白花蛇舌草多糖提取物对喉癌Hep-2细胞内质网自噬的影响*

目的:探讨白花蛇舌草多糖提取物(HDPE)对喉癌Hep-2细胞内质网自噬的影响。方法:实验分为对照组、HDPE 100、200、400 mg/L组和3-MA(自噬抑制剂)组,噻唑盐比色法(MTT)检测各组细胞培养24 h、48 h、72 h后增殖抑制率;原位末端转移酶标记法(TUNEL)法检测各组培养48 h细胞凋亡情况;单丹黄酰尸胺(MDC)染色观察各组培养48 h细胞自噬体及自噬溶酶体的变化;透射电镜观察培养48 h细胞内质网周围自噬囊泡的产生情况;蛋白印迹法(Western blot)检测各组培养48 h细胞Beclin-1蛋白(Beclin-1)、微管相关轻链蛋白3Ⅰ(LC3Ⅰ)、微管相关轻链蛋白3Ⅱ(LC3Ⅱ)、葡萄糖调节蛋白 78(GRP78)、活化转录因子6(ATF6)及CCAAT 增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)表达。结果:与对照组比较,HDPE 100、200、400 mg/L组和3-MA组细胞增殖抑制率、凋亡指数AI升高,MDC阳性细胞率量降低,内质网周围自噬囊泡减少,GRP78、ATF6及CHOP表达及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值升高,Beclin-1表达降低(P＜0.05);与3-MA组比较,HDPE 400 mg/L组细胞增殖抑制率、凋亡指数AI升高,MDC阳性细胞率、GRP78、ATF6及CHOP表达及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值升高,Beclin-1表达降低(P＜0.05)。结论:HDPE可能通过抑制喉癌Hep-2细胞内质网自噬,促进细胞内质网应激凋亡,进而抑制Hep-2细胞增殖能力。     

microRNA-21在大鼠心肌缺氧复氧损伤中的作用及其对细胞自噬的影响

本文应用大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,探讨microRNA-21(miR-21)在大鼠心肌缺氧复氧损伤中的作用及其对细胞自噬的影响.缺氧复氧后,RT-PCR检测发现心肌miR-21表达上调(P0.05),流式细胞术检测表明细胞凋亡增加,RT-PCR及蛋白质印迹(Western blot)检测发现p62显著下调而beclin-1显著上调(P0.05),提示缺氧复氧诱导心肌细胞凋亡和自噬异常.脂质体转染miR-21 mimic后,细胞凋亡显著增加(P0.05),p62显著上调而beclin-1显著下调(P0.05),而转染miR-21抑制剂引起相反结果,提示miR-21在心肌缺氧复氧损伤中具有促进细胞凋亡、抑制细胞自噬的作用.生物信息学预测显示,Rab11a的3′-UTR含有miR-21的结合位点,双荧光素酶基因报告系统及Rab11a过表达实验表明Rab11a是miR-21的靶基因之一.心肌过表达Rab11a能减少缺氧复氧后miR-21介导的细胞凋亡及自噬.由此表明,在大鼠心肌缺氧复氧损伤中,miR-21可能通过负调控Rab11a促进心肌细胞凋亡,抑制心肌细胞自噬.本研究可能为预防和治疗心肌缺血再灌注损伤提供新策略.     

高糖环境下beclin2介导的自噬增强绒毛膜滋养层细胞凋亡

目的探讨高糖对人绒毛膜滋养层细胞早期凋亡及自噬水平的影响。方法取足月妊娠的正常及妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)患者的胎盘组织,透射电镜观察滋养层细胞超微结构的改变。体外用不同浓度的含糖培养基培养滋养层细胞系HTR8/Svneo细胞24h,分为低糖组(1.57mmol/L或LG2 2.25mmol/L),正常对照组(5.57mmol/L)和高糖组(10.57mmol/L、15.57mmol/L或40.57mmol/L);流式细胞术检测细胞早期凋亡率;q-PCR检测细胞内beclin1、beclin2和ATG7等自噬相关基因的m RNA表达水平;Western blot检测Ⅱ型自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3-II)和p62蛋白表达水平。结果透射电镜下可见GDM组滋养层细胞中存在自噬小体且空泡数目明显多于正常足月妊娠组,其游离面微绒毛出现明显倒覆及坍塌现象;在体外培养的滋养层细胞中,流式细胞术检测显示1.57mmol/L低糖组及40.57mmol/L高糖组较正常对照组HTR8/SVneo细胞的早期凋亡率均明显增加;q-PCR分析发现40.57mmol/L高糖组beclin2及ATG7 m RNA表达水平较正常对照组升高,beclin1 m RNA表达无差异;Western blot检测表明,与正常对照组比较,40.57mmol/L高糖组LC3-II蛋白表达水平升高,p62蛋白表达水平降低。结论高糖可通过beclin2介导的自噬信号途径增强滋养层细胞自噬水平进而导致细胞凋亡,并可能与不良的妊娠结局相关。     

自噬在TXNIP过表达诱导的INS-1胰岛细胞凋亡中的作用

硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)是内源性硫氧还蛋白结合抑制蛋白,在糖尿病患者血清和组织中均高表达。本研究观察TXNIP过表达对正常糖脂浓度下培养的INS-1细胞自噬水平的影响,并分析自噬在TXNIP诱导的细胞凋亡中的作用。常规培养的INS-1胰岛细胞分为正常培养组、空病毒(Ad-eGFP)组和TXNIP过表达(Ad-TXNIP-eGFP)组,后两组转染相应腺病毒,48 h后测定TXNIP mRNA和蛋白的表达情况;用Western blot检测各组自噬相关的Beclin-1、LC3和P62的蛋白表达情况,以cleaved caspase 3/caspase 3比值和流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;用IF/ICC法检测各组细胞内自噬体数量的变化。结果显示,与Ad-eGFP组相比,Ad-TXNIP-eGFP组TXNIP mRNA和蛋白表达量均明显升高;与Ad-eGFP组相比,Ad-TXNIP-eGFP组LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1蛋白表达水平升高,P62蛋白表达降低,自噬体荧光强度增强,细胞凋亡率升高,cleaved caspase 3/caspase 3比值上升。使用自噬抑制剂3-MA干预后,与TXNIP过表达组相比,TXNIP过表达+3-MA组自噬明显受到抑制,同时凋亡明显减轻。以上结果提示,在正常糖脂浓度培养下的INS-1细胞过表达TXNIP可以通过诱导自噬促进细胞凋亡。     

Beclin-1 shRNA对低氧诱导的SH-SY5Y细胞自噬的影响

目的：构建Beclin-1基因短发夹干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,感染人SH-SY5Y细胞,观察沉默Beclin-1基因后低氧对SH-SY5Y细胞自噬的影响。方法：构建特异性靶向Beclin-1基因的shRNA慢病毒表达载体和阴性对照序列慢病毒载体;再将载体转染入SH-SY5Y细胞;RT-PCR检测Beclin-1的mRNA表达;Western blot检测Beclin-1蛋白表达;CCK-8法测定Beclin-1 shRNA对SH-SY5Y细胞活力的影响。再将空白对照、阴性对照、转染型三种细胞分别以21%常氧及5%低氧培养,Western blot检测各组细胞LC3蛋白表达;电镜观察自噬小体。结果：Beclin-1 shRNA能明显抑制SH-SY5Y细胞Beclin-1的mRNA及蛋白的表达;沉默Beclin-1基因后,Beclin-1 shRNA组细胞存活率与阴性对照组相比无差异;成功建立了稳定表达Beclin-1 shRNA的SH-SY5Y细胞。5%低氧处理后,与阴性对照组相比较,Beclin-1 shRNA组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下调,细胞内自噬小体数量减少。结论：慢病毒介导的Beclin-1shRNA对SH-SY5Y细胞的活力无影响,但可以抑制低氧诱导的自噬。     

过表达TRAF6对人急性髓系白血病细胞自噬活性的影响

该文旨在探讨过表达肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptorassociated factor 6,TRAF6)对人急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞自噬活性的影响。利用基因表达数据库GEO分析TRAF6在AML患者白血病细胞中的mRNA表达水平。通过癌症基因组图谱TCGA分析TRAF6表达与AML患者临床预后的关系。将TRAF6重组质粒载体转染人AML细胞系(KG-1a和THP-1),采用自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin)和自噬相关抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)、巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1,Baf-A1)分别处理AML细胞。荧光定量PCR、蛋白免疫印迹技术检测过表达TRAF6后白血病细胞自噬标志物(LC3和p62)mRNA和蛋白水平;免疫荧光方法检测LC3绿色荧光斑点结构(puncta);流式细胞术检测细胞凋亡率;CCK-8实验检测AML细胞的体外增殖能力。结果显示,AML患者白血病细胞高表达TRAF6(P<0.01);TRAF6高表达的白血病患者总体生存率和无事件生存率均较TRAF6低表达组显著降低(P=0.01)。TRAF6重组质粒转染能够显著增加两株AML细胞系中TRAF6的mRNA和蛋白水平(P<0.05)。Rapamycin处理能够激活AML细胞系自噬水平,过表达TRAF6后AML细胞LC3 mRNA和LC3II蛋白水平表达上调(P<0.05)、p62 mRNA和蛋白水平下调(P<0.05)以及LC3 puncta聚集增多。用Baf-A1处理以阻断过表达TRAF6的白血病细胞系中的自噬流后,LC3II蛋白表达水平显著提高(P<0.05)。3-MA处理过表达TRAF6的白血病细胞后,LC3II蛋白表达减少、p62蛋白表达增加(P<0.05)。此外,过表达TRAF6降低白血病细胞凋亡率和促进细胞的体外增殖(P<0.001),而过表达TRAF6后联合3-MA处理则可逆转TRAF6对白血病细胞的抗凋亡和促增殖作用(P<0.001)。以上研究结果提示,过表达TRAF6能够增强AML细胞的自噬活性,促进AML细胞的生长。     

苦参素复合长春新碱对HCT-8/VCR细胞耐药性的影响及其机制*

目的: 探究苦参素复合长春新碱对HCT-8/VCR细胞耐药性的影响及其机制。方法: HCT-8/VCR体外培养,分为空白组、苦参素单药组,长春新碱单药组、苦参素和长春新碱联合组,每组6个复孔。CCK-8法检测各组HCT-8/VCR细胞的耐药性;MDC法检测细胞内自噬小泡的变化;ELISA法检测IL-6的含量;Western blot检测自噬相关基因与免疫因子TLR4蛋白的表达水平。结果: 苦参素复合长春新碱可降低HCT-8/VCR细胞的耐药性,逆转倍数为3.23;与空白组比较,苦参素组和联合组自噬体含量降低、IL-6含量也明显降低(P＜0.01),长春新碱组自噬体含量升高,IL-6含量也明显升高(P＜0.01);联合组与苦参素组比较,自噬体含量升高,而IL-6含量降低(P＜ 0.01);Western blot实验表明,与空白组比较,苦参素组P62的表达降低(P＜0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、TLR4均升高(P＜0.05),长春新碱组和联合组P62的表达升高(P＜0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、TLR4均降低(P＜ 0.05);联合组与长春新碱组比较,P62的表达升高(P＜0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、TLR4均降低(P＜0.05)。结论: 苦参素与长春新碱联合可显著降低HCT-8/VCR的耐药性,其机制与抑制自噬活动和TLR4信号活化有关。     

塞内卡病毒A结构蛋白VP2诱导PK-15细胞自噬的研究

本研究在塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)诱导自噬的基础上,着重探究VP2蛋白在细胞自噬过程中的作用。构建VP2基因真核表达载体pcDNA3.1-VP2,将其转染至PK-15细胞,通过检测自噬蛋白和相关基因的表达情况,明确VP2蛋白对细胞自噬的影响。结果显示,本研究成功构建了pcDNA3.1-VP2真核表达载体,且SVA VP2基因在PK-15细胞中正常表达;与对照组相比,VP2蛋白显著上调LC3蛋白的表达水平（P<0.01）;同时,自噬基因LC3、Beclin-1和ATG5转录水平均显著提高（P<0.01）。综上所述,本研究证实SVA VP2蛋白可诱导PK-15细胞自噬,且VP2蛋白与自噬蛋白和基因表达水平呈正相关,为进一步研究病毒感染与致病机制打下基础。     

SIRT3抑制线粒体自噬并减轻高糖加重的神经元缺氧再灌注损伤*

目的:探讨SIRT3调控的线粒体自噬对高糖加重神经元缺氧再灌注损伤的影响及机制。方法:高糖(50 mmol/L)干预HT22细胞后,构建细胞缺氧/复氧模型,利用SIRT3抑制剂3-TYP抑制SIRT3表达。倒置显微镜观察细胞形态改变,CCK8法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,TMRE荧光试剂盒检测细胞线粒体膜电位,RT-qPCR、Western blot检测相关分子的基因和蛋白质表达。结果:高糖使神经元缺氧再灌注后的细胞碎片进一步增加,细胞存活率降低,细胞凋亡率升高(P<0.05)。此外,高糖降低了神经元缺氧再灌注后的线粒体膜电位(P<0.05)。进一步研究发现,高糖上调神经元缺氧再灌注后线粒体分裂相关蛋白DRP1的表达水平,降低了线粒体融合相关蛋白OPA1和线粒体外膜蛋白TOM20的表达;并且增加了自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1和线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin的表达;同时,高糖升高了SIRT3的基因和蛋白质表达(P<0.05)。而SIRT3抑制剂3-TYP使神经元高糖缺氧再灌注损伤加重,同时进一步上调DRP1、LC3Ⅱ和PINK1的蛋白质表达(P<0.05)。结论:高糖可显著加重神经元缺氧再灌注损伤,破坏细胞线粒体功能,激活细胞线粒体自噬;SIRT3可抑制PINK1-Parkin通路介导的线粒体自噬并减轻神经元高糖缺氧再灌注损伤。     

丙泊酚对转化生长因子-β1诱导肝星状细胞激活的影响及其机制

目的: 观察丙泊酚对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肝星状细胞系HSC2-T6细胞激活的影响并探讨其可能的作用机制。方法: 实验分为对照组、TGF-β1组、丙泊酚组、TGF-β1+丙泊酚组、雷帕霉素组、TGF-β1+丙泊酚+雷帕霉素组。先用含雷帕霉素(5 μmol/L)DMEM培养液培养1 h,用丙泊酚(100 μmol/L)处理1 h,然后再加入TGF-β1(5 ng/ml)继续共同培养24 h。细胞的增殖水平通过MTT法测量,细胞培养液上清中透明质酸(HA)、IV型胶原(IV-C)和层粘连蛋白(LN)的浓度采用ELISA法测量,细胞的超微结构采用透射电镜观测,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)及自噬相关基因Beclin 1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)和p62的表达通过Western blot测量。结果: 与对照组比较,TGF-β1组细胞增殖、α-SMA蛋白的表达、培养液上清中HA、IV-C和LN的浓度、自噬体数量、Beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著性增加(P均＜0.05),p-mTOR蛋白的表达和p-mTOR/mTOR比值及p62的蛋白表达显著性降低(P均＜0.05)。与TGF-β1组比较,丙泊酚+TGF-β1组细胞增殖、α-SMA蛋白的表达、培养液上清中HA、IV-C和LN的浓度、自噬体数量、Beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均显著性降低(P均＜0.05),p-mTOR蛋白表达和p-mTOR/TOR比值及p62的蛋白表达均显著性增加(P均＜0.05)。mTOR抑制剂雷帕霉素部分逆转丙泊酚的作用。结论: 丙泊酚抑制TGFβ1诱导的肝星状细胞激活,其机制涉及mTOR-自噬途径。     

慢病毒转染SPOP基因对滋养层细胞HTR8-SVneo增殖和侵袭的影响及其机制

为了探讨慢病毒转染SPOP基因后对滋养层细胞HTR8-SVneo增殖和侵袭能力的影响,并阐明其可能的机制,分别构建过表达和敲低SPOP基因的慢病毒载体,转入到HTR8-SVneo细胞中。分别在荧光显微镜下观察转染的荧光效率。用qRT-PCR法检测感染病毒后的细胞中SPOP mRNA的表达量,Western blotting法检测各组细胞中SPOP、PTEN、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β和GAPDH的表达量。采用CCK-8法检测各组细胞的增殖活力,Transwell小室法检测各组细胞的侵袭能力。结果显示,在HTR8-SVneo、JAR和JEG3这3种滋养层细胞中,HTR8-SVneo细胞中SPOP蛋白表达相对最高。HTR8-SVneo细胞经慢病毒转染后,与对照组比较,过表达组中SPOP mRNA和蛋白表达量明显升高(p0.01),PTEN蛋白表达量升高,而p-AKT和p-GSK3β表达量降低,细胞的侵袭能力明显下降(p0.05),细胞增殖活力无明显变化。相反,敲低组中SPOP mRNA和蛋白表达量明显下降(p0.01),PTEN蛋白表达量降低,p-AKT和p-GSK3β表达量升高,细胞的侵袭能力和增殖活力均明显增强(p0.05)。研究结果表明,慢病毒转染SPOP基因可以影响滋养层细胞HTR-8/SVneo的增殖和迁移能力,其机制可能与PTEN/AKT/GSK3β信号通路调节有关。     

海马神经元缺血/再灌注后自噬的表达及其作用

目的：研究自噬在大鼠海马神经元缺血缺氧/再灌注过程中的表达及自噬在神经元缺血缺氧/再灌注损伤中的作用。方法：原代培养的大鼠海马神经元经2 h的氧糖剥夺和不同时段的再灌注处理,MTT法检测细胞活性,透射电镜下检测自噬的特异性结构,免疫荧光化学法检测自噬特异性蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3B）的表达。应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）检测神经元的活性。结果：经氧糖剥夺/再灌注后,海马神经元的活性比未经氧糖剥夺/再灌注组显著地降低。透射电镜和免疫荧光检测,未经氧糖剥夺/再灌注的神经元自噬的发生率极低,氧糖剥夺后和再灌注的不同时间段,均有自噬的发生。应用自噬抑制剂3-MA阻断自噬后,神经元的存活率显著降低。结论：缺血缺氧/再灌注能激活海马神经元的自噬,并可能在缺血缺氧/再灌注过程中起对抗损伤的作用。     

HIF-1α/VEGF在稽留流产患者绒毛组织中的表达及其与微血管密度的关系

目的:探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)/血管内皮生长因子(VEGF)在稽留流产患者绒毛组织中的表达及其与微血管密度的关系。方法:采用免疫组织化学方法分别检测了30例人工流产和30例稽留流产患者绒毛组织的微血管密度(MVD)、HIF-1α和VEGF的表达。分别在缺氧(1%O_2、5%CO_2和94%N_2)和常氧(20%O_2、5%CO_2和75%N_2)条件下培养HTR8/SVneo细胞,并通过转染HIF-1αsi RNA来敲低HIF-1α。通过q RT-PCR和Western blot分析HTR8/SVneo细胞中HIF-1α和VEGF的m RNA和蛋白表达。此外,通过小管形成实验评价缺氧及转染HIF-1αsi RNA对HTR8/SVneo细胞小管形成的影响。结果:稽留流产组织样本中的MVD显著低于人工流产(7.22±0.55 vs 14.65±1.12,P0.05)。HIF-1α和VEGF在稽留流产组织中的表达显著低于人工流产组织(P0.05)。HIF-1α和VEGF的表达均与MVD显著正相关。与常氧相比,缺氧可显著上调HIF-1α和VEGF的m RNA和蛋白水平(P0.05)。转染HIF-1αsi RNA显著下调HIF-1α和VEGF的m RNA和蛋白水平(P0.05)。与常氧相比,缺氧可显著促进HTR8/SVneo细胞的小管形成(P0.05),而转染HIF-1αsi RNA则可显著抑制显HTR8/SVneo细胞的小管形成(P0.05)。结论:胎盘发育过程中的缺氧环境丢失及HIF-1α/VEGF的抑制可能是稽留流产发病的一项机制。     

不同浓度桦木酸对人胃癌MGC-803细胞自噬的影响

目的: 本研究利用不同浓度桦木酸处理人胃癌MGC-803细胞,以探究其对细胞自噬的影响。方法: 将人胃癌MGC-803细胞分为4组,每组3个复孔,对照组不加桦木酸处理,其余三组分别加入终浓度为10、20、30 mg/L桦木酸。桦木酸处理细胞48 h后,qRT-PCR检测桦木酸对人胃癌MGC-803细胞自噬相关基因mRNA表达的影响。Western blot检测药物处理细胞自噬相关基因的蛋白表达。利用免疫荧光检测药物处理后MGC-803细胞内LC3蛋白的胞内定位及表达。结果: 与对照组相比,在10～30 mg/L浓度范围内,桦木酸处理的人胃癌MGC-803细胞LC3、Beclin-1 mRNA的表达明显升高(P＜0.05),Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表达显著升高(P＜0.05),LC3-Ⅰ蛋白的表达明显降低(P＜0.05),其中30 mg/L处理组表现最佳。此外,桦木酸还可诱导MGC-803细胞LC3蛋白在细胞质内形成点状聚集。结论: 在10～30 mg/L浓度范围内,桦木酸能诱导人胃癌MGC-803细胞发生自噬。     

HCMV感染对胶质瘤细胞U87自噬的影响

研究人巨细胞病毒(HCMV)感染对神经胶质瘤U87细胞自噬的影响。通过观察微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬相关基因Beclin1及其蛋白表达的变化,从而探讨HCMV与神经胶质瘤发生、发展的关系及意义。用HCMV AD169(MOI=5)感染神经胶质瘤U87细胞,同时将未感染HCMV的U87细胞作为对照组。分别在6、12、24、48 h用RT-PCR检测Beclin1的表达,Western-blot和免疫荧光检测Beclin1和LC3编码蛋白的表达,最后用CCK-8检测细胞的增殖活性。结果显示,HCMV感染的U87细胞LC3-II蛋白表达水平逐渐下降(P<0.05);同时,HCMV感染的U87细胞Beclin1基因及蛋白的表达水平也逐渐下降(P<0.01),且HCMV感染U87细胞增殖显著(P<0.01)。以上结果表明,HCMV感染抑制胶质瘤U87细胞自噬,并会引起Beclin1表达水平下调,进而导致胶质瘤细胞增殖。     

细叶远志皂苷在Aβ23-35诱导SH-SY5Y 细胞氧化损伤中的作用及机制研究

为研究细叶远志皂苷(tenuifolin,TEN)在Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤中的作用,并探讨其作用机制。建立Aβ25-35诱导的细胞损伤模型,细叶远志皂苷以及自噬抑制剂3-MA进行干预,显微镜观察细胞形态变化,试剂盒检测细胞氧化应激水平,RT-qPCR和Westernblot检测细叶远志皂苷以及自噬抑制剂干预前后Beclin-1、LC3、mTOR、AMPK和ULK1mRNA及蛋白水平变化。结果发现,TEN改善Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞形态损伤和细胞活力下降;降低ROS和MDA浓度,并提高SOD、GSH-Px及过氧化氢酶的活性;增加AMPK和ULK1的表达,减少mTOR的表达及增加Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达水平。而加入3-MA会拮抗TEN的作用。总之,TEN可能通过调控AMPK/mTOR/ULK1通路,增加Beclin-1及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平激活自噬,进而改善Aβ25-35诱导的细胞形态损伤和细胞活力下降,提高细胞抗氧化应激能力,发挥神经保护作用。     

p21在滋养细胞迁移和侵袭中的作用研究

目的探究p21基因在正常滋养细胞迁移和侵袭中的作用以及可能的机制。方法通过siRNA敲低滋养细胞HTR-8/SVneo中的p21基因。通过细胞增殖实验、划痕实验以及Transwell小室侵袭实验,来观察p21敲低的滋养细胞迁移和侵袭能力的变化。通过实时荧光定量PCR(qPCR)和免疫印记分析(Western Blot),在mRNA和蛋白质水平上检测p21敲低对ERK3和MMP2表达的影响。结果 p21敲低的滋养细胞迁移和侵袭能力显著减弱,但对细胞增殖无影响。ERK3及MMP2在mRNA和蛋白质水平上的表达都显著降低。结论以上结果说明p21基因能促进正常滋养细胞的运动能力,这种作用与调节ERK3和MMP2的表达有关。     

RTN4对于结肠癌细胞增殖的调控作用

2018年全球癌症统计调查显示,结直肠癌约占患癌新病例的12.1%。因此,寻找新的结肠癌发生有关的基因,发现新的治疗靶点显得尤为迫切。通过数据库分析发现,RTN4基因的表达水平与结肠癌患者生存率的相关性具有统计学意义。针对RTN4基因构建其干扰质粒,将慢病毒作为载体转染结肠癌HCT116细胞中构建敲低RTN4的结肠癌细胞系,最后检测了低表达后RTN4基因的细胞增殖。结果发现,敲低RTN4基因后显著促进了结肠癌细胞HCT116的增殖,研究通过Western blot观察敲低RTN4后HCT116细胞自噬通路相关蛋白p62和LC3的表达情况,发现与对照组相比较,敲低RTN4组LC3转化量（LC3-II/LC3-I）增多,而p62蛋白减少。研究分析了RTN4的潜在抑癌作用,发现敲低RTN4基因会显著增强结肠癌细胞的增殖能力,并且诱导自噬,说明RTN4可能与激活LC3/p62自噬途径有关。     

自噬在高压氧预处理预防脊髓缺血再灌注损伤中 的作用机制研究*

目的:研究自噬在高压氧预处理预防脊髓缺血再灌注损伤中的机制。方法:新生大鼠脊髓神经元原代培养,分为对照组(氧糖剥夺)和高压氧(HBO)预处理组。通过应用免疫组织化学、Western blot分析两组LC3-Ⅱ与凋亡相关分子Beclin-1,Bcl-2,Casp-ase-3的表达变化。结果:发现重复高压氧预处理对氧糖剥夺诱导原代培养的脊髓神经元损伤具有明显的保护作用。免疫组化和Western blot显示与对照组相比高压氧预处理显著增加脊髓神经元细胞Bcl-2的表达,降低Beclin-1,Caspase-3以及自噬的特异性标记蛋白LC3-Ⅱ的表达。氧糖剥夺后对照组与高压氧组相比,LDH释放量明显增多(P<0.05)。结论:HBO预处理通过调节自噬减轻缺血再灌注损伤,为HBO预处理神经保护提供一条新的作用机制。     

自噬途径在低氧暴露诱导骨骼肌萎缩中的调节作用机制

该研究拟通过在体和离体实验观察低氧暴露诱导肌萎缩现象,并探究其作用机制是否与自噬途径有关。SD大鼠进行低氧(氧浓度为12.4%)暴露干预。4周后,测量体质量、瘦体质量、体成分、趾长伸肌(EDL)湿重,观察肌纤维形态,计算肌纤维横截面积(FCSA),PCR芯片分析自噬差异表达基因功能。在低氧环境下使用自噬抑制剂3-MA干预L6肌管细胞,检测自噬关键蛋白选择性自噬接头蛋白(p62)、肌球蛋白样BCL2结合蛋白1(Beclin1)、微管蛋白轻链3(LC3)的表达,统计肌管直径,检测肌萎缩相关蛋白肌球蛋白重链(Myosin)、肌肉特异性环指蛋白1(MuRF1)和肌萎缩F-box蛋白(Atrogin1)的表达。结果显示,大鼠低氧后,体质量、瘦体质量及其百分含量、EDL湿重及其百分含量、FCSA显著降低(P0.05,P0.01);低氧后EDL中自噬差异基因表达以上调为主,功能主要富集于自噬囊泡形成等过程;L6肌管细胞在低氧暴露下,自噬关键蛋白表达增加,肌萎缩相关蛋白表达增加,肌管直径减小,而在低氧条件下使用抑制剂3-MA,可抑制自噬,缓解肌管萎缩(P0.05)。结果表明,低氧暴露可通过提高自噬水平导致肌萎缩的发生,自噬前期的激活在其中发挥重要作用。