水稻细菌性条斑病菌中分泌蛋白质组表达谱的研究

水稻细菌性条斑病菌(Xamthomonas.oryzae pv.oryzicola,Xoc)是水稻的主要病原菌之一,其引发的水稻细菌性条斑病可造成水稻严重减产。本研究以Xoc GX01作为实验菌株,通过细菌培养、分泌蛋白提取、纯化获得总分泌蛋白,将样品酶解后通过LC-MS/MS技术鉴定了分泌蛋白质表达谱,共鉴定蛋白质661个,同时利用生物信息学技术对鉴定蛋白进行基因本体(gene ontology,GO)生物学分类,对生物功能、生物进程以及细胞组件进行了说明。为阐明植物病原菌的作用机理以及植物-病原细菌互作提供了理论基础。     

抑制水稻细菌性条斑病菌的没食子酸分离及其对水稻细菌性条斑病的防治作用

通过液—液萃取、硅胶和凝胶柱层析法,从佛甲草(Sedum lineare)分离出一种可以抑制水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)生长的单体化合物,经质谱分析,确定该化合物为没食子酸(gallic acid,GA)。在30 mg·m L-1浓度下,GA能抑制一些植物病原细菌如桃细菌性穿孔病菌(X.campestris pv.pruni)、水稻细菌性条斑病菌(X.oryzae pv.oryzicola)、水稻白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)、柑橘溃疡病菌(X.axonopodis pv.citri)、大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea)、番茄细菌性斑点病菌(P.syringae pv.tomato)和胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovora subsp.carotovora)的生长;GA还对11种植物病原真菌如烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)、指状青霉(Penicillium digitatum)、滇刺枣褐腐病菌(Streptobotrys streptothrix)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、芒果拟盘多毛孢(Pestalotiopsis mangiferae)、新月弯孢霉(Curvularia lunata)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、(Fusarium oxysporum f.sp.niverum)、西瓜专化型尖孢镰刀菌(F.oxysporum f.sp.nicotianae)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)和齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)的生长具有一定的抑制作用。在300 mg·m L-1浓度下,GA对水稻细菌性条斑病的田间防治效果达到64.62%。该研究结果表明没食子酸具有开发成为一种防治水稻细菌性条斑病的杀菌剂的潜力。     

水稻细菌性条斑病菌rpfC/rpfG的功能分析

水稻细菌性条斑病菌(Xamthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)是水稻的重要病原菌之一,其引起的水稻细菌性条斑病对水稻粮食产量造成重大损失。本研究利用水稻细条病菌广西分离株GX01作为出发菌株,采用同源双交换的方法分别构建rpf C和rpf G的缺失突变体,并研究其生物学功能。结果表明,与野生型GX01相比,缺失突变体Δrpf C和Δrpf G的致病力和在非寄主烟草上的过敏反应严重下降,胞外多糖合成、游动性和渗透压耐受能力明显降低,生物膜形成和絮凝能力显著增加,而互补菌株能基本将表型补回至野生型水平,表明rpf C和rpf G是重要的致病相关基因。本实验为进一步研究rpf C/rpf G基因在水稻条斑病菌的调控机理提供了前期资料。     

水稻品种资源对细菌性条斑病菌的抗性评价

选育和应用抗病品种是防治水稻细菌性病害最经济、有效的方法,抗性资源的筛选及利用是选育抗病品种的前提。本研究利用苗期喷雾法对中国59个水稻品种、318份国外稻种资源以及13个抗白叶枯病近等基因系进行了细菌性条斑病抗性评价。测定的59个中国水稻品种对测试的细菌性条斑病病原均表现出感病;在鉴定的318个国外稻种资源中,抗细菌性条斑病的材料有82个,其中高抗和抗的稻种资源有POPONG、IR63372-8、WEDA HEENATI、BALAYAN、GHARIBE等17份;在测试的13个抗白叶枯病近等基因系中,仅有IRBB5表现出抗细菌性条斑病,对白叶枯病抗谱较广的IRBB21、CBB23对测试的病菌表现出高感。应用SPSS统计软件,对82个抗细菌性条斑病的稻种资源和13个抗白叶枯病近等基因系的细菌性条斑病和白叶枯病的抗性相关性分析结果分别为r值0. 103和P值0. 358( 0. 05)、r值0. 527和P值0. 064( 0. 05),表明测试稻种对两病的抗性没表现出相关性。利用xa5基因功能标记,对79个抗细菌性条斑病资源进行了xa5基因检测,结果显示有30个品种含有xa5基因,其余49个不含xa5基因。本研究筛选出的49个抗性稻种资源对抗细菌性条斑病基因的挖掘以及品种的创制具有重要的价值。     

没食子酸对水稻细菌性条斑病菌细胞结构的影响

没食子酸(gallic acid, GA)是一种植物酚类化合物,具有多种生物活性。前期实验发现,GA对水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)具有较强的抑制作用。为了解该物质对Xoc的细胞结构和细胞膜的影响,该研究用电子显微镜观察GA对Xoc的形态结构的影响,通过测定GA处理后的Xoc培养液的电导率、紫外吸收物含量(260 nm的吸光值)、乳酸脱氢酶的活性以及菌体的二乙酸荧光素(fluorescein diacetate, FDA)的强度等,探讨了GA对Xoc细胞膜的完整性和通透性的影响。结果表明:经浓度为200 μg·mL^-1的 GA处理后,Xoc的菌体形态结构发生改变,表面有明显的凹陷或不规则囊泡状突起,表明GA对Xoc细胞壁有损伤作用。200 μg·mL^-1的GA处理24 h后,病菌培养液的电导率为135.48 μS·cm^-1(对照处理为127.85 μS·cm^-1)。GA处理2 h后,Xoc细胞荧光强度下降58.10%,说明病菌细胞内电解质外渗和细胞溶质发生渗漏; 同时,乳酸脱氢酶的活性增加,表明菌体的细胞膜受到破坏。此外,GA处理24 h后,Xoc培养液在260 nm下的吸光值为1.004(对照处理为0.018),表明病菌细胞膜的完整性受到破坏。这表明GA不仅破坏Xoc的细胞膜通透性,而且还影响膜的完整性。     

水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的实时荧光PCR快速检测鉴定

成功建立了水稻白叶枯菌与水稻细菌性条斑病菌快速检测鉴定的实时荧光PCR方法。根据含铁细胞接受子基因设计两菌的通用引物PSRGF/PSRGR（扩增一个152bpDNA片段）和特异性探针（Baiprobe和Tiaoprobe）,并对13种细菌和1种植原体进行实时荧光PCR。结果表明,两个特异性探针能分别特异性检测到目标病原菌产生荧光信号而其它参考菌不产生荧光信号。检测的绝对灵敏度是30.6fg/μL质粒DNA和103CFU/mL的菌悬浮液,相当于1个细菌细胞的基因,比常规PCR电泳检测高约100倍,相对灵敏度为105CFU/mL。整个检测过程只需2h,完全闭管,降低了污染的机会,无需PCR后处理。 用这两个特异性探针分别对自然感染白叶枯菌和条斑菌的叶片DNA提取液和种子浸泡液进行实时荧光PCR,结果均可特异性检测到目标菌的存在并完全可将两种病原细菌区分开来,且只需03g叶片和10g种子。     

抑制水稻细菌性条斑病菌的没食子酸分离及其对水稻细菌性条斑病的防治作用（英文）

通过液—液萃取、硅胶和凝胶柱层析法,从佛甲草(Sedum lineare)分离出一种可以抑制水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)生长的单体化合物,经质谱分析,确定该化合物为没食子酸(gallic acid,GA)。在30 mg·mL~(-1)浓度下,GA能抑制一些植物病原细菌如桃细菌性穿孔病菌(X.campestris pv.pruni)、水稻细菌性条斑病菌(X.oryzae pv.oryzicola)、水稻白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)、柑橘溃疡病菌(X.axonopodis pv.citri)、大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea)、番茄细菌性斑点病菌(P.syringae pv.tomato)和胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovora subsp.carotovora)的生长;GA还对11种植物病原真菌如烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)、指状青霉(Penicillium digitatum)、滇刺枣褐腐病菌(Streptobotrys streptothrix)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、芒果拟盘多毛孢(Pestalotiopsis mangiferae)、新月弯孢霉(Curvularia lunata)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、(Fusarium oxysporum f.sp.niverum)、西瓜专化型尖孢镰刀菌(F.oxysporum f.sp.nicotianae)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)和齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)的生长具有一定的抑制作用。在300 mg·mL~(-1)浓度下,GA对水稻细菌性条斑病的田间防治效果达到64.62%。该研究结果表明没食子酸具有开发成为一种防治水稻细菌性条斑病的杀菌剂的潜力。     

浙江1株水稻细菌性条斑病菌株的分离鉴定

细菌性条斑病(简称细条病)是水稻的重要病害之一,随着气候的变暖,某些水稻品种有逐年发生加重的趋势,对产量影响较大。2013年浙江省金华市部分水稻种植区域发生细条病,发病严重的田块减产30%以上。采用组织分离法从发病水稻叶片分离获得6株细菌菌株,选择典型菌株JH01回接水稻幼苗,进行柯赫法则验证。接种后发病症状与自然发病症状一致,并重新分离得到此菌株,证明菌株JH01为水稻细条病的致病菌。通过形态学观察、常规生理生化指标测定、16S rDNA 序列测定和同源性分析,鉴定菌株JH01为稻黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xoc）。     

水稻细菌性条斑病菌RpfCxoc/RpfGxoc双组分系统的功能

【目的】旨在阐明双组分系统RpfCxoc/RpfGxoc在水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)DSF(diffusible signal factor)合成、致病性等相关方面的生物学功能。【方法】以Xoc野生型菌株Rs105为母体,利用自杀载体pK18mobsacB缺失突变rpfCxoc、rpfGxoc和rpfGCxoc(rpfCxoc和rpfGxoc双基因),测定突变体及其互补菌株的DSF合成水平、对水稻的致病性、胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS)产量、菌体形态及群体结构。【结果】从Rs105基因组中克隆了rpfCxoc和rpfGxoc基因,并获得了相应的单基因或双基因缺失突变体。与Rs105相比,ΔrpfCxoc和ΔrpfGCxoc过量合成DSF信号分子,但是ΔrpfGxoc合成DSF的能力显著下降;rpfCxoc和rpfGxoc单基因或双基因的缺失突变均导致Xoc的致病性丧失,EPS合成水平下降34.1%-48.5%,形成菌体高度聚集的生物膜结构。【结论】RpfCxoc/RpfGxoc双组分系统调控Xoc的DSF生物合成、EPS产生和生物膜的驱散,是Xoc保持致病性所必需的因子。     

水稻细菌性条斑病菌REC结构域蛋白基因vemRXoc的功能鉴定

水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)是水稻的主要病原细菌之一,该菌引起的水稻细菌性条斑病可导致水稻减产、品质下降.Xoc GX01菌株基因组中含有一个与十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)的致病相关基因vemR一致性高达95.27%的同源基因XOC2152,其编码蛋白中含有磷酸信号识别受体REC结构域.为了研究XOC2152基因在Xoc中的生物学功能,本研究通过基于自杀质粒pK18mob同源整合方法,构建了XOC2152的非极性突变体NK2152.该突变体的胞外多糖产量仅为野生菌株的27.33%,平板游动半径为野生菌株的40.96%,对铜离子耐受能力极显著降低.针刺接种水稻(日本晴品种) 10 d后,Xoc GX01处理的病斑平均长度为(3.86±1.19) cm,而突变体NK2152处理的病斑长度为(0.98±0.45) cm.带有该基因片段的pLAFR3可以互补突变体的表型和致病力变化.上述结果表明XOC2152基因具有与Xcc的vemR类似的功能,被命名为vemRXoc基因.本研究表明XOC2152基因(vemRXoc基因)与水稻细菌性条斑病菌的致病力、胞外多糖产量、运动能力以及对铜离子的耐性等相关.     

没食子酸对水稻细菌性条斑病菌细胞结构的影响（英文）

没食子酸(gallic acid,GA)是一种植物酚类化合物,具有多种生物活性。前期实验发现,GA对水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xoc)具有较强的抑制作用。为了解该物质对Xoc的细胞结构和细胞膜的影响,该研究用电子显微镜观察GA对Xoc的形态结构的影响,通过测定GA处理后的Xoc培养液的电导率、紫外吸收物含量(260 nm的吸光值)、乳酸脱氢酶的活性以及菌体的二乙酸荧光素(fluorescein diacetate,FDA)的强度等,探讨了GA对Xoc细胞膜的完整性和通透性的影响。结果表明:经浓度为200μg·mL~(-1)的GA处理后,Xoc的菌体形态结构发生改变,表面有明显的凹陷或不规则囊泡状突起,表明GA对Xoc细胞壁有损伤作用。200μg·mL~(-1)的GA处理24 h后,病菌培养液的电导率为135.48μS·cm~(-1)(对照处理为127.85μS·cm~(-1))。GA处理2 h后,Xoc细胞荧光强度下降58.10%,说明病菌细胞内电解质外渗和细胞溶质发生渗漏;同时,乳酸脱氢酶的活性增加,表明菌体的细胞膜受到破坏。此外,GA处理24 h后,Xoc培养液在260 nm下的吸光值为1.004(对照处理为0.018),表明病菌细胞膜的完整性受到破坏。这表明GA不仅破坏Xoc的细胞膜通透性,而且还影响膜的完整性。     

水稻细菌性条斑病原菌的快速诊断

水稻细菌性条斑病是热带,亚热带地区水稻的一种严重病害。发病品种主要是籼稻,尤其是籼型杂交稻为高。我国条斑病发生面积呈扩大趋势,并能通过种子带菌传播,已被列为检疫对象。利用富含A蛋白的金黄色葡萄球菌与水稻条斑菌的抗血清结合,同待检样品进行协同凝集反应(coagglutination),即能迅速准确地进行早期诊断。在实验室及田间对该方法的特异性准确性进行了研究,并对青枯、白叶枯等的交叉及白叶枯的血清分型也进行了研究。     

水稻细菌性条斑病菌中假定编码甲基趋化蛋白的基因的功能初步研究

水稻细菌性条斑病菌(Xamthomonas.oryzae pv.oryzicola,Xoc)是水稻的主要病原菌之一,其引发的水稻细菌性条斑病可造成水稻严重减产。本文利用水稻细菌性条斑病菌广西分离株GX01作为实验菌株,获得XOC2233基因的Tn5插入突变体,XOC2233编码为假定的甲基受体趋化性蛋白,本实验对其生化表型以及致病性的研究表明,突变体的致病力与野生型相比没有明显变化,但其胞外多糖产量和游动性增强,且其胞外蛋白酶的活性有所降低,而互补菌株均能恢复其表型到野生型水平。根据本研究的结果推测XOC2233基因可能通过对鞭毛的合成控制影响胞外多糖的分泌,为进一步研究XOC2233基因在水稻条斑病菌胞外多糖代谢途径中的作用提供了基础。     

转鞭毛蛋白基因水稻细菌性条斑病抗性研究

该研究从生防菌枯草芽胞杆菌Bs-916中克隆了鞭毛蛋白基因,利用转基因载体pCAMBIA1300转入水稻,筛选得到98株阳性转基因植株。分子检测结果表明,有12个转基因株系可检测到目的基因的表达。随后抗病性鉴定表明,有3个转基因株系对水稻细菌性条斑病具有较高的抗性。该研究为目前水稻抗细菌性条斑病转基因研究拓宽了可应用基因资源的范围。     

水稻细菌性条斑病菌中受DSF 调控的鞭毛基因flgD、flgE 的功能分析

[目的]为了阐明可扩散性信号分子(diffusible signal factor,DSF)调控的鞭毛基因对水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)Rs105的致病性等方面的影响.[方法]采用PCR的方法克隆靶标基因flgDxoc和flgExoc,用同源重组法构建缺失突变体,测定突变体及其互补菌株的菌体形态、运动性、致病性及过敏性反应等表型,用反转录PCR(RT-PCR)的方法验证Rs105和ArpfFxoc(rpfFxoc基因的缺失突变体,不产生DSF)中flgDxoc、、flgExoc表达量的差异.[结果]从Rs105基因组中克隆到flgDxoc、flgExoc基因,并证实这两个基因在基因组中均为单拷贝.PCR和Southern杂交结果显示,flgDxoc、flgExoc基因被成功敲除.与野生型相比,突变体的鞭毛产生能力丧失,游动性和趋化性能力减弱,接种水稻叶片显示其致病性部分减弱,基因互补可使其恢复.生长能力和对烟草叶片的致敏性无明显改变.RT-PCR结果显示,flgDxoc、flgExoc基因在△rpfFxoc中的转录水平明显降低.[结论]本试验表明:FlgD、FlgE是水稻细菌性条斑病菌鞭毛形成所必需的因子;进一步证明了DSF通过调控flgDxoc、flgExoc基因表达,从而影响条斑病菌的致病性等表型.为深入认识DSF对细菌性条斑病菌鞭毛基因簇的调控提供了科学依据.     

水稻细菌性条斑病和抗性育种研究进展

水稻细菌性条斑病(简称细条病)是由Xanthom onas oryzae pv. oryzicola侵染引起的全球性病害,对水稻生产构成严重威胁。发掘和利用新抗源、定位克隆抗性基因及深入了解病原菌—水稻之间的相互作用机理等对于水稻抗细条病研究有重要意义。本文主要介绍了细条病的抗性鉴定与抗源筛选、抗性基因遗传分析与分子标记定位、抗性基因的克隆、抗性育种的研究现状,提出了加快抗细条病育种研究进程的建议。     

水稻细菌性条斑病和白叶枯病抗性遗传研究

分析了Ｈａｓｈｉｋａｌｍｉ,Ｄｕｌａｒ和９０ＩＲＢＢＮ４４三个抗源品种对水稻细菌性条斑病Ｓ－１０３菌株和白叶枯病Ｐ１菌系的抗性遗传。结果表明,Ｈａｓｈｉｋａｌｍｉ和Ｄｕｌａｒ对Ｓ－１０３的抗性均由２对隐性基因所控制,９０ＩＲＢＢＮ４４则带有１对隐性抗性基因。经等位性测定表明,Ｈａｓｈｉｋａｌｍｉ和Ｄｕｌａｒ的２对基因中至少有１对是等位的,但它们与９０ＩＲＢＢＮ４４的１对基因均不等位。３个抗源品种对Ｐ１的抗性都受１对隐性基因控制,该基因与ｘａ－５等位。连锁遗传分析表明,Ｈａｓｈｉｋａｌｍｉ和Ｄｕｌａｒ对Ｓ－１０３的２对抗细条病基因中的１对与ｘａ－５相连锁,而９０ＩＲＢＢＮ４４的１对抗性基因与ｘａ－５呈独立遗传。本文还就开展水稻抗细菌性条斑病育种进行了讨论。     

水稻条斑病细菌hrp基因诱导表达系统的建立

水稻条斑病细菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)决定在非寄主植物上激发过敏反应(hypersensitive response)和在寄主水稻上具致病性(pathogenicity)的hrp基因簇是诱导表达的。为研究hrp基因的功能,利用hpa1和hrpX基因的启动子与gfp基因进行融合,构建了hrp基因诱导表达系统。绿色荧光蛋白表达揭示,Xooc的hrp基因在营养丰富的NB培养基上不能有效表达,在hrp诱导培养基XOM3上可有效表达。以hrpX和hrpG突变体为参照,RT-PCR研究结果提示,Xooc野生型菌株hpa1基因在NB上不能有效表达,在XOM3培养基上可有效表达。相应地,hrpX突变体中hpa1基因不能被诱导表达,而在hrpG突变体中hpa1基因转录表达水平低于野生菌。研究结果还证实,水稻悬浮细胞能高效诱导Xooc的hrp基因表达。Xooc hrp基因诱导表达系统的建立为研究hrp基因功能、发掘T3SS效应分子以及开展Xooc致病性研究奠定了基础。     

基于LC-MS/MS策略建立水牛卵母细胞蛋白质表达谱的方法研究

本研究采用了LC-MS/MS策略对如何建立水牛卵母细胞蛋白质表达谱进行了探讨,为后续研究不同时期的水牛卵母细胞和早期胚胎卵裂分化过程中蛋白质组变化建立研究平台。本实验收集水牛GV期和MⅡ期卵母细胞各500枚,去除透明带后将两个时期的细胞混合后提取蛋白质,蛋白质酶解后通过强阳离子交换色谱预分离多肽混合物,预分离后的馏分采用EASY-n LC结合LTQ-Orbitrap质谱鉴定蛋白质表达谱。通过SEQUEST检索,共鉴定出574种蛋白质,生物信息学分析表明,有明确分子功能相关的蛋白质有487种,与组成细胞成分相关的蛋白质有476种,与生物学进程相关的蛋白质有490种,初步建立了一套获得水牛卵母细胞蛋白质表达谱的方法。结果表明建立的LC-MS/MS策略方法适合于水牛卵母细胞蛋白质组学的研究,卵母细胞蛋白质表达谱数据为今后研究水牛不同时期的卵母细胞和早期胚胎卵裂分化过程中蛋白质组学奠定了方法与理论基础。     

炭样小单孢菌产抗生素对水稻细菌性条斑病菌的抗菌作用及其机理

【背景】水稻细菌性条斑病菌为水稻细菌性条斑病的病原菌,土壤中分离到的一株具有广谱抗菌活性的炭样小单孢菌JXNU-1,其发酵产物(即抗生素JX)对植物病原菌具有较强的抑菌活性。【目的】研究抗生素JX对水稻细菌性条斑病菌的抗菌作用及其机理。【方法】采用杯碟法测定抑菌圈大小,二倍稀释法测定最低抑菌浓度、最低杀菌浓度,并且从菌体形态观察、电导率变化、培养液大分子漏出、蛋白质合成、核酸合成和膜电位变化6个方面探究其作用机理。【结果】抗生素JX对水稻细菌性条斑病菌的抑菌圈直径达18.84±0.28mm,最低抑菌浓度和最低杀菌浓度分别为1.39μg/m L和2.78μg/mL,且杀菌速度很快,作用12 h的杀菌率达100%。在抗生素JX作用下,水稻细菌性条斑病菌的细胞形态发生改变,培养液电导率、膜电位和大分子漏出量均随抗生素浓度增加而增大,但菌体蛋白质含量随着抗生素浓度增加而降低,同时,通过实时荧光定量PCR方法检测发现ef-p表达量下调。【结论】抗生素JX对水稻细菌性条斑病菌具有较强的抗菌作用,推测其抑菌机理是通过抑制菌体蛋白质的生物合成和影响细胞膜完整性而起作用。