一株针对人EGFR的单链抗体克隆与哺乳细胞表达

目的:制备特异性抗人表皮生长因子受体(EGFR)的单链抗体(sc Fv),鉴定其生物学活性,为进一步研究基于单链抗体的免疫治疗奠定基础。方法:从分泌抗人EGFR单克隆抗体的杂交瘤细胞系提取总RNA,利用5'RACE技术扩增轻链和重链可变区(VL、VH)基因,构建具有VL、VH基因的单链抗体基因,并将构建的单链抗体基因克隆到真核细胞表达载体pc DNA3.1中进行表达和鉴定。ELISA鉴定单链抗体对抗原的特异性;Fortebio检测抗原抗体间的亲和力,流式细胞术检测单链抗体结合肺癌细胞系天然EGFR的功能活性。结果:获得唯一的轻重链可变区序列VL、VH,成功构建EGFR-sc Fv,特异性与天然EGFR蛋白结合,亲和力达3.22×10-9mol/L。结论:成功构建了抗人EGFR单链抗体,为肺癌免疫导向治疗研究奠定了基础。     

抗炭疽保护性抗原单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析

目的:克隆并分析抗重组炭疽芽孢杆菌保护性抗原(rPA)单克隆抗体4B2、5E1和2A8轻、重链可变区基因。方法:从分泌抗rPA特异性单抗的杂交瘤细胞株4B2、5E1和2A8中提取总RNA;利用RT-PCR技术克隆抗rPA单抗4B2、5E1和2A8的VL、VH基因,并将其连入pMD18-T载体中进行测序分析。结果:4B2VL基因全长378bp,VH基因全长414bp;5E1VL基因全长420bp,VH基因全长426bp;2A8VL基因全长384bp,VH基因全长342bp。通过分析,这些基因均符合小鼠IgGV区基因的特征,含有4个框架区、3个抗原互补决定区,而且抗体特征性的半胱氨酸残基的数量和位置也正确。结论:克隆了抗rPA单抗4B2、5E1和2A8的VL、VH基因,为下一步构建多种形式的基因工程抗体奠定了良好的基础。     

抗人血管内皮生长因子单链抗体基因的构建、表达及活性鉴定

鼠单克隆抗体E11能与人血管内皮生长因子(VEGF)特异结合,已用于临床检测恶性肿瘤细胞VEGF的表达,并初步证明其体内抑瘤活性。为便于大规模生产,特进行基因工程改造,构建小分子的单链抗体(scFv)。首先通过逆转录及多聚酶链式反应(PCR),分离并克隆E11的可变区基因。经测序表明,E11轻链可变区(VL)基因全长333bp,编码111个氨基酸,归属小鼠轻链可变区基因第Ⅲ亚组。重链可变区VH基因全长369bp,编码123个氨基酸,归属小鼠重链可变区基因Ⅱ(A)亚组。然后用一编码亲水性多肽接头的DNA片断将E11单抗轻、重链可变区基因连接,构建表达质粒pET-15YV,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。表达产物(包含体)经变性及复性后,用免疫组化法检测该单链抗体结合抗原(颊癌)能力。对颊癌组织检测的结果表明,基因工程抗体scFv与亲代抗体一样,具有较高的组织特异性。本研究获得的抗人VEGF单链抗体具有潜在的临床价值,为肿瘤放射免疫显像及以血管为靶标的抗血管生成治疗奠定了基础。     

抗TNF-α单链抗体噬菌体展示文库的建立和鉴定

应用噬菌体展示技术构建抗肿瘤坏死因子α(tumornecrosis factor α,TNF-α)单链抗体(single chain Fv,scFv)文库,从中筛选抗TNF-αscFv并进行鉴定.利用重组人TNF-α(rhTNF-α)免疫小鼠,分别扩增小鼠VH和VL基因,经重叠延伸反应将VH和VL基因拼接成scFv基因,以SfiⅠ/NotⅠ位点定向插入pCANTAB 5E噬菌粒载体,转化E.coli TG1,构建了库容为4.6×108的抗TNF-α单链抗体库.对抗体库进行3轮富集筛选后,ELISA检测阳性克隆的抗原特异性,取1株阳性克隆进行测序分析.结果表明,抗TNF-αscFv基因序列长774bp,编码258个氨基酸.将此阳性克隆转化E.coliHB2151,IPTG诱导可溶性scFv的表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析,scFv的分子量约为28kD.经亲和纯化后的scFv可与rhTNF-α结合,并可中和由rhTNF-α引起的L929细胞毒性.本文利用噬菌体抗体库筛选到了高亲和力的抗TNF-αscFv,为研制临床免疫治疗的新型抗体奠定了实验基础.     

卵巢癌抗独特型单链抗体的人源化——抗独特型微抗体的构建与表达

为了降低人抗鼠抗体反应 ,获得满意的免疫原性 ,将模拟人卵巢癌抗原的抗独特型单链抗体人源化 .采用重叠PCR和基因工程的技术 ,将 6B11ScFv基因的轻链和重链颠倒 ,成为 6B11VL VH.再与人IgG1铰链区和CH3区的基因进行融合 (VL VH CH3) ,构建抗独特型微抗体的原核表达载体 .转化E .coliBL2 1(DE3)后用IPTG诱导表达 .经SDS PAGE分离显示 ,在 5 0kD左右处有一诱导蛋白带 .不连续非变性凝胶电泳显示 ,表达产物分子量为 10 0kD左右 .采用ELISA、竞争抑制实验、West ern印迹对其进行活性测定 .结果表明 ,人源化的抗独特型微抗体具有特异性双价结合卵巢癌单克隆抗体COC16 6 9和识别人免疫球蛋白IgG1的活性 ,成功地将鼠源的scFv的人源化     

抗人AEG-1单克隆抗体可变区基因克隆及序列分析

AEG-1基因位于人染色体8q22,编码582个氨基酸,参与多种信号转导途径并与多种恶性肿瘤的发生、发展及生物学表型密切相关。为更好地探讨AEG-1生物学功能,以纯化的pGSTag-AEG-1蛋白免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术并经筛选及鉴定,获得了分泌抗人AEG-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E3;Western blot及免疫组化证实该细胞株分泌的单克隆抗体能与肿瘤细胞中AEG-1蛋白特异性结合;RT-PCR方法从1E3细胞中克隆出抗AEG-1抗体的VH和VL基因片段,通过测序分析、碱基和蛋白序列的比对确认该株抗体为鼠源性IgG的轻、重链可变区基因。进一步运用Kabat System在线分析系统对VH和VL基因进行结构分析,确证FWRs和CDRs的结构完整,VH编码117个氨基酸;VL编码119个氨基酸,属于轻链κV家族。实验结果为进一步研究AEG-1与恶性肿瘤发生、发展的关系及在其临床诊断中的应用奠定了基础。     

抗鳗弧菌独特型单克隆抗体dsFv的构建及其噬菌体表面呈现

抗鳗弧菌独特型单克隆抗体 1E10是能够模拟鳗弧菌的保护性表位 ,可以作为疫苗使用的一种单克隆抗体 .利用基因工程抗体技术从抗鳗弧菌独特型单克隆抗体杂交瘤细胞株 1E10中克隆出抗体的重链及轻链可变区基因 (VH 和VL) .通过定点突变技术将VH4 4和VL10 5突变为半胱氨酸并且连接到噬菌体表达载体pCANTAB5E中 ,突变后的VH 和VL 基因位于cpⅢ先导序列和cpⅢ基因之间 ,在LacZ启动子调控之下 ,以融合蛋白的形式被导入细胞间隙 ,依靠链间二硫键组装成二硫键稳定型Fv抗体 (dsFv) .加入辅助噬菌体M13K0 7后 ,dsFv以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面 .ELISA测定显示 :dsFv噬菌体能够与抗原结合并且这种结合呈噬菌体浓度依赖 .结果表明 :成功构建出了抗鳗弧菌独特型单克隆抗体dsFv基因并使其在噬菌体表面获得了正确呈现 .该dsFv噬菌体有望成为新一代基因工程疫苗用于预防鱼类鳗弧菌感染     

抗四环素单链抗体基因的构建与序列测定

目的：构建抗盐酸四环素的单链抗体（scFv）基因。方法：以抗盐酸四环素单克隆抗体杂交瘤细胞株的总RNA为模板,用RT-PCR法扩增全套抗体轻、重链基因;经重叠延伸反应,以编码柔性多肽（GIy4Ser）3的基因为接头,将轻、重链基因组装为完整的seFv基因,并克隆到pGEMT-Easy载体中进行测序分析。结果：所克隆的四环素scFV基因全长为735 bp,为VH-Linker-VL结构,VH基因为354bp,Linker为（Gly4Ser）3多肽的核酸序列,VL基因为336 bp。结论：构建了抗四环素的单链抗体基因,为进一步用于四环素的残留枪测奠审某础．     

抗EGFRvIII噬菌体抗体库的构建和筛选

目的：应用噬菌体展示技术筛选针对表皮生长因子受体突变体Ш (epidermal growth factor receptor variant type Ⅲ, EGFRvIII)的单链抗体 (single chain Fv, scFv)。方法：利用原核表达纯化的人EGFRvIIIex蛋白和高表达EGFRvIIIex的小鼠成纤维细胞系NIH3T3免疫小鼠,扩增VH和VL片段并拼装成scFv 基因,连接至噬菌粒pCANTAB 5E,电击转化Hpd3cells,构建噬菌体单链抗体库,并进行3轮富集筛选。在第4轮筛选时,采用了降低抗原浓度的方法。然后将筛选得到的阳性克隆测序分析,转化E.coli HB2151,IPTG 诱导可溶性scFv 的表达。结果：构建了库容为7.9×107 的噬菌体单链抗体库。经过第4轮低浓度抗原筛选,得到了较高亲和力的克隆。取单个阳性克隆测序分析结果表明,该抗EGFRvIII scFv 基因序列长807 bp,编码268个氨基酸。IPTG诱导后表达的可溶性scFv 可分别与纯化的EGFRvIIIex抗原以及细胞表面的EGFRvIIIex结合。结论：利用噬菌体抗体库筛选得到了高亲和力的抗EGFRvIII scFv,为开发针对EGFRvIII的抗体药物提供了靶向载体分子。     

Ⅱ型志贺毒素单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的表达和功能鉴定

目的从分泌抗肠出血性大肠埃希菌Ⅱ型志贺毒素中和单克隆抗体杂交瘤细胞株S2C4中克隆抗体可变区基因,构建单链抗体（ScFv）,进行原核表达,并对其功能进行鉴定。方法从杂交瘤细胞株S2C4中提取总RNA,逆转录成cDNA。在cDNA3’-OH末端添加poly．G。PCR扩增包括5’非翻译区和信号肽序列在内的抗体重、轻链可变区基因VH和VL,PCR产物装入T—A载体测序。根据测序结果,设计引物分别扩增VH和VL编码区,再通过重叠PCR,在VH和VL．编码区基因之间引入连接链,构建Scn基因,并克隆到表达载体pComb3xSS中。重组载体导入E．coliTop10F’进行表达,重组蛋白经纯化后,分别用ELISA和动物保护性实验鉴定其生物学活性。结果VH和VL编码区基因全长分别为396bp和378bp,ScFv基因能在大肠埃希菌中高效表达,表达产物的分子量为34000,用NiSO4亲和层析柱成功纯化。功能性实验表明纯化的重组蛋白可以与Stx2毒素有效结合,能保护动物抵御毒素分子的攻击。结论成功地克隆S2C4单抗可变区基因,并构建、表达其单链抗体ScFv,为下一步进行该抗体人源化奠定实验基础。     

抗EGFRvⅢ噬菌体抗体库的构建和筛选

目的:应用噬菌体展示技术筛选针对表皮生长因子受体突变体Ш(epidermal growth factorreceptor variant typeⅢ,EGFRvIII)的单链抗体(single chain Fv,scFv)。方法:利用原核表达纯化的人EGFRvIIIex蛋白和高表达EGFRvIIIex的小鼠成纤维细胞系NIH3T3免疫小鼠,扩增VH和VL片段并拼装成scFv基因,连接至噬菌粒pCANTAB5E,电击转化Hpd3cells,构建噬菌体单链抗体库,并进行3轮富集筛选。在第4轮筛选时,采用了降低抗原浓度的方法。然后将筛选得到的阳性克隆测序分析,转化E.coliHB2151,IPTG诱导可溶性scFv的表达。结果:构建了库容为7.9×107的噬菌体单链抗体库。经过第4轮低浓度抗原筛选,得到了较高亲和力的克隆。取单个阳性克隆测序分析结果表明,该抗EGFRvIII scFv基因序列长807bp,编码268个氨基酸。IPTG诱导后表达的可溶性scFv可分别与纯化的EGFRvⅢex抗原以及细胞表面的EGFRvⅢex结合。结论:利用噬菌体抗体库筛选得到了高亲和力的抗EGFRvⅢ scFv,为开发针对EGFRvⅢ...     

天然兔源噬菌体单链抗体库的构建与鉴定

目的:构建天然兔源噬菌体单链抗体库。方法:采用RT-PCR法从未免疫的兔子脾脏中克隆得到抗体重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)基因,重叠PCR将VH和VL拼接成scFv片段,将scFv连接到噬菌粒pComb3XSS上,电转入XL1-Blue菌中,得到单链抗体库,并用此抗体库筛选抗肌酸激酶抗体。结果:构建了容量为4×108,基因重组率95%的单链抗体库,DNA指纹图谱显示抗体库多样性良好。以肌酸激酶为抗原,从该库中筛到3株抗肌酸激酶的抗体。结论:分析表明构建的天然兔源单链抗体库质量良好,可用于快速筛选、制备多种单链抗体。     

大容量人天然抗体库的构建、鉴定及初步应用

从未经主动免疫的健康志愿者的外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR扩增人抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,得到了6种VH家族基因,11种VL家族基因,这些抗体基因家族覆盖了人抗体基因多样性的95%以上。采用改进的SOEPCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体(scFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,将连接产物电转化大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13KO7超感染,构建了库容为5.58×109的噬菌体单链抗体库。采用BstNI酶切法证明,构建的噬菌体单链抗体库具有良好的多样性。以TNF-α为靶,从该抗体库中筛选到了抗TNF-α抗体,这说明该抗体库可用于人源抗体的筛选。     

人源抗TNF—α抗体Fab基因的单链化及其表达和纯化

构建人源抗TNF－α单链抗体基因,并尝试其在E.coli中的表达和纯化,采用人工接头,按VH－linkerVL的结构将人源抗TNF－a的VH,VL基因拼接成单链抗体（ScFv)基因,并将构建好的ScFv基因插入表达载体pQE30,转染E.coli M15,以IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂纯化表达产物,构建的ScFv基因长723bp, 列分析表明,该序列拼接正确,SDS－PAGE显示,用重组的pQE30转化的M15菌经诱导后,有相对分子质量（M）约为52000的外源蛋白表达,Ni-NTA树脂纯化的表达产物纯度大于90％,因此,成功地构建了人源抗TNFa的ScFv基因,并在E.coli DH5a中表达和纯化的该基因的产物。     

抗人P185^erbB2的scFv—Fc融合蛋白的表达及免疫功能分析

为提高鼠源单抗用于体内治疗的效应功能及降低人抗鼠抗体反应 ,将编码抗人P185 erbB2 单抗轻、重链可变区 (VL、VH)融合构建的单链抗体 (scFv)基因片段与人IgG1的Fc区基因片段融合构建了scFv Fc融合基因 ,并将其克隆到哺乳动物细胞表达载体pCIDN中。用重组载体转染CHO细胞 ,通过G4 18筛选获得稳定高表达克隆。更换无血清培养基培养 ,经重组蛋白质A亲和层析柱纯化scFv Fc融合蛋白。融合蛋白质在还原SDS PAGE中表现为5 2kD的条带 ;与SK BR 3细胞裂解液共培育可特异性地沉淀出P185 erbB2 蛋白 ;FACS分析表明融合蛋白质识别P185 erbB2 蛋白的胞外段 ;ELISA测定融合蛋白质对细胞表面抗原P185 erbB2 的亲和常数为 7.5× 10 -10 (mol/L) -1。构建scFv Fc融合基因 ,将其克隆到表达载体 ,进一步稳定表达抗P185 erbB2 的scFv Fc融合蛋白 ,为进一步的体外、体内研究鼠源单抗治疗效果创造了条件。     

A型肉毒毒素表位多肽免疫和人源噬茵体单链抗体文库的构建

采用表位合成多肽免疫获得编码人源抗体的基因材料,抗体轻重链可变区基因通过剪接重叠延伸(SOE)技术进行组装后,亚克隆入噬菌体粒中构建免疫库。以重组制备的A型肉毒毒素保护性抗原为配体筛选结合子,ELISA鉴定,获得具有较高抗原结合力的噬菌体克隆,进行基因测序和家族定位分析。结果显示,表位合成多肽免疫,成功构建了库容大于10^8的重组抗体库。体外3轮免疫淘筛,筛选到人源A型肉毒抗毒素克隆,基因结构分析表明,其中ScFvB17全长750bp,可编码250个氨基酸残基：VH属于VH4家族,369bp,编码123个氨基酸残基;Vκ属于κ链Ⅱ家族,336bp,编码112个氨基酸残基。基因的同源分析表明,这是一株特异的单链抗体新基因。     

一种核糖体展示单链抗体文库的构建与鉴定

用柑桔溃疡病致病菌Xanthomonas axonopodis pv. citri（Xac）全菌免疫小鼠,提取小鼠脾细胞mRNA,RT-PCR扩增小鼠抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）,采用linker (Gly4Ser)3连接VH和VL,构建用于核糖体展示方法筛选阳性单链抗体（scFvs）的文库。通过将scFv文库DNA转化大肠杆菌JM109,随机挑取克隆子测序以分析单链抗体文库的多样性。结果显示,用柑桔溃疡病菌免疫后的小鼠抗血清效价为2500倍左右,扩增的VH大小为350bp左右,VL的大小为650bp左右,linker连接后的单链抗体文库DNA大小为1200bp左右。测序结果显示,单链抗体文库多样性好。以Xac为靶,筛选到了抗Xac的特异性抗体,说明该抗体库可用于柑桔溃疡病菌单链抗体的筛选。     

抗人红细胞单链抗体与猪瘟E2蛋白双功能融合蛋白的构建及生物学活性检测

为构建具有凝集性、免疫反应性的双功能融合蛋白,本研究采用重叠延伸PCR方法将2E8ScFv(抗人红细胞H抗原单链抗体基因)和mE2(猪瘟病毒E2蛋白主要抗原编码区基因)拼接成融合基因2E8mE2,并插入原核表达载体pET-DsbA,将重组表达质粒pET-DsbA-2E8mE2转化入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)PlysS中进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定,结果表明:2E8mE2融合基因在大肠杆菌中获得了表达,表达产物以包涵体形式存在,分子量约为65kDa,与预期的大小一致。分别采用亲和层析法和谷胱甘肽再氧化法对融合蛋白进行纯化和复性,红细胞凝集试验证实:2E8mE2融合蛋白复性效果良好,既能够与人红细胞结合,又能够与猪瘟病毒抗体反应,具有双功能特性。     

抗人胎盘酸性铁蛋白单链抗体的构建、表达与鉴定

目的:制备人胎盘酸性铁蛋白(PAF),构建、表达并鉴定抗人PAF单链可变区抗体片段(scFv)。方法:设计以SfiⅠ、NotⅠ为酶切位点、以(Gly4Ser)3为linker的2对引物,从抗人PAF单克隆抗体可变区基因的克隆载体中扩增VH和VL基因,用重叠延伸PCR在VH和VL基因间引入连接短肽,构建VH-linker-VL的scFv基因。经SfiⅠ、NotⅠ酶切后克隆到原核分泌型表达载体pUC19/119上,转化大肠杆菌TG1和筛选后测序验证,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定其相对分子质量(Mr)。以人PAF为抗原,scFv为一抗,抗His单克隆抗体为二抗,间接ELISA鉴定其抗体活性。结果:重叠延伸PCR扩增产物经凝胶电泳可见约700bp的条带,DNA序列分析证明2株抗体具有完整的scFv序列,并含有c-myc和His。IPTG诱导阳性菌表达产物经SDS-PAGE鉴定有Mr约27000的显示条带,符合scFv与表达标签融合蛋白的理论值;间接ELISA证明表达产物可与PAF结合。结论:成功构建并表达了抗人PAF单链抗体,为进一步建立检测PAF的间接ELISA奠定了基础。     

借助计算机模建与缺失突变技术确定抗人TNF-α单抗Z12识别的抗原表位

钓取抗人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)抗体Z12重、轻链可变区(VH, VL)基因, 根据其氨基酸序列, 运用同源模建方法分别模拟VH和VL结构域的空间构象, 并搭建Fv片段的整体三维结构, 利用分子对接方法建立Fv/hTNF-α作用的复合物模型, 据此模型推测Z12抗体识别的表位为hTNF-α141~146位. 将hTNF-α分为N端1~91和C端92~157两段进行原核表达, 检测结果表明Z12抗体识别的抗原表位位于hTNF-α C端92~157区, 初步证实预测结果可靠. 进一步的实验研究表明, 当把hTNF-α141~146位氨基酸缺失后, Z12抗体识别该缺失体的能力几乎丧失, 提示此抗体特异性识别抗原分子141~146位氨基酸残基.