML－3和TML－4）。由基因序列推导出的氨基酸序列表明：TML－1,2,3,4序列中均有CRD结构。序列同源性比较和Cys位点分析推测：TML－1和TML－2可能分别是类似于flavocetin-A的蛇毒凝集素样蛋白的α亚基和β亚基;TML－3可能类似于GPIb-bp的蛇毒凝集素样蛋白的α亚基,TML－4则可能是类似于Ⅸ/Ⅹ-bp的蛇毒凝集素样蛋白的β亚基。     

一种新的甘露糖结合凝集素--朱顶兰凝集素基因的克隆及序列分析

运用同源克隆的方法设计简并引物,通过3′和5′RACE技术,从石蒜科植物朱顶兰(Amaryllis vittata Ait)总RNA中克隆了编码此凝集素(AVA)的全长cDNA序列.该基因全长686 bp,起始密码子位于第41～43 bp,终止密码子位于515～517 bp处,开放阅读框长474 bp,编码158个氨基酸,包含信号肽序列、成熟蛋白序列和C-末端剪切序列的前体蛋白.成熟蛋白由109个氨基酸残基组成,分子量为11.9kD.成熟蛋白在氨基酸水平上与雪花莲凝集素、水仙凝集素、石蒜凝集素和君子兰凝集素分别有73.4%、85.3%、80.7%和83.5%的同源性;朱顶兰凝集素的分子模式显示其与雪花莲凝集素有极其相似的三维结构;在Blocks数据库中检索AVA蛋白氨基酸序列的结构域,发现有3个凝集素功能结构域,并具有3个典型的甘露糖专一结合位点盒(QDNY).     

一种新的甘露糖结合凝集素——朱顶兰凝集素基因的克隆及序列分析

运用同源克隆的方法设计简并引物,通过3′和5′RACE技术,从石蒜科植物朱顶兰(Amaryllis vittata Ait)总RNA中克隆了编码此凝集素(AVA)的全长cDNA序列。该基因全长686 bp,起始密码子位于第41～43 bp,终止密码子位于515～517bp处,开放阅读框长474 bp,编码158个氨基酸,包含信号肽序列、成熟蛋白序列和C-末端剪切序列的前体蛋白。成熟蛋白由109个氨基酸残基组成,分子量为11.9kD。成熟蛋白在氨基酸水平上与雪花莲凝集素、水仙凝集素、石蒜凝集素和君子兰凝集素分别有73.4％、85.3％、80.7％和83.5％的同源性;朱顶兰凝集素的分子模式显示其与雪花莲凝集素有极其相似的三维结构;在Blocks数据库中检索AVA蛋白氨基酸序列的结构域,发现有3个凝集素功能结构域,并具有3个典型的甘露糖专一结合位点盒(QDNY)。     

发菜藻蓝蛋白基因克隆及原核表达

发菜（Nostoc flagelliforme）是一种陆生固氮蓝藻,具有重要的经济和生态价值。运用双向电泳技术、MALDI-TOF-TOF/MS鉴定和数据库检索,获得藻蓝蛋白部分氨基酸序列并设计简并性引物,克隆藻蓝蛋白基因并研究其表达。结果表明,发菜藻蓝蛋白α和β亚基两个基因的编码序列及两者之间的间隔序列全长为1097bp,编码β亚基和α亚基的基因序列全长分别为519bp和489bp,β亚基基因序列位于α亚基基因序列上游,两者之间通过89bp的基因片段连接,GenBank登录号为GU549478,并对推译的α和β亚基三维结构进行了预测。将藻蓝蛋白的α和β亚基基因在大肠杆菌中表达,获得了符合预期的外源重组蛋白。研究结果为进一步研究发菜藻蓝蛋白的分子结构及生物学功能奠定了基础。     

东北虎促卵泡激素和促黄体激素基因的克隆及其序列分析

本研究首次从东北虎（Panthea tigris altaica)脑垂体提取总RNA,利用RT－PCR技术扩增出东北虎垂体促性腺激素α亚基,促卵泡激素（FSH）β亚基和促黄体激素（LH）β亚基的编码区序列,并进行克隆,测序和比较分析。结果表明,其α亚基,FSHβ亚基,LHβ亚基基因的开放阅读框分别为363bp,390bp和420bp,分别编码120,129和142氨基酸的前体蛋白。与已发表的人,牛,绵羊,猪,大鼠,小鼠等物种相应序列比较,无论在核苷酸水平,还是在氨基酸水平都显示出较高的同源性（64．7％－96．6％）,其中与猪的同源性最高（86％－96．6％）。东北虎的基因序列还具有其明显的特异性,首次发现LHβ亚基cDNA编码的前体蛋白在信号肽部分比其它物种相应序列多一个亮氨酸残基（Leu)。     

新疆黄精凝集素基因的克隆、序列分析和表达

用百合科黄精属植物凝集素基因的保守序列为引物,从新疆黄精的叶中克隆出黄精凝集素的全长cDNA。序列分析表明, 克隆获得的新疆黄精凝集素(Polygonatum roseum agglutinin, PRA)基因完整的ORF片段大小为550 bp, 编码1 条长159个氨基酸肽链, 没有内含子, 其中N 端的28个氨基酸是信号肽。对新疆黄精凝集素cDNA 序列同源性的分析比较发现, 黄精属植物凝集素基因之间有很高的同源性(92%)。氨基酸序列比对和SWISS-MODEL同源模建分析表明, PRA由12个b-折叠片组成的b-桶结构, 具有与单子叶植物甘露糖结合凝集素相似的空间结构。重组质粒pGEX-4T-1-PRA 和pMAL-p2x-PRA, 分别转化E. coli BL21进行原核表达, 新疆黄精凝集素能够以可溶性融合蛋白形式表达, 分子量约为14 kD。构建真核表达载体pcDNA3-PRA, 免疫小鼠后获得了抗血清。免疫印迹结果显示为单一的条带, 证明该抗血清具有针对PRA抗原的专一性。新疆黄精凝集素基因的克隆、原核和真核的表达以及抗血清的制备, 为进一步研究凝集素蛋白的性质和功能, 并为植物抗病虫基因工程研究提供有用的实验材料。     

新疆黄精凝集素基因的克隆、序列分析和表达

用百合科黄精属植物凝集素基因的保守序列为引物,从新疆黄精的叶中克隆出黄精凝集素的全长cDNA。序列分析表明, 克隆获得的新疆黄精凝集素(Polygonatum roseum agglutinin, PRA)基因完整的ORF片段大小为550 bp, 编码1 条长159个氨基酸肽链, 没有内含子, 其中N 端的28个氨基酸是信号肽。对新疆黄精凝集素cDNA 序列同源性的分析比较发现, 黄精属植物凝集素基因之间有很高的同源性(92%)。氨基酸序列比对和SWISS-MODEL同源模建分析表明, PRA由12个b-折叠片组成的b-桶结构, 具有与单子叶植物甘露糖结合凝集素相似的空间结构。重组质粒pGEX-4T-1-PRA 和pMAL-p2x-PRA, 分别转化E. coli BL21进行原核表达, 新疆黄精凝集素能够以可溶性融合蛋白形式表达, 分子量约为14 kD。构建真核表达载体pcDNA3-PRA, 免疫小鼠后获得了抗血清。免疫印迹结果显示为单一的条带, 证明该抗血清具有针对PRA抗原的专一性。新疆黄精凝集素基因的克隆、原核和真核的表达以及抗血清的制备, 为进一步研究凝集素蛋白的性质和功能, 并为植物抗病虫基因工程研究提供有用的实验材料。     

岩原鲤促性腺激素基因的克隆和组织表达差异

通过RT-PCR技术从岩原鲤(Procypris rabaudi)卵巢组织中克隆了促性腺激素GtHα、FSHβ、LHβ3个亚基的mRNA序列。GtHα亚基开放阅读框长357 bp,编码118个氨基酸残基,第1～23个氨基酸为信号肽。FSHβ亚基开放阅读框长393 bp,编码130个氨基酸残基,第1～22个氨基酸为信号肽。LHβ亚基开放阅读框长444 bp,编码147个氨基酸残基,第1～28个氨基酸为信号肽。氨基酸序列比对结果表明,GtHα亚基在近缘物种间比较保守,其氨基酸序列的相似性要高于FSHβ和LHβ亚基。通过Real-time fluorescent quantitative PCR(FQ-PCR)分析发现,GtHα亚基在检测的6种组织中均有表达,卵巢中的表达量极高,肝、脑、心、垂体和肌肉中表达量依次降低;FSHβ亚基在除肌肉外的其余5种组织中均有表达,卵巢中的表达量最高,脑和心中表达量次之,肝和垂体的表达量明显偏低;LHβ亚基只在卵巢和垂体中表达,卵巢中的表达量要明显高于垂体。     

白桂木凝集素基因cDNA克隆及其性质预测

为了探索白桂木凝集素在分子水平的作用机制,本研究采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法首次克隆了白桂木凝集素(Atrocarpus hypargyreus lectin,AHL)cDNA序列的全长。序列分析与预测结果表明,AHL cDNA序列全长933 bp,含有一个编码40个氨基酸的信号肽和1个编码235个氨基酸的708 bp开放阅读框(ORF);AHL分子量为25 579.2 Da。同源性分析表明AHL与木菠萝家族相关凝集素氨基酸序列有很高的同源性。     

异育银鲫GABA A受体γ2亚基全长克隆及生物信息学分析

近年来GABA A受体亚基特异性在药物筛选、研发过程中的应用得到广泛地关注,其中有关α1、β2和γ2三种功能性亚基的研究最为深入。异育银鲫因其良好的生长、繁殖优势,在国内得到广泛养殖。采用RACE法克隆得到了异育银鲫GABA A受体γ2亚基基因全长cDNA,并进行了生物信息学分析。该基因长2 763 bp,其中CDS区长1437 bp,可编码477个氨基酸的前体蛋白。预测蛋白分子量55.3 k D,理论等电点9.13。异育银鲫体内GABA A受体γ2亚基氨基酸序列N端存在1个长度为35个氨基酸的信号肽,4个长度分别为23、20、23和23个氨基酸的跨膜区,3个N-糖基结合位点和2个O-糖基化位点,1个特异性结构域,其氨基酸序列具有明显的氯离子门控通道家族特征。氨基酸序列与其他物种氨基酸序列的同源性都在89%以上,表明该蛋白属于GABA A受体亚基家族。系统进化树表明异育银鲫与斑马鱼聚为一支,亲缘关系最近。     

禾谷镰孢菌α-微管蛋白基因克隆及其与多菌灵抗药性关系分析

根据禾谷镰孢菌参考菌株NRRL310 84 (PH 1)的α- 微管蛋白基因核苷酸序列设计 4对引物 ,采用PCR方法克隆并测序了禾谷镰孢菌 (Fusariumgraminearum)对多菌灵 (MBC)不同敏感性表型的 6个中国菌株的α 微管蛋白基因全序列。DNA序列对照表明中国的 3个敏感菌株和 3个抗药菌株的α- 微管蛋白基因核苷酸序列同源性没有差异 ,多菌灵抗药性与α- 微管蛋白无关。该基因全长 1718bp ,含有 6个内元 ,编码 4 4 9aa ;与NRRL310 84的α- 微管蛋白基因核苷酸序列同源性为 99% ,存在 5个差异核苷酸 ,与其所编码的氨基酸序列同源性为 99 78% ;与其他 6种真菌α- 微管蛋白基因所编码的氨基酸序列同源性为 37%～ 86 %。     

苦瓜果实β-半乳糖苷酶基因的克隆、表达及亚细胞定位

根据已构建苦瓜果实均一化文库中获得的1个与β-Gal基因相关的EST序列,采用经3’RACE技术,克隆获得1 个苦瓜β-Gal基因的cDNA 序列McGAL,全长为2261bp,开放阅读框2187bp,编码719个氨基酸。该基因在GenBank 基因数据库的登录号为AFD54987.1。应用生物信息学软件对McGAL氨基酸序列分析表明,McGAL含有糖苷水解酶家族35的保守结构域G-G-P-[LIVM]-x-Q-x-E-N-E-[FY],C端不含凝集素结构域。二级结构显示,该酶含有α-螺旋（19.89%）,伸展链（26.98%）,β-转角（6.54%）和无规卷曲（46.59%）。McGAL氨基酸序列与鹰嘴豆、苜蓿、绿豆、大豆、羽扇豆的氨基酸序列的同源性分别达到73%、73%、73%、72%和71%。亚细胞定位结果表明,McGAL定位在线粒体膜上。荧光定量结果表明,McGAL在果实绿熟期表达量最高并随之下降,该基因可能与果实成熟软化初期相关。     

猪T细胞受体γ链基因的克隆及生物信息学分析

目的:克隆猪T细胞受体γ链(pTCR-γ)基因,用以研究猪T细胞受体分子结构与功能。方法与结果:以GenBank上登载的pTCR-γ基因为参考序列,用RT-PCR法从猪外周血淋巴细胞中克隆pTCR-γ基因。序列分析表明,pTCR-γ基因开放读框为1026bp,编码341个氨基酸残基,含有由23个氨基酸残基构成的信号肽序列;与参考序列相比,在核苷酸和推导氨基酸序列上的同源性分别为95.6%和88.8%;系统进化分析发现,该基因与绵羊、恒河猴、人、马、牛的同源性相对较高,与褐鼠、家犬、家鼠、家猫的同源性次之,而与禽类、鱼类的同源性最低;生物信息学结构预测表明猪T细胞受体γ链含2个结构域,其中1个为IG_LIKE1结构域(IGv结构域),由第14～114位共101个氨基酸残基组成;另一个为IG_LIKE2结构域(IGc结构域),由第143～238位共96个氨基酸残基组成。结论:克隆并应用生物信息学技术分析了猪T细胞受体γ链基因序列及编码蛋白的结构特征,为进一步研究γ链的结构与功能奠定了基础。     

人绒毛膜促性腺激素α、β亚基cDNA的筛选与序列分析

构建３周龄人胚ｃＤＮＡ 文库,用［α－３２Ｐ］ｄＣＴＰ标记的一链ｃＤＮＡ 为探针从中筛选高度表达的克隆子并测序,得到人绒毛膜促性腺激素（ＨＣＧ）的α和β亚基ｃＤＮＡ 克隆,序列同源性分析表明：α亚基编码区的ｃＤＮＡ 序列与已报道的完全同源,β亚基编码区第３０位碱基Ｇ→Ａ,该碱基的改变不引起氨基酸的改变．另外,在α和β亚基非编码区发现有多处碱基的改变．     

黑曲霉NRRL3135 bgl基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术从黑曲霉菌株NRRL3135中扩增了β-葡萄糖苷酶(BGL)基因的全长cDNA序列,被命名为bgl3135(GenBank登录号:FN430671)。对该基因编码的BGL进行了同源性分析并预测了其三维构象。试验结果表明,bgl3135的全长cDNA为2598bp,含有一个2583bp的开放阅读框(ORF),编码一个长度为860个氨基酸残基的蛋白质。同源性分析表明,该基因编码的蛋白与来自黑曲霉As3.350和CBS513.88的BGL(GenBank登录号分别为DQ655704和XM_001398779)的相似性最高,其氨基酸序列同源性分别达99%。参照已发表的β-葡萄糖苷酶(BGL)的氨基酸保守序列,判断本研究所克隆的bgl基因属于糖苷水解酶基因家族3的成员。三维结构预测表明,该BGL的立体构象中存在20个α-螺旋和15个β-折叠,对构成和维持酶的底物识别和催化活性位点可能起着重要作用。     

草鱼AMBP基因cDNA的克隆与序列分析

α1-微球蛋白和Bikunin是由同一基因翻译表达出的两种功能不相关联的血浆蛋白。本文通过快速扩增cDNA末端的方法,首次从草鱼肝脏组织克隆了α1-微球蛋白和Bikunin前体蛋白(α1-microglobulin/Bulinin precursor, AMBP）基因全长cDNA。其cDNA全长1230bp,包含5′非翻译区23 bp,3′非翻译区160 bp和开放读码框1047 bp。开放读码框编码348个氨基酸,包含182个氨基酸的α1-微球蛋白和145个氨基酸的Bikunin。草鱼AMBP与其他物种的氨基酸序列分析结果表明,它们具有较高的同源性(44.7%－84.4%),其中草鱼与斑马鱼同源性最高(84.4%)。结果表明AMBP序列结构和α1-微球蛋白与Bikunin共翻译表达特点在动物机体中具有着重要的生理意义。     

猪口蹄疫病毒受体通用亚基αv的基因克隆及序列分析

病毒受体是病毒宿主范围和组织嗜性的决定因素。研究发现,至少有四种整联蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8是口蹄疫病毒(FMDV)的受体,其中αv是4种受体的通用亚基。首次从口蹄疫病毒实验感染猪的肺组织中克隆到了通用亚基αv基因并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析。猪αv亚基基因的编码区含有3141个核苷酸,编码1046个氨基酸,其N-端30个氨基酸为信号肽,其后的胞外域、跨膜区、胞浆域分别由955、29、32个氨基酸组成;胞外域含有11个潜在的糖基化位点(NXT/NXS)、2个Ca2 结合位点(DX[D/N]XDGXXD)、18个半胱氨酸残基。猪αv基因与牛、人、猕猴、家鼠、鸡、犬的αv基因的核苷酸序列同源性分别为93.3%、91.5%、91.4%、85.6%、73.2%、89.9%,推导的氨基酸序列同源性分别为96.3%、94.6%、94.1%、90.8%、81.6%、93.8%,猪与牛αv亚基同源性最高,表明受体αv亚基可能与口蹄疫病毒的宿主范围有关。     

蝮亚科蛇线粒体细胞色素b基因序列分析及其系统发育

对中国产蝮亚科（Crotaline)亚洲蝮属（Gloydius)6种蛇（其中短属蝮取自两个不同地区）[短尾蝮Gloydius brevicaudus (Stejneger).黑眉蝮Gloydius saxatilis(Emelianov),蛇岛蝮Gloydius shedaoensis(Zhao),雪山蝮Gloydius strauchii(Bedriaga),高原蝮Gloydius strauchii monticola monticlal (Werner),乌苏里蝮Gloydius ussurriensis(Emelianov)]与竹叶青属竹叶青蛇Trimeresurus stejnegeri Schmidt共7种蛇8个个体测定了789bp或744bp线粒体细胞色素b基因序列,用MEGA1．02软件分析了其碱基组成及变异情况,以游蛇科链蛇属半棱鳞链蛇Dinodon semicarinatus序列为外群,用PAUP4．0b2软件构建最简约分子系统树,结果显示,竹叶青蛇在全部受试物种中处于原始地位,分布于东北地区的蛇岛蝮,乌苏里蝮,黑眉蝮与浙江与陕西产的短尾蝮所组成的分枝与横断山区的高原蝮,雪山蝮聚集形居的分枝组成姐妹群,支持分布于中国境内的亚洲蝮属蛇种的两个起源及分化地的假说,同时探讨了蝮蛇的分类地位问题。     

猪口蹄疫病毒受体通用亚基αv的基因克隆及序列分析

病毒受体是病毒宿主范围和组织嗜性的决定因素。研究发现,至少有四种整联蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8是口蹄疫病毒(FMDV)的受体,其中αv是4种受体的通用亚基。首次从口蹄疫病毒实验感染猪的肺组织中克隆到了通用亚基αv基因并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析。猪αv亚基基因的编码区含有3141个核苷酸,编码1046个氨基酸,其N-端30个氨基酸为信号肽,其后的胞外域、跨膜区、胞浆域分别由955、29、32个氨基酸组成;胞外域含有11个潜在的糖基化位点(NXT/NXS)、2个Ca²⁺结合位点(DX［D/N］XDGXXD)、18个半胱氨酸残基。猪αv基因与牛、人、猕猴、家鼠、鸡、犬的αv基因的核苷酸序列同源性分别为93.3%、91.5%、91.4%、85.6%、73.2%、89.9%,推导的氨基酸序列同源性分别为96.3%、94.6%、94.1%、90.8%、81.6%、93.8%,猪与牛αv亚基同源性最高,表明受体αv亚基可能与口蹄疫病毒的宿主范围有关。