大熊猫LSM3c DNA序列的克隆及序列分析

运用RT-PCR技术首次从大熊猫Ailuropoda melanoleuca的肌肉组织总RNA中成功克隆了LSM3的表达序列,并对其进行了测序及初步分析.结果 表明:大熊猫LSM3基因的表达序列含有一个完整的开放阅读框,长度为306 bp,编码102个氨基酸的蛋白质,分子量为11.845 kDa,pI为4.58,含有1个蛋白激酶C磷酸化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点和1个细胞附着序列.进一步分析发现,大熊猫LSM3基因的表达序列与已报道的部分哺乳动物具有很高的相似性,其编码的氨基酸序列与其他哺乳动物完全一致.     

大熊猫核糖体蛋白S11亚基基因(RPS11)cDNA的克隆及序列分析

RPS11是核糖体小亚基40S的组成部分,由RPS11基因所编码,属于核糖体蛋白S17p家族,主要存在于真核生物中.为了解大熊猫核糖体蛋白亚基RPS11基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基RPS11 基因的异同,本研究根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白S11亚基基因(RPS11)的相关信息设计引物,运用RT-PCR 技术从大熊猫的肌肉组织总RNA中成功克隆了核糖体蛋白亚基RPS11基因,并进行了测序和序列分析.结果表明:大熊猫RPS11亚基基因的开放阅读框(ORF)长为477 bp,编码158 个氨基酸的蛋白质,该蛋白的相对分子量为18.4275 kDa,pI为10.96.拓扑预测显示该蛋白含有14个功能位点:即2 个N-糖基化位点,6个蛋白激酶C磷酸化位点,4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点和1个核糖体蛋白S17 signature位点.进一步分析发现,大熊猫RPS11基因与已报道的部分哺乳动物的表达序列及其编码的氨基酸序列都具有很高的相似性.本研究结果为丰富和完善哺乳动物RPS11基因资源库提供了基础资料.     

DNA聚合酶X家族系统发育树的重建

随着DNA聚合酶X家族成员数量的增加,特别是两个昆虫痘病毒(entomopoxvirus,EPV)成员的加入,家族内部的系统发育关系需要重新检查。总共37个来自不同物种的DNA聚合酶x家族成员的核心结构域序列被分析。结果显示：系统发育树呈现的家族内部系统发育关系基本上与家族成员的物种分布状态相吻合,其中,病毒成员与真核生物DNA聚合酶beta(polβ)亚群构成姐妹群,提示病毒成员可能起源于真核细胞的相应基因。亚群的歧异时间、基因结构比较和同线基因保守性分析显示,哺乳动物DNA聚合酶基因(Pol M)可能起源于脱氧核苷酸末端转移酶基因(TdT)最近发生的基因重复。     

两种缘毛类纤毛虫胞质Hsp70基因序列的克隆及其系统发育分析

克隆得到2种缘毛类纤毛虫——钟形钟虫(Vorticella campanula)和螅状独缩虫(Carchesium polypinum)的胞质Hsp70基因部分序列,长度均为438bp,编码146个氨基酸。以细菌为外类群,利用最大似然法和邻接法构建包括其他5种纤毛虫在内的共26个物种的Hsp70基因氨基酸序列系统发育树,其拓扑结构显示：V．campanula和C．polypinum聚在一起,并与另2种寡膜纲的嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)及草履虫(Paramecium tetraurelia)聚为姊妹枝,提示了缘毛类纤毛虫为单系,且隶属于寡膜纲的系统发育地位。     

脊椎动物FoxO基因亚族的进化

本研究以脊椎动物FoxO作为研究对象,选取NCBI上公布的多个FoxO基因编码蛋白的核苷酸序列,重点分析Fox O蛋白质结构和功能的相似性与差异性,重建FoxO基因的系统发育树并进行选择压力分析,对FoxO基因亚族的起源和进化进行研究分析。结果显示:脊椎动物FoxO蛋白间Forhead结构域十分保守但核定位信号区结构差异较明显,尤其是FoxO6蛋白,并且多个磷酸化位点在哺乳动物FoxO6中缺失,削弱核输出信号,但在斑马鱼和原鸡的FoxO6中未缺失这些位点,推测其胞质定位调控作用仍十分重要。FoxO3中多个磷酸化位点可能与寿命延长作用相关。系统发育树表明FoxO1是FoxO基因的祖先基因,不同FoxO基因进化速率不同。选择压力分析结果显示FoxO基因过程每个位点经历不同的选择压,并且获得25个正选择位点,这些正选择位点可能对FoxO不同基因的形成和新功能的产生中具有十分重要的作用。     

苏太猪ELOVL7基因的生物信息学分析

不同于人、鼠等物种ELOVL7基因的高相似度,不同品种的猪ELOVL7基因相似度较低。为了探究该基因的特性,本研究运用生物信息学的方法对苏太猪ELOVL7基因及其氨基酸序列的同源性、理化性质、保守结构域、亚细胞定位、信号肽、跨膜结构域、亲水性/疏水性、二级结构、功能预测以及磷酸化位点等进行预测分析。结果表明：在苏太猪中,ELOVL7全长2 324 bp,编码区为846 bp,共编码281个氨基酸。其结构稳定,分子量为33 387.4 Da,带正电荷,偏碱性。该基因所编码的蛋白质最可能位于细胞膜上,主要的功能是运输和结合,为跨膜、非分泌型疏水蛋白质,含有1个GNS1/SUR4家族的保守结构域,并有15个丝氨酸激酶、15个苏氨酸激酶和20个酪氨酸激酶潜在磷酸化位点。α螺旋是ELOVL7二级结构和三级结构中最主要的结构元件。另外ELOVL7与大部分物种的氨基酸序列相似性达90%以上,且亲缘关系较近。分析ELOVL7基因及其氨基酸序列的特征,能够为进一步挖掘该基因内的突变对长链脂肪酸表型的影响以及合成、代谢机理提供分子依据。     

猪戊型肝炎病毒swCH-GS189株ORF2基因的克隆及序列分析

为进行猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2基因特征研究,参照GenBank中已发表的戊型肝炎病毒(HEV)核酸序列,设计了一对扩增HEV ORF2基因的引物,利用RT-PCR等方法克隆出了一株猪戊型肝炎病毒甘肃分离株GS189的ORF2基因cDNA片段.序列测定结果表明,swCH-GS189株的ORF2基因长2 025 bp,编码674个氨基酸,与GenBank中公布的其它毒株间的核苷酸序列同源性为79.1%～91.8%,推导的氨基酸序列同源性为89.5%～98.8%.系统发育进化树结果表明,该分离株为基因IV型.     

大熊猫RPS15 cDNA的克隆及序列分析

本研究运用RT-PCR技术,首次从大熊猫 Ailuropoda melanoleuca的肌肉组织总RNA中成功克隆了核糖体蛋白S15 (RPS15)基因的表达序列,并对其进行了初步分析.结果 表明:大熊猫RPS15基因的表达序列全长为442 bp,开放阅读框(ORF)为438 bp,编码145个氨基酸,该蛋白的分子量为17.0401 KDa, 等电点为10.3,含有2个依赖于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点, 5个蛋白激酶C磷酸化位点,4个N-酰基化位点及1个RPS19蛋白signature位点.进一步分析发现,大熊猫RPS15基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物具有很高的相似性.     

Myostatin三维结构模建及分子进化分析

Myostatin(MST)为肌肉生长负调节因子,其功能受抑制可导致肌肉量增加.对MST核酸序列进行序列比对,构建进化树;采用同源模建方法首次模建MST成熟肽生物活性二聚体的四级结构,并预测MST与其受体ActRIIB的相互作用模式.进化树将肌肉生长抑制素基因(MSTN)分成4个亚家族:哺乳动物MSTN,鸟类MSTN以及鱼类MSTN 1和2.MST受纯化选择作用,在不同物种的直系同源基因具有较高的刚源性,其中哺乳动物、鸟类MST C端活性肽氨基酸序列高度保守.表明哺乳动物、鸟类MST的结构、功能类似,且信号传导路径可能一致;而鱼类MST的调控机制可能存在较大差异.MST结构及其表面静电势和疏水氨基酸分布表明静电力和疏水相互作用在MST与其受体结合过程中可能起到十分重要的作用.     

草莓果实MADS-box基因保守片段的克隆与序列分析

根据多种植物MADS-box基因保守区序列设计简并引物,应用PCR技术从草莓绿果中分高出33条MADS-box基因cDNA片段.序列分析表明,这些片段长度在137 - 146 bp之间,包含基因起始密码子.推导的氨基酸序列与已登录的草莓的MADS-box基因同源性超过87％.推导的氨基酸序列与已知的革莓和其他物种调控果实发育成熟的MADs-box基因以及拟南芥的MADS-box家族基因进行系统发育分析,可将这些基因片段分科归入拟南芥MADS-box基因不同亚家族中,证明草莓果实中存在各类MADS-box家族基因,克隆的部分片段可能参与调控果实发育和成熟软化的调节.     

大熊猫及其近种活化素基因βA亚基成熟肽序列的克隆分析及其在分类地位上的应用

借鉴互联网中已经克隆到的Activin基因βA亚基成熟肽序列,设计并合成1对兼并引物,利用PCR技术从大熊猫,小熊猫,马来熊的基因组DNA中直接扩增目的基因片段,并分别克隆到大肠杆菌载体pBlueScript^ 当中,然后对培养产物进行行序列测定,DNA序列分析表明,三种物种的Activin基因βA亚基成熟肽序列长度均为359bp,无内含子,基因片段编码一个含有119个氨基酸残基的肽段。大熊猫,小熊猫,马来熊在该成熟肽核苷酸和氨基酸序列上表现出高度的同源性,其中核苷酸同源性为93.9%。氨基酸同源性高达99%以上,此外,3种动物的核酸限制性酶切图谱也高度相似,与GenBank中收录的其他物种Activin基因βA亚基成熟肽序列相比较,显示此片段在处于不同进化程度的物种之间仍具有高度保守性,运用系统发育与进化树软件包PHILIP,并结合克隆序列对大熊猫,小熊猫,马来熊进化与分类地位进行了探讨,采用不同的统计学分析方法,所得到的3个物种系统发育进化树的拓扑结构完全一致,相比较而言,大熊猫与马来熊有着较近的亲缘关系,而小熊猫与上述两个物种的亲缘关系相对疏远,结果支持将大熊猫与马来熊归为熊科,而将小熊猫单列成科的学术观点,这是首次以生殖相关的核基因作为研究对象,为大熊猫及其近种进行系统分类研究所提供的又一分子生物学证据。     

拟黑多刺蚁脱皮激素受体编码基因的克隆及系统发育分析

为了研究脱皮激素受体在拟黑多刺蚁发育中的功能,本项目采用逆转录PCR方法从拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina Roger)中克隆到脱皮激素受体编码基因PvEcR全长序列,对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。从拟黑多刺蚁中克隆到脱皮激素受体蛋白编码基因1 737bp的全长序列,该序列编码578个氨基酸,预测的蛋白分子量大小为63.098×103,理论等电点为7.41。NCBI蛋白质数据库中进行Blast搜索表明,拟黑多刺蚁脱皮激素受体蛋白PvEcR存在至少6类保守结构区域,主要为DNA结合位点、配体结合位点和激活因子识别位点。PvEcR蛋白序列磷酸化位点预测共揭示48个可能的磷酸化位点。PvEcR与其他昆虫脱皮激素受体蛋白在氨基酸序列上同源性高达70%以上。基于脱皮激素受体蛋白氨基酸序列构建的系统发育树表明,几乎所有蚁类脱皮激素受体形成一个大分支,其中拟黑多刺蚁与佛罗里达弓背蚁表现出最近的亲缘关系。     

绵羊CAST基因2型和4型转录本的克隆及特性分析

钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin, CAST)是一种内源性的需要Ca²⁺激活的钙蛋白酶抑制剂, 在肌肉组织的蛋白质降解过程中起重要的调节作用。文章利用牛^CAST基因的mRNA序列, 通过逆转录RT-PCR首次克隆获得绵羊CAST基因2型转录本和4型转录本的部分cDNA序列, 并对序列进行生物信息学分析。CAST基因2型转录本的扩增片段为4 385 bp, 完整的开放阅读框为2 361 bp, 编码786个氨基酸; CAST基因4型转录本的扩增片段为1 467 bp, 完整的开放阅读框为1 317 bp, 编码438个氨基酸。CASTⅡ型蛋白序列存在4个保守结构域, CASTⅣ型蛋白序列存在3个保守结构域; 两者的二级结构均以螺旋为主, 富含疏水区域, 其氨基酸序列存在多个磷酸化位点以及蛋白激酶C(Protein kinase C, PKC)的磷酸化位点。通过RT-PCR分析CAST基因2型转录本和4型转录本的组织表达谱, 结果表明CAST基因2型转录本在所检测的10个组织中均表达, CAST基因4型转录本仅在睾丸组织中表达。     

林麝MHC-DRA基因分析及与反刍亚目DRA基因比较

MHC-DRA基因仅在少部分物种如马、斑马、驴等具有多态性,DRA基因在其他哺乳动物中多为低多态性。由于MHC-DRA的低多态性,较少受到研究者重视,我们选取近缘物种牛的DRA基因引物,对四川养麝研究所的217只林麝进行DRA基因exon 2的序列扩增,得到2个林麝DRA基因,片段长度为260 bp,这2个基因仅有一个核苷酸同义突变,没有氨基酸突变。我们将所获得的林麝DRA基因与反刍亚目其他物种DRA基因进行氨基酸比对发现,我们扩增的序列为林麝DRA基因exon 2,编码MHCⅡ类分子的α1区域,而这段区域主要参与形成MHCⅡ类分子的多肽结合槽,根据Brown确定人类的抗原肽结合区位点,在参与比对的反刍亚目物种DRA基因中,抗原位点11、22、72、76存在氨基酸变异,而在这些位点上林麝的DRA基因没有变异,和大部分反刍亚目相同。同时我们发现大部分反刍亚目物种之间氨基酸突变的位点大都在非抗原结合位点。     

棉花GhMYB113基因的克隆与表达分析

该研究利用序列拼接并结合RT-PCR技术,从棉花叶片中克隆了1个MYB基因的cDNA序列,命名为GhMYB113。序列分析表明,该基因开放阅读框为738bp,编码246个氨基酸,含有2个MYB结构域,属R2R3-MYB类型转录因子。该基因的基因组序列长1 927bp,由3个外显子和2个内含子构成。氨基酸序列比对发现该蛋白与其他物种的MYB蛋白有较高的一致性。系统进化分析显示,棉花GhMYB113与现代杂交月季亲缘关系最近。qPCR分析发现,该基因在棉花根中优势表达,在干旱、高盐及低温胁迫后表达量均发生变化,推测GhMYB113可能在植物响应干旱、高盐及低温等非生物胁迫过程中起作用。     

蜂猴线粒体细胞色素b基因变异特点及系统发育分析

测定了蜂猴属（Nycticebus)1个蜂猴（N.coucang)和2个矮蜂猴（N,pygmaseus)个体的线粒体细胞色素b(cyt-b)基因全序列,比较现有的司猴科其他种序列,分析了核苷酸序列差异和碱基替换特点,以指猴为外群重建了系统发育树,结果表明,在所研究的个体中,2个蜂猴物种碱基组成具有哺乳动物的共同特点,它们之间转换比（特别是密码子第3位）是颠换比的6倍多,大于其他种间比较;低的Ka/Ks值（＜0．1）,说明懒猴科cyt-b基因的异义突位点受到强的选择压力作用。由cyt-b基因构建的系统发育树符合懒猴科化石记录和形态学分类观点,根据化石记录和与分化时间有一定线性关系的第3位颠换和同义突变速率,估算蜂猴与倭蜂猴种间,蜂猴与蜂属间可能的分化时间分别为300和600万年。     

荧光假单胞菌TM5-2中D-型氨基酸脱氢酶的鉴定和表达

从荧光假单胞菌TM5-2中得到一个含丙氨酸消旋酶基因的DNA片段(8.8kb),相邻的一个开读框(ORF)与甘氨酸/D-型氨基酸氧化酶基因相似。该ORF经过克隆、表达,并没有检测到甘氨酸/D-型氨基酸氧化酶的活性,推导而得的氨基酸序列与D-型氨基酸脱氢酶序列比较发现,ORF含有D-型氨基酸脱氢酶的所有重要的保守序列。经TTC培养基鉴定,其具有D-型氨基酸脱氢酶的活性,并对一系列D-型氨基酸有作用,最佳作用底物是D-组氨酸。     

绵羊肌球蛋白轻链2基因的分子克隆与表达分析

肌球蛋白轻链2蛋白是哺乳动物肌球蛋白的重要成员之一。获得其基因序列,并对其特征和表达进行分析,可为进一步研究功能奠定基础。本研究以小尾寒羊背最长肌为试验材料,采用RACE等方法对绵羊肌球蛋白轻链2基因的cDNA序列进行克隆和测序、利用相关生物学软件对所得cDNA序列进行生物信息学预测、并利用qRT-PCR和Western印迹法对其在绵羊各种组织中的表达进行分析。结果获得该基因cDNA序列全长为776 bp,提交至GenBank中获得相应的登录号为KJ710702;该序列中的498 bp的开放读码框编码含有166个氨基酸残基的蛋白质。预测发现该蛋白质无信号肽和二硫键,但存在N-糖基化和磷酸化位点;二级结构中以α-螺旋为主;蛋白质序列比较发现绵羊MYL2与小鼠、人、大鼠、猪、牛等哺乳动物的同源性均在95%以上。mRNA和蛋白质表达谱均显示该基因在绵羊心肌中表达量最高,其次为背最长肌。     

水稻OsJMJ718基因可选择性多聚腺苷酸化序列的 克隆及生殖发育期表达模式

可选择性多聚腺苷酸化是真核生物重要的基因调控机制之一, 通过形成不同长度的3'端非翻译区影响信使RNA的稳定性、定位和翻译效率, 从而增加转录本的复杂度。已有研究表明, 拟南芥(Arabidopsis thaliana)中参与DNA去甲基化调控IBM1基因的可选择性多聚腺苷酸化加工受染色质调节因子EDM2调控, 从而影响拟南芥基因组数千基因的CHG甲基化水平, 但该类调控机制是否在其它物种中同样存在仍然未知。以水稻(Oryza sativa)基因组中IBM1同源基因OsJMJ718为研究对象, 利用生物信息学分析和3'RACE实验, 发现IBM1同源基因也存在可选择性多聚腺苷酸化修饰, OsJMJ718基因可能存在9个可选择性多聚腺苷酸化序列。序列比对分析表明, NCBI网站现存日本晴OsJMJ718基因组3'末端序列与9522和明辉63等其它生态型基因组序列组成可能不同。荧光实时定量PCR分析表明, OsJMJ718的9个转录本在水稻生殖发育阶段呈现不同的动态表达模式, 其中TVX5转录本表达量最高。研究获得的OsJMJ718基因可选择性多聚腺苷酸化序列信息及相关的表达模式分析为进一步揭示水稻OsJMJ718基因的可选择性多聚腺苷酸化分子机制和生物学功能奠定了基础。     

大熊猫酸性核糖体磷酸蛋白P1 基因cDNA 克隆及序列分析

运用RT-PCR 技术,从大熊猫的肌肉组织总RNA 中成功克隆了酸性核糖体磷酸蛋白P1 (RPLP1)基因的表达序列,并对其进行了测序及初步分析。结果表明:大熊猫RPLP1 基因的表达序列全长为448 bp,开放阅读框(ORF)为344 bp,编码114 个氨基酸的蛋白质,该蛋白的分子量为11.566 kDa,pI 为4.4,含有3 个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和2 个N - 酰基化位点。进一步分析发现,大熊猫RPLP1 基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物具有很高的相似性。