PCSK9的靶向基因治疗

心血管疾病是全球非传染性疾病致死的主要原因。降低血液低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)是预防和治疗动脉粥样硬化引起的冠状动脉疾病的主要手段。人类遗传学研究发现携带PCSK9功能缺失突变的个体血液LDL-C含量显著降低,对心血管疾病有明显的保护作用。这使得PCSK9成为基因编辑治疗以降低血液胆固醇的理想靶点。当前的研究证明在小鼠和非人灵长类动物中靶向敲除肝脏PCSK9可显著降低血液低密度脂蛋白胆固醇,展现该基因治疗策略的发展前景。该文介绍了PCSK9基因与心血管疾病的关系,并综述了基因组编辑技术的发展及其体内靶向PCSK9基因以降低LDL-C的研究进展。     

扎伊尔型埃博拉重组糖蛋白GP-Fc基因疫苗构建及免疫原性研究

本实验将基于埃博拉病毒表面糖蛋白抗原GP基因序列,按照哺乳动物密码子使用频率优化,并与人IgG恒定区构建融合蛋白GP-Fc基因序列,重组蛋白序列插入基因疫苗载体pVR中,构建重组蛋白基因疫苗pVRmodGP-Fc。通过基因疫苗导入系统免疫小鼠,用间接ELISA和间接免疫荧光对抗体效价进行评估。实验结果显示,重组蛋白GP-Fc的基因疫苗可以很好的刺激小鼠产生特异性抗体,免疫周期结束后,小鼠血清中结合效价终点达到高剂量组1∶300 000及低剂量组1∶180 000,同时血清中的抗体可以很好地结合表达GP抗原的细胞表面,表现出很强的荧光信号。通过该研究我们验证重组蛋白基因疫苗pVR-modGP-Fc可以很好地诱导BALB/c小鼠产生较高滴度的抗原特异性IgG,具有较好的免疫原性。     

研究: PCSK9/LDLR通路介导姜黄素烟酸酯促进HepG2摄取脂质

为研究PCSK9/LDLR通路介导姜黄素烟酸酯(CurTn)降低血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),减少动脉内膜下脂质沉积的分子机制,用5、10、15 μmo/L姜黄素烟酸酯与25 mg/L LDL共孵育HepG2细胞24 h,分别采用油红O染色、胆固醇荧光定量试剂盒、DiI-LDL摄取检测细胞内胆固醇含量及LDL摄取情况,用逆转录定量聚合酶链反应(RT-Q-PCR)检测LDLR及SREBP2的mRNA表达,蛋白质印迹检测LDLR、SREBP2及PCSK9蛋白表达．随姜黄素烟酸酯作用浓度的增高细胞内脂滴显著增多,细胞内游离胆固醇(FC)、总胆固醇(TC)含量增高,细胞内胆固醇摄取增多;RT-Q-PCR和蛋白质印迹检测发现,与对照组(Control)比较,5、10、15 μmo/L 姜黄素烟酸酯处理组LDLR 蛋白表达增高,SREBP2 mRNA表达水平升高,PCSK9蛋白表达降低,但对LDLR mRNA及SREBP2 蛋白表达无影响．结果表明：姜黄素烟酸酯通过降低PCSK9、减少LDLR降解、升高LDLR蛋白表达,促进HepG2细胞胆摄取胆固醇．初步说明CurTn可能通过抑制PCSK9介导LDLR溶酶体降解,促进肝脏清除血浆LDL-C水平．     

PCSK9/LDLR通路介导姜黄素烟酸酯促进HepG2摄取脂质

为研究PCSK9/LDLR通路介导姜黄素烟酸酯(CurTn)降低血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),减少动脉内膜下脂质沉积的分子机制,用5、10、15μmo/L姜黄素烟酸酯与25 mg/L LDL共孵育Hep G2细胞24 h,分别采用油红O染色、胆固醇荧光定量试剂盒、Di I-LDL摄取检测细胞内胆固醇含量及LDL摄取情况,用逆转录定量聚合酶链反应(RT-Q-PCR)检测LDLR及SREBP2的m RNA表达,蛋白质印迹检测LDLR、SREBP2及PCSK9蛋白表达.随姜黄素烟酸酯作用浓度的增高细胞内脂滴显著增多,细胞内游离胆固醇(FC)、总胆固醇(TC)含量增高,细胞内胆固醇摄取增多;RT-Q-PCR和蛋白质印迹检测发现,与对照组(Control)比较,5、10、15μmo/L姜黄素烟酸酯处理组LDLR蛋白表达增高,SREBP2 mRNA表达水平升高,PCSK9蛋白表达降低,但对LDLR mRNA及SREBP2蛋白表达无影响.结果表明:姜黄素烟酸酯通过降低PCSK9、减少LDLR降解、升高LDLR蛋白表达,促进HepG2细胞胆摄取胆固醇.初步说明CurTn可能通过抑制PCSK9介导LDLR溶酶体降解,促进肝脏清除血浆LDL-C水平.     

PCSK9降解低密度脂蛋白受体分子机制研究进展

血清低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)水平的升高是导致心血管疾病发生的主要危险因素。低密度脂蛋白受体(LDL receptor, LDLR)介导的低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)清除是决定循环中LDL-C水平的主要因素。LDL与细胞表面的LDLR结合后通过经典的网格蛋白小窝(clathrin-coated vesicles)内化进入细胞。在酸性核内体中,LDLR与LDL解离并循环回到细胞表面,释放的LDL将被运送到溶酶体中降解。前蛋白转化酶枯草溶菌素9 (proprotein convertase subtilisin kexin type 9, PCSK9)编码一种肝脏分泌型蛋白,其突变与LDL-C水平密切相关。前期研究已经证明,PCSK9直接与细胞表面的LDLR相互作用,二者一起通过网格蛋白小窝内化进入细胞。然而,在酸性核内体中,PCSK9和LDLR形成紧密的复合物,并进入溶酶体中进行降解,从而减少肝细胞表面LDLR的水平,降低肝脏对LDL-C的清除,该过程对于维持血浆中LDL在相对恒定的水平具有重要作用。因此,阻断PCSK9功能已成为治疗高胆固醇血症的新策略。本文综述了PCSK9的功能和机制研究的最新进展,并着重介绍了PCSK9抑制剂的研究进展,旨在为PCSK9-LDLR通路的研究和胆固醇代谢的调控提供参考。     

在真核细胞表达制备重组人前蛋白转化酶枯草溶菌素9

分别优化、合成和构建了在毕赤酵母和哺乳动物细胞表达人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)的PCSK9-p PICZαA和PCSK9-pcDNA4.0重组质粒,将重组质粒转化至GS115细胞和转染至中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary,CHO)细胞,诱导细胞表达包含his标签的PCSK9重组蛋白。通过SDS-PAGE电泳和Western-blot分析两种系统表达重组蛋白的能力,发现GS115表达的重组蛋白相对分子质量大于人天然PCSK9蛋白且容易发生降解,而CHO细胞能够高表达与人天然PCSK9蛋白相对分子质量相同的、稳定的、易于纯化的特异重组蛋白。采用His/Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,获得纯度达90%以上的PCSK9重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备了高效价特异性PCSK9多克隆抗体。所建立的CHO细胞表达体系PCSK9的平均表达量为5.6 mg/L,为开发PCSK9抑制剂和深入研究PCSK9分子结构和功能奠定了基础。     

埃博拉病毒重组膜蛋白Gp-Fc表达及免疫原性研究

本研究利用HEK293F细胞表达了埃博拉病毒重组膜蛋白,并通过免疫小鼠初步研究了其免疫原性。按照人密码子使用频度优化编码埃博拉病毒膜蛋白胞外区基因,合成后将其插入到真核表达载体pXG-Fc中,构建埃博拉病毒糖蛋白和人IgG Fc片段融合蛋白表达质粒pXG-modGP-Fc。利用瞬时转染技术,将融合蛋白表达质粒转染到高密度培养的悬浮HEK293F细胞中,实现了分泌表达。通过Protein A亲和层析,得到了纯化的重组蛋白。将纯化的融合蛋白免疫小鼠,并通过间接ELISA对小鼠抗体效价进行评价。蛋白纯化及分析结果表明,本研究构建的真核表达系统能够有效表达埃博拉重组蛋白GP-Fc,细胞培养上清中重组蛋白以二聚体形式存在。通过间接ELISA分析,纯化的重组蛋白免疫实验动物后,可以在血清中检出高滴度的抗原特异性IgG,显示该重组蛋白具有良好的免疫原性。通过该研究,我们得到了具有良好免疫原性的重组蛋白,同时,该工作为研制基于重组蛋白的埃博拉疫苗以及筛选单克隆抗体打下基础。     

PCSK9结构与功能

前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）基因属于前蛋白转化酶（PC）家族,由信号肽、前结构域、催化结构域和羧基末端结构域组成.大量研究发现,PCSK9能介导低密度脂蛋白受体（LDLR）降解,调节血浆LDL胆固醇（LDL-C）水平;而PCSK9的两类主要突变,功能获得型、功能缺失型可分别导致高胆固醇血症和低胆固醇血症. 因而研究PCSK9对相关心血管疾病的防治有重要意义. PCSK9结构特性与其生化功能密切相关,突变致使其调节胆固醇代谢的机制更为复杂.本文旨在总结PCSK9结构与功能的分子生物学特性,并指出目前研究中存在的问题,以利对PCSK9的进一步探索.     

融合Th细胞表位序列Myostatin重组基因疫苗的构建及其对免疫动物肌肉力量的影响

目的:本实验利用基因重组技术,构建融合Th细胞TT830-844表位序列的人重组Myostatin基因疫苗真核表达载体pVAC-TT-Ms,检测该基因疫苗对免疫小鼠前肢抓力的影响,为后续以Myostatin作为靶分子来改善废用性肌肉萎缩等病症的研究提供实验基础。方法:化学耦联方法合成Myostatin C-末端成熟肽(330 bp)基因序列及其N-端融合TT表位序列的DNA片段,重组质粒pVAC-TT-Ms的构建、纯化及瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)按该类研究中的常规实验操作,并检测重组基因疫苗pVAC-TT-Ms免疫小鼠骨骼肌前肢抓力的变化。结果:酶切和测序结果表明,重组Myostatin基因疫苗表达载体pVAC-TT-Ms构建成功。重组质粒pVAC-TT-Ms OD260/280比值和电泳结果显示,该质粒作为基因疫苗符合免疫动物的质量要求。细胞荧光免疫检测结果表明,瞬时转染的CHO细胞中目的蛋白明显表达。动物免疫实验初步证明,重组Myostatin基因疫苗可显著提高免疫小鼠的前肢抓力,与正常对照组比较,免疫小鼠前肢抓力平均增加了29.88%。结论:本实验成功构建了在真核细胞中能有效表达融合TT表位序列人重组Myostatin基因疫苗表达载体,初步证明了重组Myostatin基因疫苗可显著增加免疫小鼠前肢抓力。     

O2血清型肺炎克雷伯氏菌多糖结合疫苗的生物合成

本研究旨在利用微生物体内合成肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae,Kp) 多糖结合疫苗并研究其保护效果。通过敲除Kp O抗原连接酶基因waaL阻断其LPS合成,再向缺失株中导入糖基工程载体,使细菌能够在体内合成糖蛋白,并将该糖蛋白免疫小鼠后评价其保护效果。结果表明,在构建的 Kp waaL缺失株中导入糖基工程载体后,底物蛋白重组霍乱毒素B亚单位rCTB (Recombinant cholera toxin B subunit) 能够被O糖化,从而得到糖蛋白;动物实验结果显示该疫苗能刺激小鼠产生较高的抗体效价,试验组小鼠攻毒后一周存活率可达75%。这种生物合成方法制备的多糖结合疫苗有望成为针对肺炎克雷伯氏菌的新型候选疫苗。     

重组人乳头瘤病毒核酸疫苗诱导特异性淋巴细胞增殖

采用分子克隆技术 ,将人乳头瘤病毒 16型E7(HPV 16E7)基因重组于真核表达载体上 ,构建了HPV 16E7核酸疫苗。将该疫苗通过皮内注射方式免疫Balb/c纯系小鼠。基因免疫后制备小鼠脾淋巴细胞悬液 ,经体外E7蛋白再次刺激后用MTT比色法检测出了特异性淋巴细胞增殖反应。由于特异性淋巴细胞增殖是反映细胞免疫功能的简便有效方法 ,所以本实验表明HPV 16E7核酸疫苗构建正确 ,并能够诱导机体产生特异性细胞免疫应答     

PCSK9的药理学筛选靶点

前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）基因编码神经凋亡调节转化酶即NARC1,通过影响肝LDLR水平,在胆固醇代谢中发挥了重要的作用.其功能获得型突变使血浆胆固醇水平增高,而功能缺失型突变降低胆固醇水平.流行病学调查显示,高胆固醇血症是动脉粥样硬化和心脏病的主要危险因素.一些患者运用当前的降胆固醇药物治疗仍不能达到推荐的目标LDL水平,PCSK9作为新的降脂靶点引起了广泛的关注.本文将对PCSK9的结构、功能和药理学靶点进行综述.     

重组人乳头瘤病毒核酸疫苗诱导特异性淋巴细胞增殖

采用分子克隆技术,将人乳头瘤病毒16型E7(HPV 16 E7)基因重组于真核表达载体上,构建了HPV 16 E7核酸疫苗.将该疫苗通过皮内注射方式免疫Balb/c纯系小鼠.基因免疫后制备小鼠脾淋巴细胞悬液,经体外E7蛋白再次刺激后用MTT比色法检测出了特异性淋巴细胞增殖反应.由于特异性淋巴细胞增殖是反映细胞免疫功能的简便有效方法,所以本实验表明HPV 16 E7核酸疫苗构建正确,并能够诱导机体产生特异性细胞免疫应答.     

表达中东呼吸综合征冠状病毒S蛋白的重组痘苗病毒的构建及免疫效果初步评价

目的:以痘苗病毒天坛株为载体,构建表达中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V)S蛋白的重组病毒疫苗,并进行免疫效果评价。方法:通过PCR扩增获得去除跨膜区的S蛋白基因片段SQ,并构建重组痘苗病毒载体质粒p JSC11Lac Z7.5SQ,将重组质粒与痘苗病毒同源重组并单斑纯化获得重组病毒毒株RVVMERS-SQ,重组病毒免疫小鼠后用酶联免疫吸附实验(ELISA)和假病毒微量中和实验检测其诱发的S蛋白体液免疫反应水平。结果:构建了表达MERS-Co V去跨膜区S蛋白的重组病毒RVVMERS-SQ,其免疫小鼠后诱发了强的S蛋白体液免疫反应,血清Ig G抗体滴度为1∶3200,中和抗体滴度达到1∶1000。结论:重组痘苗病毒RVVMERS-SQ可在BALB/c小鼠体内诱发强的免疫反应,为MERS-Co V疫苗的研发提供了实验基础。     

HIV-1 B亚型gag基因密码子优化及其免疫原性的研究

从河南HIV-1流行区感染者中克隆HIV-1 B亚型gag基因,通过序列比对获得其一致性共有序列,对该共有序列按照哺乳动物优势密码子的使用原则进行优化,以Western blot方法比较优化前后gag基因体外表达量.发现对gag基因进行密码子优化可显著提高其表达水平.将优化后的mod.gag基因插入重组腺病毒载体,构建了重组病毒rAdV-mod.gag.在BALB/c小鼠体内分别以108PFIJ及108PFU rAdV-mod.gag疫苗单独免疫两次均可产生较高水平的gag特异性细胞免疫反应.由此得出结论,对gag基因的密码子优化是成功的;表达优化后gag基因的重组腺病毒疫苗,可以在小鼠体内诱导较强的gag基因特异性CTL应答.     

减毒李斯特菌载体运送HPV16 E7基因重组疫苗的构建及其生物学特性

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种理想的肿瘤疫苗载体,本文旨在构建表达人乳头瘤状病毒(HPV)16型E7蛋白的减毒重组李斯特菌疫苗候选株并分析其生物学特性。利用同源重组技术将HPV16 E7基因定点整合至LMhly基因信号肽序列下游,获得减毒重组李斯特菌LM4△hly::E7,并对该重组菌进行生物学特性研究。实验结果表明,重组菌能够分泌表达具有免疫学活性的E7-LLO融合蛋白,大小约66 k Da;通过激光共聚焦扫描显微镜观察到重组菌能够在RAW264.7细胞胞内增殖。ELISA测定结果显示减毒重组菌能够诱导小鼠产生E7特异性抗体。重组菌在C57BL/6小鼠中LD50为3.863×10~9 CFU,低于亲本株4个数量级,通过组织切片观察到重组菌对小鼠肝脏及脾脏无明显病理变化。以上表明,本研究构建的分泌表达E7-LLO融合蛋白的减毒重组李斯特菌具有较好的安全性,为下一步研究其抗肿瘤作用提供了材料,并为研发宫颈癌的免疫治疗型候选疫苗奠定重要基础。     

马链球菌马亚种IgG结合蛋白的原核表达和免疫原性

为研究马链球菌马亚种IgG结合蛋白(EAG)免疫原性和保护力,评价其作为马链球菌疫苗抗原的价值。采用PCR法扩增马链球菌马亚种EAG基因,将测序正确的EAG扩增产物与原核表达载体pET-28a(+)连接构建重组质粒,对转化后的大肠杆菌进行诱导表达,用诱导纯化后的重组蛋白作免疫原免疫小鼠,分析重组蛋白免疫小鼠后的抗体水平及对小鼠的免疫保护力。结果表明,诱导后可得到26 kDa的EAG重组蛋白,且该蛋白可与该菌阳性血清发生特异性反应。间接ELISA检测免疫小鼠的抗体效价可达1∶8 100,重组蛋白免疫后对小鼠保护力可达90%。该结果表明,表达的EAG蛋白具有良好的抗原性,可有效提高小鼠的体液免疫水平及免疫保护力。     

小鼠可溶性PD-1蛋白疫苗的设计及不同免疫方式的效果研究

PD-1是参与免疫抑制调节、肿瘤免疫逃逸的重要因子之一。通过抑制PD-1,可以提高T细胞的活性、细胞因子的分泌水平,从而提高抗肿瘤效果。本研究通过基因重组,构建了小鼠PD-1胞外结构域蛋白m PD-1和m PD-1与喉毒素跨膜结构域(DTT)融合的DTT-m PD-1蛋白。蛋白经大肠杆菌表达后,由镍柱亲和纯化。用蛋白疫苗免疫Balb/c小鼠后发现,DTT-m PD-1蛋白没有在小鼠体内产生抗PD-1的免疫反应。但是,先用DTT免疫三次(隔两周免疫一次),再用m PD-1免疫小鼠,反而引起了抗PD-1的免疫反应,血清效价高达7×104。这一发现,为肿瘤免疫治疗提供了一种全新的方式。     

吸烟对小鼠血清介导巨噬细胞胆固醇流出的影响及其机制

目的:探讨吸烟对小鼠血清介导巨噬细胞胆固醇流出的影响及其机制.方法:14只C57BL/6小鼠随机分为对照组和吸烟组.吸烟组小鼠被动吸烟8周后,检测血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)和丙二醛(MDA)浓度.采用液体闪烁计数法分别检测对照组小鼠血清、吸烟组小鼠血清、吸烟组小鼠血清+N-乙酰半胱氨酸(NAC,2mM)介导的细胞胆固醇流出效率.结果:与对照组相比,吸烟组小鼠血清中HDL-C显著降低,TG显著升高,TC和LDL-C无显著差别,并且吸烟组小鼠血清中MDA水平也显著升高.吸烟组小鼠血清介导巨噬细胞胆固醇流出效率明显降低,给予抗氧化剂NAC共同孵育可以显著增加吸烟组小鼠血清胆固醇流出效率.结论:吸烟显著降低小鼠血清介导的巨噬细胞胆固醇流出效率,其机制可能与吸烟降低HDL-C水平以及促进HDL脂质过氧化有关.     

汉坦病毒核酸疫苗在小鼠体内表达分布的初步研究

运用生物荧光技术,肌肉免疫接种小鼠含汉坦病毒S抗原基因片段的核酸疫苗,观察重组核酸疫苗在其体内的表达分布。进一步探讨汉坦病毒核酸疫苗的应用前景。扩增纯化已构建好的含有汉坦病毒S抗原基因片段和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组质粒pEGFP/S;免疫接种小鼠胫前肌,观察pEGFP/S在小鼠体内的表达分布。免疫接种3 d后在实验组小鼠肝、肾、脾、肌肉各组织均检测到较强的绿色荧光。重组质粒pEGFP/S能在小鼠的多个组织器官表达,为深入研究汉坦病毒核蛋白和有效的核酸疫苗奠定了基础。