Bacillus pumilus阿拉伯呋喃糖苷酶的重组表达及水解木聚糖的研究

从短小芽孢杆菌中克隆阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43并重组表达,有利于将该酶分离纯化后应用于其他半纤维素多糖的水解。该研究利用E.coli BL21表达系统对实验室克隆到的短小芽孢杆菌的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43进行重组表达并分析其酶学性质,将重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43和来源于棒曲霉突变菌株的商业木聚糖酶联合作用于燕麦木聚糖。结果表明:以燕麦木聚糖为底物,重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43的最适温度为50℃,最适p H为6.0。该酶在p H 5.0~10.0和45~55℃下较稳定。与木聚糖酶单独作用相比,重组Xyn43酶与商业木聚糖酶同时加入以及先用木聚糖酶水解后加入Xyn43酶,水解产物中的还原糖含量分别增加了16%和20%,木糖含量增加了35%和48%。该结果研究结果表明重组Xyn43酶能够和商业木聚糖酶协同降解燕麦木聚糖,提高水解效率,产生更多的木寡糖,阿拉伯糖和木糖。     

青霉L1来源具有生产木寡糖应用潜力的高比活GH11木聚糖酶

木聚糖酶是一种备受关注的糖苷水解酶,能够应用于酿造、饲料、制药、生物能源等多个领域,但是目前大部分木聚糖酶在低于30℃的环境中活力较低。为了获得在较低温度下具有高活力的木聚糖酶,从青霉L1(Penicilliumsp.L1)中克隆到一条GH11木聚糖酶基因XYN11A,并在毕赤酵母GS115中进行异源表达。经过纯化和酶学性质测定,该酶的最适p H和最适温度分别为3.5-4.0和55℃,能够在酸性和中性缓冲液(p H 1.0-7.0)中以及40℃下保持稳定,同时对所有已测试的金属离子和化合物都有一定的抗性。值得注意的是,该酶具有GH11家族中比较高的比活力6 700 U/mg,另外,该酶在较低温度20-40℃亦可展现出较高的酶活力(24%-58%)。经过16 h的榉木木聚糖水解实验,该木聚糖酶的水解产物主要是木二糖、木三糖和木四糖,几乎不产生单体木糖。因该酶同时具有产寡糖、较低温度下活力高以及嗜酸性等3种特性,XYN11A在食品和饲料工业中具有巨大的应用潜力。     

Bacillus pumilus WL-11木聚糖酶A的纯化、鉴定及其底物降解方式

对一株Bacilluspumilus WL_11木聚糖酶的纯化、酶学性质及其底物降解模式进行了研究。经过硫酸铵盐析、CM_Sephadex及SephadexG_75层析分离纯化,获得一种纯化的WL_11木聚糖酶A ,其分子量为26.0kD ,pI值9.5 ,以燕麦木聚糖为底物时的表观Km 值为16.6mg mL ,Vmax值为12.63μmol (min·mg)。木聚糖酶A的pH稳定范围为6 0至10 4 ,最适作用pH范围则在7.2至8.0之间,是耐碱性木聚糖酶;最适作用温度为45℃～55℃,在37℃、45℃以下时该酶热稳定性均较好;50℃保温时,该酶活力的半衰期大约为2h ,在超过50℃的环境下,该酶的热稳定较差,55℃和60℃时的酶活半衰期分别为35min和15min。WL_11木聚糖酶A对来源于燕麦、桦木和榉木的可溶性木聚糖的酶解结果发现,木聚糖酶A对几种不同来源的木聚糖的降解过程并不一致。采用HPLC法分析上述底物的降解产物生成过程发现木聚糖酶A为内切型木聚糖酶,不同底物的降解产物中都无单糖的积累,且三糖的积累量都较高;与禾本科的燕麦木聚糖底物降解不同的是,木聚糖酶A对硬木木聚糖降解形成的五糖的继续降解能力较强。采用TLC法分析了WL-11粗木聚糖酶降解燕麦木聚糖的过程,结果表明燕麦木聚糖能够被WL-11粗木聚糖酶降解生成系列木寡糖,未检出木糖,这说明WL-11主要合成内切型木聚糖酶A,同时发酵液中不含木糖苷酶,适合用来酶法制备低聚木糖。     

来源于瘤胃厌氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶在毕赤酵母中的表达

厌氧真菌Neocallimastix frontalis是瘤胃中降解木聚糖和纤维素的主要微生物之一,其木聚糖酶具有潜在的应用价值。对来源于Neocallimastix frontalis木聚糖酶基因Xyn11B进行密码子优化;通过全基因合成优化后的木聚糖酶基因Xyn11Bm,构建该基因的酵母表达载体p PIC9K-Xyn11Bm,并在毕赤酵母GS115中诱导表达。摇瓶水平时,重组Xyn11Bm酶活性最高为4 874.8U/m L。在10 L发酵罐中诱导96 h后,重组Xyn11Bm的酶活性为5 139.7 U/m L,菌体湿重和干重达到216.7 g/L和117.3 g/L。酶学性质分析表明,重组Xyn11Bm的最适反应温度为50℃,最适反应p H为5.0。在p H5.0-8.0时该酶具有较好的稳定性,但温度稳定性较差。底物特异性分析表明,重组Xyn11Bm可水解燕麦木聚糖、桦木木聚糖和可溶性木聚糖4-O-Me-D-glucurono-D-xylan,但不降解地衣多糖和大麦β-葡聚糖。结果表明重组Xyn11Bm具有潜在的应用价值。     

Bacillus pumilus WL-11木聚糖酶A的纯化、鉴定及其底物降解方式

对一株BacilluspumilusWL_11木聚糖酶的纯化、酶学性质及其底物降解模式进行了研究。经过硫酸铵盐析、CM_Sephadex及SephadexG_75层析分离纯化,获得一种纯化的WL_11木聚糖酶A ,其分子量为2 6 0kD ,pI值9 5 ,以燕麦木聚糖为底物时的表观Km 值为16 6mg mL ,Vmax值为12 6 3μmol (min·mg)。木聚糖酶A的pH稳定范围为6 0至10 4 ,最适作用pH范围则在7 2至8 0之间,是耐碱性木聚糖酶;最适作用温度为4 5℃～5 5℃,在37℃、4 5℃以下时该酶热稳定性均较好;5 0℃保温时,该酶活力的半衰期大约为2h ,在超过5 0℃的环境下,该酶的热稳定较差,5 5℃和6 0℃时的酶活半衰期分别为35min和15min。WL_11木聚糖酶A对来源于燕麦、桦木和榉木的可溶性木聚糖的酶解结果发现,木聚糖酶A对几种不同来源的木聚糖的降解过程并不一致。采用HPLC法分析上述底物的降解产物生成过程发现木聚糖酶A为内切型木聚糖酶,不同底物的降解产物中都无单糖的积累,且三糖的积累量都较高;与禾本科的燕麦木聚糖底物降解不同的是,木聚糖酶A对硬木木聚糖降解形成的五糖的继续降解能力较强。采用TLC法分析了WL_11粗木聚糖酶降解燕麦木聚糖的过程,结果表明燕麦木聚糖能够被WL_11粗木聚糖酶降解生成系列木寡糖,未检出木糖,这说明WL_11主要合成内切型木聚     

灰色链霉菌中乙酰木聚糖酯酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

根据Gen Bank数据库中已报道的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)全基因组序列,分析得到假定的乙酰木聚糖酯酶基因序列并设计引物;利用分子克隆的方法得到该菌株基因组中乙酰木聚糖酯酶基因,并构建原核表达载体p ET28a-Sgraxe,经IPTG诱导表达重组Sgr Axe,Ni-NTA亲和层析法纯化该蛋白。结果显示,克隆得到乙酰木聚糖酯酶基因axe,其序列全长1 008 bp,编码336个氨基酸。SDS-PAGE检测带有p ET28a-Sgraxe转化菌株诱导表达产物相对分子量约为37 k D,与理论值相符。纯化的重组Sgr Axe酶学性质表明,该酶最适反应温度为50℃,最适p H8.0,热稳定性较强,p H作用范围广;金属离子对酶均表现为抑制作用,尤其是Zn2+严重抑制酶活力;重组酶特征的分析揭示了其在工业中潜在的应用价值。     

Alkalitalea saponilacus产木聚糖酶的碳源优化及酶学特性

【目的】确定厌氧盐碱细菌Alkalitalea saponilacus产木聚糖酶所需的碳源,优化木聚糖粗酶的提取条件并分析酶学性质。【方法】应用GC技术分析A.saponilacus发酵木聚糖的主要产物;利用二硝基水杨酸法(DNS)测定木聚糖酶活力以获得最优的碳源、提取粗酶的最佳条件及其酶学特性。【结果】A.saponilacus以不同来源木聚糖为底物时,发酵产生的主要产物丙酸含量都在80%以上。若以0.4%(W/V)蔗糖+0.1%(W/V)桦木木聚糖为复合碳源时,木聚糖酶活力是以桦木木聚糖或者蔗糖为单一碳源时的3.2倍。木聚糖酶的酶活力在盐度2%–6%、pH 7.0和55°C达到最佳且在该条件下的酶活力为590 IU/mg。此外,该酶活力在0.2%Tween 20存在时增加,而在5 mmol/L Mg~(2+)和0.2%Triton X-100存在时无显著影响,但在Cu~(2+)、Fe3+和Ni~(2+)等金属离子存在时则被显著抑制。【结论】A.saponilacus发酵主产物丙酸以及生物合成的木聚糖酶在工业生产中具有广泛的应用前景。     

Bacillus sublitis JH-1木聚糖酶的纯化及酶学性质

对枯草芽孢杆菌Bacillus sublitis JH-1胞外木聚糖酶的纯化及酶学性质进行了研究。通过(NH4)2SO4分级沉淀法、透析除盐、DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换层析等方法,从枯草芽孢杆菌Bacillus sublitis JH-1发酵液中分离纯化得到了电泳纯的木聚糖酶,其相对分子质量为3.45×104,比活力为75 899.68 U/mg。酶学性质研究结果表明:该酶的最适p H为6.0,在最适p H条件下保温2 h后仍能保持75%的活力,而p H越高,活力下降越快,表明为酸性木聚糖酶;最适温度为55℃,在50~60℃保温2 h后仍具有70%左右相对较高的活性,说明该酶具有较强的耐高温性;Fe2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ba2+和低浓度(5 mmol/L)的Fe3+对酶的活性有促进作用,而Mn2+和高浓度(10mmol/L)的Fe3+对酶的活性有抑制作用。     

里氏木霉GXC木聚糖酶的研究

研究了里氏木霉GXC产木聚糖酶的条件和酶学性质。结果表明,适宜产酶碳源为乳糖、甘露糖、棉子糖、木聚糖和麸皮,氮源为牛肉膏和酵母膏;产酶的最适初始pH为4.0,30℃培养60h。对以麸皮为碳源的培养液进行纯化的酶特性研究表明,木聚糖酶的最适反应温度为50℃,pH为5.5,该酶在pH5.0(7.0和40℃以下相对稳定。Fe3+和Mn2+对木聚糖酶有较大的促进作用,Cu～2+、Fe～2+和Ca～2+ 具有抑制作用。     

里氏木霉GXC木聚糖酶的研究*

研究了里氏木霉GXC产木聚糖酶的条件和酶学性质。结果表明,适宜产酶碳源为乳糖、甘露糖、棉子糖、木聚糖和麸皮,氮源为牛肉膏和酵母膏;产酶的最适初始pH为4.0,30℃培养60h。对以麸皮为碳源的培养液进行纯化的酶特性研究表明,木聚糖酶的最适反应温度为50℃,pH为5.5,该酶在pH5.0(7.0和40℃以下相对稳定。Fe3+和Mn2+对木聚糖酶有较大的促进作用,Cu～2+、Fe～2+和Ca～2+ 具有抑制作用。     

嗜碱细菌Cellulomonas bogoriensis 69B4T木聚糖酶的表达纯化及性质研究

【目的】对嗜碱细菌Cellulomonas bogoriensis 69B4~T产碱性木聚糖酶进行研究,克隆来源于该菌株的木聚糖酶基因,并对其进行异源表达、纯化及酶学性质的表征,为后续研究碱性木聚糖酶的耐碱机制及应用奠定基础。【方法】采用单因素分析法对菌株产碱性木聚糖酶情况进行研究;通过基因组分析,锚定5个内切木聚糖酶基因,利用同源扩增的方法进行克隆,并在大肠杆菌中重组表达,利用亲和层析对重组酶进行纯化,以木聚糖为底物表征木聚糖酶的酶学性质。【结果】来源于C. bogoriensis 69B4~T的5种木聚糖酶Xyn370、Xyn393、Xyn425、Xyn466和Xyn486均在大肠杆菌内实现了异源表达,并经亲和层析获得纯酶组分,其最适反应温度分别为60、50、40、40、60°C,在50°C范围内保温2h,残余酶活均在90%以上;最适反应p H分别为7.0、8.0、8.0、8.0、9.0,在p H5.0–9.0时具有较好的稳定性;5种重组木聚糖酶对部分金属离子和高浓度盐表现出较好的耐受性,对榉木木聚糖的酶活性最高,均为内切型木聚糖酶。【结论】本研究表达纯化的5种重组木聚糖酶具有耐盐碱的优良特性,且对温度、某些金属离子和化学试剂耐受,为研究木聚糖酶的耐碱机制及工业应用提供了酶源。     

C-端引入二硫键对黑曲霉木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响

同源比对黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xyn ZF-2氨基酸序列,模拟构建木聚糖酶三维结构,确定能够提高酶热稳定性的最佳突变位点。在C-端引入二硫键,突变xyn ZF-2 205位点的色氨酸和52位点的丙氨酸为半胱氨酸,获取突变基因T205C-A52C,表达于大肠杆菌BL21(DE3)。酶学性质比较发现,突变酶Xyn ZFT205C-A52C的最适温度为50℃,比原酶Xyn ZF-2提高了10℃;50℃保温5 min,突变酶相对酶活性为55.36%,原酶相对酶活性为32.62%;原酶与突变酶最适p H均为5.0,但相同p H下突变酶的相对酶活性较原酶高;突变酶的p H稳定区间由原酶的5.0~9.0扩大为3.0~9.0。因此,定点突变T205C和A52C在C-端引入二硫键能提高黑曲霉木聚糖酶Xyn ZF-2热稳定性及p H稳定性。     

β-甘露聚糖酶Man5A和木聚糖酶Tlxyn11B的融合表达

甘露聚糖酶和木聚糖酶是主要的半纤维素降解酶,在食品、饲料、纺织、造纸等工业应用广泛且通常搭配使用。文中将蓝状菌Talaromyces leycettanus JCM12802来源的性质优良的甘露聚糖酶编码基因man5A的CBM(Carbohydrate-bindingmodule)编码区去除,留下连接区和催化区,并将木聚糖酶基因Tlxyn11B成熟区编码序列与man5A的连接区进行融合,形成Tlxyn11B-linker-man5A融合基因,并在毕赤酵母中成功表达,获得了融合蛋白Tlxyn11B-Man5A。Tlxyn11B、不含CBM区的Man5A和Tlxyn11B-Man5A的理论分子量分别为21.6kDa、41.0 kDa、62.6 kDa。对纯化后的融合蛋白进行了性质分析,融合蛋白同时具有高的木聚糖酶和甘露聚糖酶活性。融合后的木聚糖酶的最适温度为70℃,较单独表达时提高了5℃。甘露聚糖酶的最适温度为90℃,与融合前一致。融合后的木聚糖酶热稳定性明显提高,60℃处理1 h剩余48%的酶活力,单独表达的木聚糖酶60℃处理20 min仅剩余20%的酶活力。融合后的木聚糖酶和甘露聚糖酶的最适pH分别为4.0和5.0,较单独表达时分别提高了0.5和1.0个单位,融合后酶的作用pH范围有所拓宽。融合前后的蛋白均具有较好的pH稳定性。融合后木聚糖酶和甘露聚糖酶的比活分别为1 784.3 U/mg和1 639.6 U/mg,较单独表达时比活(8 300 U/mg和1 979 U/mg)降低,与融合酶分子量增大相关。融合后的木聚糖酶和甘露聚糖酶的K_m值分别为1.2 mg/mL和1.7 mg/mL, V_(max)分别为2 000.0μmol/(min·mg)和2 831.6μmol/(min·mg)。综合其性质特点,融合木聚糖酶和甘露聚糖酶在饲料、食品等工业生产中有较大应用潜力,并为酶的性能改良提供了新的思路。     

链霉菌Strz-6木聚糖酶的纯化和固定化研究

链霉菌胞外木聚糖酶经过盐析、离子交换和分子筛层析纯化,粗酶液被纯化了32.5倍,比活力达498u/mg,活力回收46.6%。纯化后的酶固定在戊二醛交联的壳聚糖上,酶活回收率为42.8%。固定化酶的最适pH为6.0,最适温度为60℃,且固定化酶在65~75℃活力都较高。该酶的耐热性比较强,固定化酶热稳定性优于原酶;以木聚糖为底物,固定化酶的表观米氏常数为0.93×10-2g/L。     

焦曲霉产木聚糖酶的研究*

从1144株真菌中筛选到一株产木聚糖酶活力较高的焦曲霉(Aspergillus ustus)。该菌株适宜的产酶条件为在4%麸皮液中添加0.5%葡萄糖,0.4%硝酸钠及0.1%氯化钠,30℃振荡培养6d,木聚糖酶活力可达2176 u/mL。酶反应的最适温度为55℃,最适pH为5.5,在pH5～8酶活力稳定。45℃保温1h,酶活力剩余35%。酶水解桦木木聚糖的Km值为4.3×10^-3g/mL,V_max值为4.9mg/(mL·min)。酶解产物以木三糖和木四糖为主,表明该酶是一种典型的内切糖苷酶。     

嗜热子囊菌JCM12803来源的双功能木聚糖/纤维素酶

纤维素和木聚糖的充分利用对于生物燃料的生产是非常重要的。文中利用PCR的方法从嗜热子囊菌Thermoascus crustaceus JCM12803中克隆到一个新颖的双功能木聚糖/纤维素酶基因Tcxyn10a,并将其在毕赤酵母Pichia pastoris GS115中实现高效异源表达。经过蛋白纯化和酶学性质研究分析,TcXyn10A的最适pH值和最适温度分别为5.0和65-70℃,能够在酸性至碱性(pH 3.0-11.0)条件下和60℃下保持稳定;对榉木木聚糖、小麦阿拉伯木聚糖、羧甲基纤维素钠和地衣多糖均有降解活性,比活分别为(1 480±26)U/mg、(2 055±28)U/mg、(7.4±0.2)U/mg和(10.9±0.4)U/mg;同源建模结构以及分子对接试验表明,双功能酶TcXyn10A只含有单一催化结构域,且木聚糖底物与纤维素底物共用一条催化通道。文中为探索双功能酶结构与其功能的关系提供了很好的素材。     

绵毛嗜热丝孢菌木聚糖酶的纯化与性质

研究了绵毛嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus W205胞外木聚糖酶的纯化与性质。粗酶液经硫酸铵沉淀和Q-Sepharose FF离子交换层析即可得到电泳纯木聚糖酶,回收率为46.6%,比酶活为1396.9U/mg。该酶的最适pH和最适温度分别为pH7.0和75℃,pH稳定范围为5.5-10.8,70℃处理30min残存酶活在70%以上。薄层层析结果显示该酶水解桦木木聚糖的主要产物是木二糖和木三糖,并且能够通过转糖苷作用将木三糖转化为木二糖。该木聚糖酶易于纯化并且具有较宽的pH稳定性及良好的热稳定性,具有较大的潜在工业应用价值。     

牦牛源木聚糖酶产生菌的筛选和鉴定

目的以牦牛粪便为样本,筛选并鉴定产木聚糖酶菌株。方法利用碱提取法从玉米芯中提取木聚糖,以自制木聚糖为唯一碳源,从牦牛牛粪中筛选产木聚糖酶细菌,利用16S rDNA基因序列分析鉴定菌种,3,5-二硝基水杨酸法(DNS)测定其产酶能力并分析所产酶的酶学特性。结果筛选获得牦牛源产木聚糖酶类芽胞杆菌,所产木聚糖酶的最适反应条件为50℃、pH 8.0,在pH值为7.0或8.0以及温度50℃条件下,表现出较好的稳定性,Mn~(2+)对酶活力具有显著抑制作用,该菌最佳发酵时间为12 h,酶活最高达到1.2 U/mL。结论该菌所产木聚糖酶能够针对性地降解玉米芯木聚糖,在畜牧业和工业上有一定的应用价值。     

海枣曲霉地衣多糖酶和木聚糖酶的底物特异性

海枣曲霉木聚糖酶x—I、x—u和x一III作用于不同底物对,x_I对地衣多糖的水解活性最强,对麦麸半纤维素H和B也有一定的水解活性,因而该酶为具有木聚糖酶活性的地衣多糖酶(LichⅢe,l,3一l,4一卢一D—Glucan 4一glucnohydrolasc,Ec 3．2．1．73)。 X—II对燕麦木聚糖、麦麸半纤维素B和H均有很高的水解活性,对其他木聚糖及地衣多糖的水解活性也较高,因而为具有地衣多糖酶话性的木聚糖酶o x—Iil对落叶松木聚糖的水解活性最高,对其他木聚糖也有较高的水解话性,但不能水解地衣多糖等β一葡聚糖,故为一种专一的木聚糖酶。X一1水解麦麸半纤维素B、x一Ⅱ水解燕麦术聚糖及x—Iu承解落叶松木聚糖的Km值分别为9·9、2．1和1．8mg／ml。酶水解产物的纸层析分析结果表明,x—I水解不同木聚糖后的产物主要为分子量较大的寡聚木糖,未发现木二糖、木糖及阿拉伯糖。X_Il的水解产物主要为木二糖 及木二糖以上的寡糖,并有少量木糖和阿拉伯糖,且阿拉伯糖远多于木糖。X-III的水解产物中以木二糖为最多,也有较多的木二糖以上的寡聚木糖,木糖和阿拉伯糖的量较少,且阿拉伯糖远少于木糖。     

常压室温等离子体快速诱变绿色糖单孢菌筛选 木聚糖酶高产菌株及其酶学性质研究

[目的]利用常压室温等离子体快速诱变绿色糖单孢菌,筛选耐热耐碱木聚糖酶高产菌株,并对其进行酶学性质分析,确保其适用于生物制浆漂白工艺.[方法]采用刚果红平板水解圈法结合摇瓶发酵胞外酶测定法进行菌株筛选,并通过DNS木聚糖酶活性测定等方法对来源于不同突变株的木聚糖酶进行酶学性质分析对比.[结果]筛选出遗传稳定性良好的两株木聚糖酶高产菌株AT24和AT22-2,以麦草浆为诱导底物的粗酶液中,突变株AT24及AT22-2所产的木聚糖酶活性分别为512.74、552.70U/mL,分别为原始菌株S.v的16和17倍的.来源于突变株AT22-2的木聚糖酶的最适反应pH为9.5,最适反应温度为90℃,在50℃-90℃温度范围内具有良好的热稳定性,在100℃条件下处理30 min剩余酶活仍为68％;突变株AT24所产木聚糖酶的最适反应温度为60℃,最适pH为10.0,在60℃-80℃的高温环境下,突变株AT24所产的木聚糖酶具有良好的热稳定性.[结论]突变株AT22-2所产具有耐碱耐高温性质的木聚糖酶,在应用领域尤其在纸浆造纸行业具有较大的潜在应用价值.