矮牵牛编码 F3'5'H的蓝色基因表达载体构建及转化

类黄酮3',5'羟基化酶(Flavonoid-3',5'hydroxylase,F3'5'H)是花色苷代谢途径中的一个关键酶,能使花色素合成趋向于形成蓝色的飞燕草色素,从而使花色向蓝紫色偏移.本研究从蓝紫色矮牵牛(Petunia hybrida)花瓣中克隆了编码F3'5,H的蓝色基因Hf1,并通过PCR技术获得百合花特异表达启动子(PchsA),将百合PchsA与Hf1基因融合,构建了百合花特异表达启动子调控的Hf1基因植物表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化粉红色矮牵牛.抗性筛选和PCR检测鉴定转基因植株,结果表明,成功地获得了转基因阳性植株.     

芜菁的类黄酮3'羟化酶基因克隆和UV-A诱导表达特性

用UV-A处理'津田'芜菁和'赤丸'芜菁块根24 h后提取总RNA,以RT-PCR方法分别克隆到BrF3'H1和BrF3'H2基因.BrF3'HI和BrF3'H2的开放读码框为1 536 bp,均编码511个氨基酸.氨基酸序列分析显示,BrF3'Hl和BrF3H2与甘蓝型油菜F3tH的同源性达99%.在第45～476的肽段含有细胞色素P450家族基因的结构域.BrF3HI和BrF3'H2基因有高度同源性,核苷酸序列的17个位点处有差异,推导的氨基酸序列在5个位点处有差异.Northern杂交结果显示,UV-A可以诱导BrF3HI表达,基因的表达量与UV-A处理时间呈相关,UV-A不能诱导BrF3'H2基因表达.     

矮牵牛编码F3′5′H的蓝色基因表达载体构建及转化

类黄酮3',5'羟基化酶(Flavonoid-3',5'hydroxylase,F3'5'H)是花色苷代谢途径中的一个关键酶,能使花色素合成趋向于形成蓝色的飞燕草色素,从而使花色向蓝紫色偏移.本研究从蓝紫色矮牵牛(Petunia hybrida)花瓣中克隆了编码F3'5,H的蓝色基因Hf1,并通过PCR技术获得百合花特异表达启动子(PchsA),将百合PchsA与Hf1基因融合,构建了百合花特异表达启动子调控的Hf1基因植物表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化粉红色矮牵牛.抗性筛选和PCR检测鉴定转基因植株,结果表明,成功地获得了转基因阳性植株.     

喜盐鸢尾花色形成关键基因的克隆及表达分析

喜盐鸢尾(Iris halophila Pall.)及其变种蓝花喜盐鸢尾(I.halophila Pall.var.sogdiana(Bung)Grubov)因耐盐碱及其多种花色而具有盐碱地园艺开发价值。本文根据喜盐鸢尾内轮花被转录组测序结果,利用基因特异性引物从这2种植物中分别克隆了编码查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、类黄酮-3',5'-羟基化酶类(F3'5'H-like)等基因的部分片段,并对它们在内轮花被中的表达水平进行实时定量PCR分析。序列分析结果确认在喜盐鸢尾中所克隆的CHS(311 bp)、CHI(457 bp)、F3'5'H-like(496 bp)3个基因(部分)未见文献报道与NCBI等数据库记录。其中F3'5'H-like基因与经典的属于细胞色素P450CYP75A亚家族的F3'5'H不同,而与万带兰的F3'5'H-like同属于CYP76AB亚家族,为一类新的蓝花相关基因。实时定量PCR表达分析结果表明,与黄花的喜盐鸢尾相比,蓝花喜盐鸢尾中CHS与F3'5'H-like显著上调表达,可能是其花色不同于喜盐鸢尾的主要原因。     

水芹类黄酮3'-羟化酶基因的克隆与表达特性分析

类黄酮3'-羟化酶(flavonoid 3′-hydroxylase,F3'H)属于细胞色素P450家族(cytochromeP450,CYP450),在植物主要成色物质花青素的合成中发挥重要作用。本实验以‘八卦洲水芹’以及紫色叶柄突变型水芹为实验材料,利用RT-PCR方法,从紫色叶柄突变型水芹的cDNA中克隆得到编码类黄酮3'-羟化酶的基因,命名为OjF3'H1。序列分析显示,OjF3'H1基因全长1575bp,共编码524个氨基酸。OjF3'H1蛋白相对分子质量为58292.59,理论等电点为6.77。系统进化分析显示,OjF3'H1蛋白具有高度保守性,与同属伞形科的胡萝卜F3'H1进化关系最近。OjF3'H1编码的蛋白属于疏水蛋白,无序化比例为5.53%,空间结构主要由α-螺旋和β-折叠组成。实时定量PCR分析显示,OjF3'H1在不同品种水芹茎中相对表达量有明显差异,紫色叶柄突变型水芹中OjF3'H1的表达量明显比‘八卦洲水芹’中高。     

棕色棉F3'H-羟化酶基因的克隆与生物信息学分析

根据葡萄的类黄酮3′-羟化酶(F3'H)基因全长cDNA序列Blast所得棉花的EST序列设计引物,以开花后16 d(DPA16)的新彩棉5号(xC-5)纤维为材料,利用RACE和RT-PCR技术分离得到了2个类黄酮3′-羟化酶基因cDNA序列,此2个序列编码区完全相同,仅在3'UTR区存在片段长短的差异,推测可能是基因转录后加工方式不同所造成.克隆所获得的棉花F3'H基因编码区全长1 533 bp,编码510个氨基酸,氨基酸序列分析预测表明,该基因所编码蛋白含有一个跨膜结构域,是一种分泌蛋白,定位于内质网上,并含有一段与细胞色素P450功能区相匹配的保守功能域;序列比对结果表明,棉花F3'H基因与其他多个物种的F3'H基因在氨基酸序列上有较高的同源性;聚类分析结果表明,棉花F3'H蛋白与双子叶植物大豆的F3'H亲缘关系较为接近,而与单子叶植物高梁等作物则较远.     

彩色马铃薯色素相关基因座的种类、功能与染色体定位(英文)

综述了与彩色马铃薯色素产生与分布相关基因座的观念起源、种类、功能和染色体定位。与彩色马铃薯色素相关基因座的观念起源于试图解释四倍体和二倍体马铃薯块茎和其他部位颜色呈现遗传行为的两个遗传模式。与彩色马铃薯色素相关的13个基因座可划分为4类,第1、第2和第3类分别与马铃薯花色苷的合成、酰化和分布有关,第4类与马铃薯类胡萝卜素的产生相关。基因座I,P,R和Y分别编码一个MYB结构域转录因子、类黄酮3′,5′-羟化酶、二氢黄酮醇4-还原酶和β-胡萝卜素羟化酶。基因座之间复杂多样的互作综合决定了彩色马铃薯色素特别是花色苷的产生与分布。基因座D和R定位在马铃薯的2号染色体上,E,F,I和PSC在10号染色体上,P在11号染色体上,Y在3号染色体上。可为彩色马铃薯颜色呈现的遗传机理探索提供参考。     

孟氏隐唇瓢虫细胞色素P450基因的克隆与序列分析

采用同源克隆和RACE技术,从孟氏隐唇瓢虫Cryptolaemus montrouzieri Mulsant中克隆到细胞色素P450CYP9Z401基因的c DNA全序列(Gen Bank number:KP164813)。c DNA全长1722 bp,包含3'非编码区域(UTR)为86 bp和5'UTR为49 bp,开放阅读框(ORF)长1587 bp,编码528个氨基酸。预测的分子量为61.27 k D,理论等电点为6.58,无信号肽结构,在2-20氨基酸处存在跨膜螺旋。该基因拥有细胞色素P450特征序列螺旋C、螺旋K和Meander区域,另外还有血红素结合区(1个氨基酸差异)和螺旋I区(2个氨基酸差异)。与其他昆虫的CYP9家族基因比较,与赤拟谷盗Tribolium castaneum同源性最高,为47%,系统发育分析也表明两者的亲缘关系最近。CYP9Z401基因的克隆和比较分析为进一步深入研究孟氏隐唇瓢虫的细胞色素P450基因功能及其进化具有重要意义。     

矮牵牛花色基因工程研究进展

矮牵牛花色素苷生物合成过程中至少有12种酶参与,除了AAT、AMT之外的大多数相关合成酶结构基因已经被克隆,调节基因An2、An4及酶活性调节基因difF也先后从矮牵牛中分离出来.多种花色基因如DFR、F3'5'H、CHS、CHI、CHR、Lc等转化矮牵牛都能影响花色,外源CHS导入还会引起雄性不育.该文主要对近年来国内外有关矮牵牛花色相关基因的分离、应用及外源基因转入三方面的研究进展进行综述,并对矮牵牛花色基因工程研究的应用前景进行了讨论.     

奶山羊β-乳球蛋白基因5'、3'调控区的克隆和序列分析

目的:克隆奶山羊β-乳球蛋白(BLG)基因5'、3'调控区,并对其进行序列分析.方法:从徐淮奶山羊组织中提取基因组DNA,采用高保真长模板PCR法克隆得到奶山羊BLG基因4.2 kb的5'调控区和1.8 kb的3'调控区;将纯化后的PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体中,经酶切鉴定和序列测定验证克隆的正确性.结果:部分序列分析表明,奶山羊BLG基因5'区与GenBank中登录的山羊和绵羊BLG基因5'区的同源性分别为100%和95%,3'区的同源性分别为99%和93%;克隆得到的奶山羊BLG基因调控区与山羊BLG伪基因显著不同,二者5'区和3'区的同源性分别为83%和88%.结论:克隆得到的奶山羊BLG基因调控区可用于构建乳腺特异性表达载体,用于外源基因在转基因动物乳腺中的高效表达.     

西花蓟马细胞色素P450基因cDNA片段克隆与mRNA表达分析

细胞色素P450介导的解毒作用增强是昆虫对杀虫剂产生抗性的重要机制。本文通过RT-PCR克隆了西花蓟马CYP4家族5个细胞色素P450基因c DNA片段。多重序列比对发现,这5个基因在氨基酸水平的一致性在40%-76%之间。采用实时荧光定量PCR对5个CYP4基因的mRNA表达水平的分析发现,阿维菌素抗性品系CYP4-1、CYP4-2和CYP4-5的表达水平分别是敏感品系的3.50、4.00和2.48倍,表明西花蓟马对阿维菌素的抗性可能与这3个CYP4基因的过量表达相关。     

黄鳝(Monopterus albus)P450(11β)基因cDNA的克隆和表达分析

11β-羟化酶(11β-hydroxylase)由P450(11β)(Cytochrome P450 11β-hydroxylase)基因编码,是一种重要的线粒体酶,指导合成11-羟睾酮,11-羟睾酮是合成硬骨鱼中最重要的雄性激素11-KT的前体物质,参与精子发生过程。本研究首先利用RT-PCR和RACE技术克隆了黄鳝(Monopterus albus)P450(11β)基因c DNA全长序列,然后利用生物信息学进行了分析,最后利用RT-PCR和荧光定量PCR方法对不同组织的表达情况进行了研究。结果显示:黄鳝P450(11β)基因c DNA全长为1 812 bp,开放阅读框1 632 bp共编码544个氨基酸氨基酸,5'非编码区(5'UTR)9个碱基,3'非编码区(3'UTR)168个碱基。黄鳝P450(11β)基因结构的保守性较高,具有细胞色素P450超家族基因的5个特征区域。氨基酸序列同源性分析表明黄鳝与其他鱼类的同源性在64%~76%之间,与舌齿鲈同源性最高为77%,但与人和老鼠的相似度仅为41.9%和37.7%。系统进化树分析以哺乳类为外群,黄鳝与点带石斑鱼、罗非鱼、舌齿鲈等聚为一大支。基因表达显示黄鳝P450(11β)基因在性腺和脑组织中表达,尤其在精巢中高表达,在卵巢中几乎检测不到。表明该基因对精子发生和精巢发育过程起着一定的作用。     

北柴胡细胞色素P450酶基因的克隆及其植物过量表达载体的构建

目的:克隆北柴胡中可能参与柴胡皂苷生物合成的细胞色素P450酶基因,构建其过量表达载体,为通过转基因验证其功能奠定基础。方法:在454高通量测序获得5'和3'端部分cDNA序列的基础上,利用LD-PCR方法获得全长cDNA,根据全长cDNA序列设计含有酶切位点的PCR引物,利用高保真酶,以RNA反转录产物为模板PCR扩增细胞色素P450酶基因的开放读框,扩增产物与pEASY-T1 Simple载体连接,转化大肠杆菌DH5α;重组质粒pT1-P450经菌液PCR和酶切方法验证后测序,采用NCBI在线Blastx、DNAman和MEGA4软件对序列进行生物信息学分析,随后将pT1-P450的酶切产物插入双元载体pCAMBIA-SUPER 1300,菌液PCR和酶切验证重组质粒p1300-P450。结果:扩增到了北柴胡细胞色素P450酶基因BcCYP87E,构建了这一基因的过量表达载体。结论:细胞色素P450酶基因的克隆和转基因载体的构建,为后续开展转基因研究,验证其生物功能奠定了基础。     

植物阿魏酸-5-羟化酶生物信息学分析

阿魏酸-5-羟化酶(F5H)是木质素生物合成的关键酶之一,它依赖于细胞色素P450催化阿魏酸在5位上发生羟基化反应。采用生物信息学的方法和工具对在GenBank上注册的拟南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica napus)、杨树(Populus trichocarpa)、番茄(Lycopersicon esculentum)、紫苜蓿(Medicago sativa)、喜树(Camptotheca acuminate)等植物的阿魏酸-5-羟化酶基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,包括组成成分、氨基酸翻译后修饰、跨膜拓扑结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级功能结构域等进行分析预测和推断。结果表明,植物F5H是一个具有跨膜结构域的亲水性蛋白,存在于内质网等分泌途径中,α-螺旋和不规则卷曲是其二级结构的主要结构元件,具有细胞色素P450家族特征性结构域及保守功能域。     

紫茎泽兰类黄酮3'-羟化酶基因的克隆、序列分析和原核表达

用基因特异引物对紫茎泽兰F3'H基因进行PCR扩增、T-A克隆及测序,采用DNAMAN 5.0和MEGA 3.0等生物信息学软件进行序列分析,并对F3'H基因的组织表达特性及原核表达产物进行了分析。结果表明紫茎泽兰F3'H基因cDNA全长为1722 bp(GeneBank登录号EF137714),编码570个氨基酸,与翠菊、大豆和非洲菊F3'H基因的氨基酸序列同源性分别为64.4%,57.3%和54.5%。Southe(?)杂交表明该基因为单拷贝。Northe(?)杂交表明F3'H基因在紫茎泽兰叶中表达量最高,且其表达受泽兰酮诱导。SDS-PAGE电泳表明F3'H基因经IPTG诱导后在大肠杆菌中能表达56.8 kDa的目的蛋白。     

蓝亚麻花瓣中类黄酮化合物及代谢途径分析

花色是观赏植物重要的观赏性状之一,而类黄酮是其主要的呈色物质。该研究以蓝亚麻花瓣为研究对象,将蓝亚麻开花过程分为5个阶段,并用高效液相色谱—光电二极管阵列检测技术(HPLC-PAD)和高效液相色谱—电喷雾离子化—质谱连用技术(HPLC-ESI-MS)分析不同开花阶段花瓣中类黄酮化合物的成分和含量。结果表明:蓝亚麻花瓣中积累飞燕草素苷、矢车菊素苷和锦葵素苷,未检测到天竺葵素苷,其中以酰基化的飞燕草素苷为主要呈色物质;而总花青素苷含量在第2阶段达到最高。根据花青素苷终产物和类黄酮中间代谢产物推定了蓝亚麻花瓣中类黄酮代谢途径,其中以F3'5'H所引导的分支途径占优势,其主要原因可能是F3'5'H酶活高于F3'H。     

牙鲆碱性磷酸酶基因5'调控区的克隆及其功能检测

通过基因组步移的方法扩增出一段924bp的牙鲆碱性磷酸酶基因5'调控区序列,在线软件分析表明5'调控区内可能含有GKLF、Oct、CREB、E2F、CEBP、GATA-1、Pitx-1、Pit-、RARE/TRE、AP4等转录因子结合位点.采用DNA重组的方法,将克隆得到的5'调控区片段插入启动子缺失的增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-1中,构建重组表达载体pEGFP-JFALP.重组载体瞬时转染COS-7细胞,在倒置荧光显微镜下可以检测到绿色荧光信号,且荧光信号随着时间的延长而增强.结果 表明本实验克隆的牙鲆碱性磷酸酶基因5'调控区具有一定的启动子活性,为今后进一步研究碱性磷酸酶基因表达调控的分子机制奠定基础.     

花青素生物合成关键酶的研究进展

花青素是植物花呈现不同色彩的物质基础,其生物合成途径主要受到查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮3-羟化酶(F3H)、类黄酮3'-羟化酶(F3'H)、类黄酮3’,5’-羟化酶(F3'5'H)、二羟基黄酮醇还原酶(DFR)、花色素苷合成酶(ANS)以及类黄酮3-O-糖基转移酶(UFGT)等关键酶的控制.主要介绍花青苷生物合成途径、关键酶晶体结构及利用基因工程改造花色的研究进展,讨论目前花色改造存在的问题,并对今后的研究前景进行展望.     

丹参香豆酸-3-羟化酶基因(SmC3H)的生物信息学及其组织表达模式分析

通过分析丹参转录组数据库(SRX021907)得到一条香豆酸-3-羟化酶(C3H)基因,blast比对发现该基因为丹参C3H(EU358957.1),该基因c DNA全长1 704 bp,包括1个1 503 bp的开放阅读框,编码508个氨基酸。生物信息学分析表明,其编码蛋白的分子量为57.21 k D,等电点为8.53,含琢-螺旋,延伸链和无规则卷曲,具有1个细胞色素P450蛋白(CYP450)特异的保守结构域。聚类分析表明其与芝麻的亲缘关系最近。组织特异性表达分析结果表明,该基因在茎中的表达量最丰富,其次是叶和花,根中最低。