原生质体介导马尔尼菲青霉基因转化体系的优化

目的优化原生质体介导的马尔尼菲青霉转化体系,为其基因功能研究提供良好的平台。方法通过原生质体介导将构巢曲霉(Aspergillus nidulans)pyrG基因插入马尔尼菲青霉尿嘧啶缺陷株ligD(pyrG-,ligD-)中,在不含尿嘧啶的培养基中筛选阳性转化子,运用PCR验证重组子,通过改变影响转化效率的酶解时间、培养基浓度、质粒浓度、不同配方的原生质体洗涤液STC和不同配方的原生质体助融剂PTC 5个条件对体系进行优化。结果 PCR验证A.nidulans pyrG基因成功的插入ligD中,转化子可稳定传代。最适合ligD原生质体转化效率的条件为:酶解时间6h,PTC(60%PEG-4000,100mmol/L Tris-HCl pH8.0,100mmol/L CaCl2),每100μL原生质体(106~107/mL)加入2.5μg质粒,0.6 mol/L蔗糖SD/SDU筛选/再生培养基,每1μg质粒转化子可达68个左右。结论成功优化了原生质体介导马尔尼菲青霉转化体系的条件,优化后该方法转化效率高,为基因功能研究提供良好平台。     

高效严谨型大肠杆菌Targetron基因打靶系统的构建

构建高效严谨型大肠杆菌Targetron基因打靶系统。将来源于pET28a的T7-lac操纵子与来源于pSY6的Ⅱ型内含子组装构建大肠杆菌IPTG诱导型Targetron质粒系统。以lacZ基因为例,选择lacZ-635s和lacZ-1063a两个位点为靶位点,利用构建的IPTG诱导型Targetron系统进行基因打靶,通过分析诱导前和诱导后Ⅱ型内含子在靶位点的插入效率,验证大肠杆菌IPTG诱导型Targetron系统严谨性和打靶效率。最后,通过优化诱导剂浓度及诱导时间,建立高效严谨的诱导型大肠杆菌Targetron基因打靶系统。在没有IPTG诱导时,Ⅱ型内含子在两个位点均不能插入,打靶效率均为0;当加入0.5 mmol/L IPTG诱导45 min时,其在lacZ-635s位点的打靶效率提高到90.8±5.5%,在lacZ-1063a位点的打靶效率提高到92.6±2.4%。成功建立高效严谨型大肠杆菌Targetron基因打靶系统,旨为Ⅱ型内含子的机理研究及应用奠定基础。     

马尔尼菲青霉的研究现状

本文较系统地介绍了目前国内外有关马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei)的研究概况。由于包括艾滋病在内的各种获得性免疫缺乏症易感人群数量的扩大,以及在东南亚及中国南部等马尔尼菲青霉疫源地的经济发展和国际人员交流日益增大的情况下,使这个条件性高致病性真菌感染的疫情有可能出现更大范围的扩散。目前,全球艾滋病患者的马尔尼菲青霉条件性感染已成为判断HIV感染的临床征象,其在HIV感染者中的发病率高达10%～25%左右。所以,有必要对这种区域性高致病性真菌病原和其条件性感染病症进行全面的研究和制定系统的防治措施。现从马尔尼菲青霉的菌学特点、双相形态转换的基因特性、临床流行病学、分子生物学菌种鉴定及临床诊治等方面进行扼要阐述,同时,也将介绍最近相关的研究方向。     

马尔尼菲青霉的分类学研讨

马尔尼菲青霉能引起人和鼠类的马尔尼菲青霉病,1956年由Capponi等分离自越南的竹鼠,后由Segretain (1959)正式发表为新种.DiSalvo等(1973)首次报道此菌对人的自然感染,也分离了菌种。Pitt (1980'1979')承认Segretain的菌株为马尔尼菲青霉,但把DiSalvo的菌株(ATCC 24100)由于具明显的黄色菌丝而与岐生青霉金黄色变种(ATCC 10438)合并,成立了樱草黄青霉新种。近年来一些中国的研究者对广西的竹鼠作了大量的调查,证明竹鼠普遍携带此菌,并分离了大量菌株。作者对来自广西的34株分离物(2株来自患者,32株来自银星竹鼠)根据形态和培养特征作了鉴定,并用IMI 68794(来自模式),ATCC 24100和ATCC 10438作了对比。全部34株分离物尽管在菌落外观有明显不同(许多菌株产生黄色具饰菌丝,影响菌落外观)但根据其帚状枝及瓶梗的特征,产生紫红色素以及在370C形成酵母状细胞诸特点,作者认为都是马尔尼菲青霉。ATCC 24100也同样具有马尔尼菲青霉的特征。而ATCC 10438虽然也产生明显的黄色菌丝,但其帚状枝和瓶梗与马尔尼菲青霉不同,不产生紫红色素,在370C不生长,因此不是同一个种。ATCC 24100应保持原来的种名马尔尼菲青霉。     

马尔尼菲青霉的分子生物学研究进展

马尔尼菲青霉是一种主要累及免疫受损患者的条件致病性双相真菌,近年来随着HIV感染的增多,马尔尼菲青霉病发病率呈现逐年上升的趋势。国内外学者对马尔尼菲青霉及其致病机制进行了大量的研究,尤其是分子生物学方法的应用,使人们对马尔尼菲青霉的真菌学特点和马尔尼菲青霉病的发病机制有了更深入的了解,使早期诊疗成为可能。该文主要从分子流行病学、分子遗传学和分子生物学诊断方面对马尔尼菲青霉进行综述。     

农杆菌介导的马尔尼菲青霉基因转化技术的建立及优化

目的建立农杆菌介导的马尔尼菲青霉(PM)基因转化技术,并对该技术条件进行优化。方法以二元质粒p DHt/SK为载体,通过农杆菌介导将pyr G基因插入马尔尼菲青霉尿嘧啶缺陷株SPM4(pyr G-,nia D-)中,在不含尿嘧啶的培养基中筛选阳性转化子。运用PCR验证重组子。进一步对影响转化效率的农杆菌类型、共培养浓度、转化媒介、共培养温度、共培养时间、乙酰丁香酮(AS)等六个条件进行优化。结果 PCR验证pyr G基因成功的插入SPM4中,所得到转化子可稳定传代,通过条件优化,得到转化子约300个/106个细胞。选用AGL-1,以农杆菌共培养浓度为OD600=0.8,AS浓度为200μmol/L,无膜IM固体共培养基为介质,25℃共培养48 h为最适转化条件。结论成功建立了农杆菌介导PM基因转化技术,简化并优化了转化条件,该方法可用于PM基因功能研究。     

利用Red重组系统快速构建基因打靶载体

基因敲除小鼠模型是在哺乳动物体内研究基因功能最可靠的方法之一。利用常规的分子克隆的方法构建基因打靶载体往往工作周期长,对于难度特别大的基因有时甚至无法完成打靶载体的构建。通过合理应用Red重组系统和低拷贝中间载体,利用50bp的同源重组序列直接从BAC载体中克隆了长片段的小鼠基因组序列;将得到的基因组序列再次通过重组和改造,构建了Gpr56等基因的完全敲除并带有报告基因的打靶载体,实现了打靶载体的快速构建。     

痢疾杆菌酸抗性系统相关基因缺失突变体的构建

依赖于谷氨酸脱羧酶的酸抗性系统对痢疾杆菌在宿主细胞内的生存和繁殖至关重要,hdeA、hdeB、yhiE和yhiF是其中几个重要的酸抗性基因。借助Red系统的重组功能,PCR扩增两翼与目的基因上下游同源的抗性基因片段,电击转化痢疾杆菌2457T,对筛选到的阳性转化子再导入编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20以去除抗性基因。结果成功的敲除了hdeA、hdeB、yhiE和yhiF等4个酸抗性系统相关基因,为深入研究痢疾杆菌酸抗性基因的调控网络奠定了基础.     

电穿孔介导马尔尼菲青霉转化体系的建立和优化

目的 建立和优化马尔尼菲青霉电穿孔转化体系,为其基因功能研究提供良好平台.方法 直接使用马尔尼菲青霉缺陷株SPM4（pyrG-,niaD-）萌发孢子进行电穿孔转化,并通过改变孢子龄、孢子萌发时间、质粒浓度、电场强度等影响因素对体系进行优化.结果 适合SPM4电穿孔转化条件为：孢子龄为6d,孢子萌发时间为4h,电场强度为5 kV/cm.上述条件下分别使用1 μg环状或线性化质粒DNA转化SPM4,平均可得到21个和13个转化子.结论 马尔尼菲青霉电穿孔转化效率高,重复性好,针对SPM4萌发孢子,环状质粒较线性化质粒电穿孔转化效率高.     

树突状细胞与马尔尼菲青霉酵母体外相互作用的研究

本文探讨了树突状细胞(DCs)在抗马尔尼菲青霉感染免疫中的作用.用细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4诱导人外周血单核细胞分化为树突状细胞,观察DCs的形态,并用流式细胞仪进行DCs的表型测定,ELISA方法检测培养上清液IL-12p70的浓度,混合淋巴细胞反应检测DCs刺激T淋巴细胞的增殖能力.实时荧光定量PCR检测趋化因子受体CCR7、CXCR4的mRNA 的表达.倒置显微镜下可见诱导获得的DCs细胞形态不规则,表面伸展出大量树突.与马尔尼菲青霉酵母共同培养24 h后DCs的胞内含有大量的酵母细胞;细胞表型CD86、CD83、HLA-DR和CD40的表达明显增高;刺激T淋巴细胞增殖的能力增强;趋化因子受体CCR7和CXCR4的mRNA表达量增加且能够产生IL-12p70但产生的量低于LPS刺激组.DCs能吞噬加热灭活的马尔尼菲青霉酵母,并趋于成熟,抗原呈递能力增加,但是产生IL-12p70的量较低,可能造成宿主抗马尔尼菲青霉酵母的细胞免疫功能的不足.     

树突状细胞与马尔尼菲青霉酵母体外相互作用的研究

本文探讨了树突状细胞(DCs)在抗马尔尼菲青霉感染免疫中的作用。用细胞因子 rhGM-CSF 和rhIL-4诱导人外周血单核细胞分化为树突状细胞, 观察DCs的形态, 并用流式细胞仪进行DCs的表型测定, ELISA方法检测培养上清液IL-12p70的浓度, 混合淋巴细胞反应检测DCs刺激T淋巴细胞的增殖能力, 实时荧光定量PCR检测趋化因子受体CCR7、CXCR4的mRNA的表达。倒置显微镜下可见诱导获得的DCs细胞形态不规则, 表面伸展出大量树突。与马尔尼菲青霉酵母共同培养24 h后DCs的胞内含有大量的酵母细胞; 细胞表型CD86、CD83、HLA-DR和CD40的表达明显增高; 刺激T淋巴细胞增殖的能力增强; 趋化因子受体CCR7和CXCR4的mRNA表达量增加且能够产生IL-12p70但产生的量低于LPS刺激组。DCs能吞噬加热灭活的马尔尼菲青霉酵母, 并趋于成熟, 抗原呈递能力增加, 但是产生IL-12p70的量较低, 可能造成宿主抗马尔尼菲青霉酵母的细胞免疫功能的不足。     

微生物基因打靶系统的研究进展

基因打靶技术是微生物功能基因组学研究的有力工具之一,通过定向改变微生物的遗传信息可以对目的基因进行有效的功能分析。在大肠杆菌中研究较多的是转座子突变系统、RecBCD^-sbcB重组系统、RecA依赖的重组打靶系统、Chi位点刺激的重组、利用单链DNA进行的重组工程。在酵母中进行基因打靶的策略主要是转座子标记的突变、基于PCR方法的基因删除和转化相关重组。在其他微生物中主要应用转座子突变和自杀载体进行基因打靶。近年来,噬菌体重组系统的发展更使对微生物基因打靶系统的研究进入了新的阶段,主要包括Rac编码的RecET系统、Red重组系统和噬菌体退火蛋白介导的单链寡核苷酸重组系统。     

小鼠巨噬细胞吞噬马尔尼菲青霉酵母相细胞的实验观察

目的探讨小鼠腹腔巨噬细胞对马尔尼菲青霉酵母相细胞的影响,为研究抗马尔尼菲青霉的免疫机制提供一定的实验依据。方法将马尔尼菲青霉酵母相细胞与小鼠腹腔巨噬细胞在体内和体外两种方式下进行共培养,分别于60min、120min、240min和360min后进行菌落形成单位(CFU)计数,统计分析体内组与体外组CFU数结果的差异性。利用钙荧光白染色巨噬细胞胞内的马尔尼菲青霉酵母相细胞,荧光显微镜下观察细胞形态特征的变化。结果经体内和体外两种方式共培养,两组之间的CFU计数差异无统计学意义,但两组内不同时间点的CFU计数差异存在统计学意义。荧光显微镜下可见巨噬细胞内的酵母细胞被钙荧光白染上淡蓝色荧光。结论小鼠腹腔巨噬细胞在体内、外对马尔尼菲青霉酵母相细胞不起明显的杀灭或溶解作用,其最大的吞噬时间为共培养240min。钙荧光白染色可快速有效的区分巨噬细胞与真菌,是一种良好的检测真菌方法。     

解纤维梭菌脱水四环素诱导的ClosTron基因打靶系统构建

【背景】解纤维梭菌是发酵木质纤维素生产乙醇的中温模式菌株,构建可控诱导的基因打靶技术是研究解纤维梭菌遗传调控的重要手段。【目的】在解纤维梭菌中构建脱水四环素诱导的ClosTron基因打靶系统。【方法】首先,分析解纤维梭菌对脱水四环素的敏感性,筛选合适的诱导剂浓度,并以β-葡萄糖苷酶为报告基因,检测其在解纤维梭菌中的诱导效果。然后,将脱水四环素诱导型操纵子与II型内含子元件组合,构建脱水四环素诱导的ClosTron质粒。最后,以解纤维梭菌mspI、ldh和ack为例,检测其在解纤维梭菌中的打靶效率。【结果】脱水四环素诱导系统在解纤维梭菌中能够诱导ClosTron元件表达,在mspI、ldh和ack这3个基因位点的打靶效率分别为29.48%±15.51%、23.61%±7.08%和28.09%±6.97%。【结论】在解纤维梭菌中成功构建脱水四环素诱导的ClosTron基因打靶系统,为梭菌基因工程改造奠定了基础。     

绒山羊FGF5基因打靶载体的构建

[目的]构建绒山羊FGF5基因打靶载体,以期获得基因敲除的绒山羊个体,为研究绒山羊FGF5基因的功能以及培养长绒毛型绒山羊新品种提供新思路。[方法]通过PCR法扩增并克隆了绒山羊FGF5基因启动子区和部分第一外显子的1.6 kb片段和部分第一内含子的4.5 kb片段,并将1.6 kb片段插入到打靶载体p Lox的XbaⅠ/ClaⅠ位点,获得了9.6 kb的中间打靶载体p Lox5;再将4.5 kb片段插入到p Lox5的NotⅠ位点,通过酶切和PCR法验证获得了插入方向正确的打靶载体p Lox5-33。[结果]经过酶切和PCR法鉴定,最终获得了大小为14.1 kb的p Lox5-33。[结论]成功构建了绒山羊FGF5基因包含启动子区第一外显子部分序列和第一内含子部分序列的大小为14.1 kb的基因打靶载体p Lox5-33,为进一步获得基因敲除绒山羊个体以及研究绒山羊FGF5基因的功能奠定了基础。     

扩展青霉碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

将编码扩展青霉碱性脂肪酶 (PEL)的cDNA克隆到酵母整合型质粒pPIC3.5K ,电转化His4缺陷型巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115 ,通过橄榄油 MM平板及PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDS PAGE分析、橄榄油检验板鉴定 ,表明扩展青霉碱性脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中获得了高效表达。表达蛋白分泌至培养基中 ,分子量约 2 8kD ,与扩展青霉碱性脂肪酶大小一致 ,占分泌蛋白的 95 %。橄榄油检验板检验表明该表达蛋白可分解橄榄油 ,通过优化该表达菌的发酵条件 ,以橄榄油为底物进行酶活测定 ,其发酵液酶活可达 2 6 0u mL。     

扩展青霉碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

将编码扩展青霉碱性脂肪酶（PEL）的cDNA克隆到酵母整合型质粒pPIC3.5K,电转化His4缺陷型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,通过橄榄油MM平板及PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDSPAGE分析、橄榄油检验板鉴定,表明扩展青霉碱性脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中获得了高效表达。表达蛋白分泌至培养基中,分子量约28kD,与扩展青霉碱性脂肪酶大小一致,占分泌蛋白的95%。橄榄油检验板检验表明该表达蛋白可分解橄榄油,通过优化该表达菌的发酵条件,以橄榄油为底物进行酶活测定,其发酵液酶活可达260 u/mL。     

Myostatin基因打靶载体的构建及猪胎儿成纤维细胞Myostatin基因的敲除

目的:用缺口修复等技术构建Myostatin(肌肉生长抑制素,MSTN)基因打靶载体,并对大白猪胎儿成纤维体细胞进行转染,获得基因敲除细胞。方法与结果:首先构建用于MSTN基因同源长臂(LA)的抓捕载体,然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复,从含大白猪MSTN基因座的细菌人工染色体上亚克隆9.9 kb的LA到抓捕载体上,经过部分序列测定,同源性为100%;通过PCR获得1.4 kb的同源短臂(SA);将LA和SA连入载体pLOXP,构建含有neo和tk正负筛选标记基因的MSTN基因打靶载体pLOXP-MSTN-KO;将线性化的pLOXP-MSTN-KO通过电转染整合到大白猪胎儿成纤维细胞基因组中,利用G418和丙氧鸟苷进行药物筛选,获得抗性细胞克隆890个,通过PCR和DNA测序鉴定获得基因敲除的细胞克隆4个。结论:构建了有效的MSTN基因打靶载体,通过转染获得基因敲除细胞,为利用体细胞核移植制备MSTN基因敲除猪奠定了基础。     

通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定

为了构建适合大多数基因座位点打靶的通用型基因打靶载体及打靶成功后去除正选择标记基因,以克隆载体pGEM-3Z为骨架,插入了一个正选择标记基因新霉素磷酸转移酶基因(neo).两个相同的负选择标记基因单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-tk1和HSV-tk2,并在neo的两侧各添加了一个方向相同的LoxP(10cus of crossing-over(X)in P1)序列及两个不同的多克隆位点序列,从而构建了载体pA2T.插入的两个不同的多克隆位点序列中,neo和HSV-tk1之间的多克隆位点序列有8个稀少的酶切位点、neo和HSV-tk2之间的多克隆位点序列有5个稀少的酶切位点,neo、HSV-tk1和HSV-tk2有各自独立的转录单元.脂质体法转染山羊成纤维细胞,用遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GAC)进行正负筛选,验证了正负选择标记基因的生物活性,证明通用型基因打靶载体pA2T构建成功.栽体pA2T转化组成性表达Cre重组醇(Cyclization recombination protein)的大肠杆菌BM25.8,检测到LoxP序列的生物活性,结果表明pA2T中的正选基因可以被Cre重组酶去除.因此,本研究所构建的通用型基因打靶载体pA2T,根据不同的基因座设计同源臂后,插入到MCS中可直接用于不同基因座位点的打靶,并能够在打靶成功后用Cre重组酶去除基因组中插入的neo基因,为用基因打靶的方法制作转基因动物提供了便利.     

黑曲霉pepB基因缺失菌株的构建及其功能分析

以黑曲霉(Aspergillus niger)GICC2773基因组DNA为模板,用PCR方法分别扩增pepB基因中的上游约1．4kb和下游约1．3kb两段DNA序列,将此两段序列按同一方向分别插入质粒pMW1中潮霉素抗性基因(hph)表达单元的5′和3′端,构建成重组质粒pMW1-pepB,用于通过同源重组靶向破坏基因组中的pepB基因。同源重组则采用原生质体-PEG方法,将酶切pMW1-pepB得到的线性片段转化A．niger GICC2773菌株,通过潮霉素选择平板得到62个Hgy抗性转化子,然后采用PCR方法从这些抗性转化子中筛选到1个由于同源重组产生的pepB基因缺失突变菌株pepB29。功能分析显示该突变株的酸性蛋白酶活性有明显下降,外源蛋白漆酶的分泌表达有所提高。