猪克隆胚胎激活方法优化与转人溶菌酶基因克隆猪的生产

为了提高转基因克隆效率和获得转人溶菌酶基因克隆猪,研究了不同电激活参数和化学辅助激活方法对猪克隆胚胎和孤雌胚胎体外发育的影响.结果发现:电场强度会显著影响克隆胚胎的融合率和体外发育能力(P<0.05),电脉冲次数对克隆胚胎体外发育促进作用不显著(P>0.05),而相同电激活条件下克隆胚胎和孤雌胚胎的体外发育能力变化趋势不同;电激活后再利用放线菌酮+细胞松弛素B(CHX+CB)处理4 h能显著提高克隆胚胎的囊胚率(P<0.05),而用二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)处理没有提高克隆胚胎囊胚率(P>0.05),但6-DMAP或CHX+CB处理均可显著提高孤雌胚胎的囊胚率(P<0.05).上述结果表明,最佳的孤雌激活条件并不一定是克隆胚胎的最佳激活条件.本研究中猪克隆胚胎的最佳激活方法为1.6 kV/cm、100μs、2次直流电脉冲间隔100μs,再辅以CHX+CB处理4 h.利用优化的激活条件成功获得了乳腺特异表达人溶菌酶的转基因猪,为猪转基因育种奠定了基础.     

利用微秒和微纳秒脉冲电场诱导细胞融合

[目的]以小鼠骨髓瘤(SP2/0)细胞作为实验材料,比较了SP2/0细胞在不同微秒(μs)脉冲和微纳秒(μs/ns)复合脉冲电融合的细胞存活率和融合率,并确定了最优的μs/ns复合脉冲电融合参数。[方法]将SP2/0细胞分别用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)进行染色,分别选取3组μs脉冲和3组μs/ns复合脉冲对染色后的SP2/0细胞进行电融合,通过荧光显微镜观察融合后细胞的存活率和融合率。[结果]对比不同μs和μs/ns复合脉冲电融合存活率和融合率结果得知,μs/ns复合脉冲比μs脉冲电融合效果更好,且电融合参数为2. 5 k V/cm、20μs、1次,10 k V/cm、200 ns、8次时存活率和融合效率相对最好,存活率和融合率分别为88. 5%±6. 2%和80. 1%±2. 6%。[结论]通过采用不同μs和μs/ns复合脉冲电融合比较了SP2/0细胞的存活率和融合效率,结果显示μs/ns复合脉冲电融合参数在2. 5 k V/cm、20μs、1次,10 k V/cm、200 ns、8次时,存活率比μs脉冲电融合提高6. 4%,融合率提高23. 3%,为利用μs/ns复合脉冲研究杂交瘤细胞电融合奠定了基础。     

牛卵母细胞孤雌激活及马-牛异质克隆胚构建

首先用不同的激活剂孤雌激活体外成熟培养的牛卵母细胞,经试验获得:离子霉素、A23187和7%乙醇联合6-DMAP可有效地激活牛卵母细胞,并支持其发育到囊胚,但离子霉素激活效率显著优于其他两种(P<0.05);以10?S SOFaa 颗粒细胞为发育体系培养激活的成熟牛卵母细胞可得到较高的卵裂率和囊胚率(72.30%,14.91%)。其次,通过体外培养成年马皮肤成纤维细胞,将获得的成纤维细胞经血清饥饿培养后,作为核供体移入去核牛卵母细胞透明带下,电融合后,能得到融合的马牛重构胚,在交流电脉冲起始电压20V,持续时间10s,频率0.2MHz,结束电压15V,2次脉冲和融合间隔为0.125s的条件下,当融合电压为2.0kV/cm,脉冲时程为40μs时,重组胚的融合率和卵裂率最高(52.27%,71.74%)。     

小鼠电激活孤雌胚胎早期体内外发育能力的比较

目的探讨小鼠电激活孤雌胚胎的早期体内、外发育能力。方法 利用不同电脉冲参数和激活液对小鼠卵母细胞进行活化,观察激活后的小鼠孤雌胚体外发育状况和移植后的发育能力。结果非电解质激活液优于电解质液,脉冲强度、脉冲宽度和脉冲次数3个参数各自处于某一范围内时,他们之间存在某种相关性,降低其中1个参数可通过升高另外2个参数得到补偿,经筛选较适宜的电脉冲参数为：1.0 kV/cm、40μs、2 p,或者1.5kV/cm、30/μs、2 p,分别为74.65%和71.19%,体外囊胚发育率分别为43.40%和47.62%。电激活孤雌胚体外发育时序比正常胚胎慢,但囊胚细胞数与对照组差异不显著。它们经胚胎移植后,其中的一部分能够着床,但着床率仅为3.6%,极显著低于对照组（67%,P〈0.01）。结论电刺激能够较好地模拟正常受精过程激活小鼠卵母细胞,但激活后的多数小鼠孤雌胚胎着床能力较低,不能够顺利着床。     

卵裂球电脉冲融合制作昆明小鼠四倍体胚胎

为制作四倍体小鼠胚胎 ,用 4种脉冲电压强度 (6 0 0、 80 0、 10 0 0和 12 0 0V/cm )和 3种脉冲宽度(10、 30和 5 0 μs)组合 ,对 2 -细胞昆明小鼠胚胎做了融合实验。 6 0 0V/cm× 5 0 μs和 12 0 0V/cm× 30 μs两种组合融合率最高 ,分别为 91 6 %和 93 0 % ;而 6 0 0V/cm× 10 μs和 12 0 0V/cm× 5 0 μs时均显著低于其他各种组合 ,融合率分别为 5 8 9%和 6 0 2 %。以上结果表明 ,一定的脉冲电压强度是胚胎融合的必要条件 ,而脉冲宽度是影响胚胎融合及其后期发育的关键因素。激光共聚焦显微镜对融合后两细胞核的观察暗示 ,细胞核的迁移、靠近和融合是自发过程     

猪无透明带卵母细胞孤雌激活培养体系的优化

为了探讨猪无透明带卵母细胞孤雌激活培养体系,为手工克隆法生产小猪奠定理论和实验基础,本研究比较了不同浓度链霉蛋白酶对猪卵母细胞透明带的消化率及后期发育的卵裂率;比较了不同电激活参数对无透明带卵母细胞激活效率的影响,并探索了最适宜容纳孤雌激活胚胎的微穴大小。结果表明:2 mg/m L链霉蛋白酶能得到最高的消化率及后期发育的卵裂率;最佳电激活参数为:70 V/mm电压,80滋s脉冲时间,2次脉冲;较适宜容纳孤雌激活胚胎的微穴大小为:底部直径约为l20μm,深度约为150μm。     

牛体细胞核移植显微操作环节的优化

本研究从牛卵母细胞去核方法(纺锤体观测仪法&Hoechst33342染色法)、供体细胞核引入去核卵细胞质的方法(卵细胞质注射法和电融合法)和重构胚胎电融合(3组参数)等3个环节对牛体细胞核移植的显微操作过程及相关参数进行了筛选优化。以核移植胚胎的卵裂率、囊胚发育率作为检测指标,对不同的方法所获得的克隆胚胎的卵分裂率与囊胚发育率进行比较,最后筛选获得1个优化的牛体细胞核移植操作程序,即采用Spindle view系统对牛卵母细胞进行去核操作,将供核体细胞注射到卵周隙,然后通过电融合法将供体核引入去核卵细胞质(电融合参数为1.9kV/cm,脉冲时程10μs,方波2次间隔2s)。以此核移植程序进行牛体细胞核移植实验,自获得克隆胚胎中筛选80枚优质囊胚移植到33头受体牛子宫内,最后2头母牛产下2头克隆牛犊,结果表明利用该优化的显微操作环节进行牛体细胞核移植可以获得体细胞克隆牛犊。     

桂科Ⅰ号成年公猪体细胞核移植胚胎的体外生产

目前,关于桂科Ⅰ号猪体细胞核移植胚胎体外发育的研究尚未见报道。本研究结果表明,桂科Ⅰ号成年公猪来源的皮肤成纤维细胞(adult boar fibroblast cell,ABFC)和刚出生小公猪来源的皮肤成纤维细胞(newborn boar fibroblast cell,NBFC)对体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)胚胎的体外发育没有明显影响;在体外环境培养下,一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂—Scriptaid(SCR)对桂科Ⅰ号公猪SCNT胚胎的囊胚率具有促进作用。研究进行3个实验,实验一结果表明,细胞呈现典型的成纤维细胞形态,且生长呈现S型;实验二结果表明,通过将ABFC与NBFC注射到去核的卵母细胞制作SCNT胚胎,ABFC和NBFC来源的桂科Ⅰ号公猪SCNT胚胎的融合率、分裂率、囊胚率和囊胚细胞数没有明显的差异(53.2%vs 61.7%,p0.05;72.3%vs 75.7%,p0.05;11.9%vs 11.7%,p0.05;60.7 vs 57.5,p0.05);实验三结果表明,通过500 nmol/L SCR处理ABFC来源的SCNT胚胎,与对照组相比,处理组的分裂率和囊胚细胞数没有明显的差异(82.6%vs 80.1%,p0.05;42.9 vs 41.4,p0.05);但添加500 nmol/L SCR的ABFC来源的SCNT胚胎的囊胚率明显比对照组的高(21.6%vs 11.5%,p0.05)。数据表明桂科Ⅰ号成年公猪体细胞可作为供体细胞生产克隆胚胎,并且在体外环境培养下,通过500 nmol/L SCR处理极大地提高克隆胚胎的囊胚率,本研究可为下一步生产存活的桂科Ⅰ号SCNT猪奠定基础。     

猪手工克隆重构胚胎发育效果影响的最佳VPA浓度初探

为了探讨丙戊酸(VPA)对手工克隆(HMC)重构胚胎发育效果影响的最佳浓度,本研究比较了mmol/L级别和nmol/L级别两种浓度的VPA持续地处理猪HMC重构胚24 h的发育效果。试验结果表明:两种级别的VPA对猪HMC重构胚胎发育的卵裂率的影响差异不显著(p0.05),就囊胚率和囊胚细胞数而言,mmol/L级别的VPA浓度抑制其发育,且随着浓度的升高,抑制作用表现明显。nmol/L级别的VPA浓度能促进其发育,且50 nmol/L的VPA为最佳浓度,囊胚率为44.28%,细胞数为72.33个,显著高于其他浓度处理组(p0.05)。因此,应用50 nmol/L的VPA处理可提高猪HMC重构胚胎的囊胚率及增加囊胚细胞数,提高了猪HMC胚胎的体外发育潜能。     

电穿孔介导小干扰RNA高效转染小鼠附植前胚胎

使用Cy3标记的阴性对照小干扰RNA(siRNA)转染小鼠附植前胚胎,建立向小鼠附植前胚胎导入siRNA的电穿孔方法。通过控制透明带弱化程度、电压、脉冲时间和脉冲次数等条件,采用不同参数组合并结合使用不同介质作为电转缓冲液将Cy3标记的阴性对照siRNA转染小鼠附植前胚胎。在荧光倒置显微镜下,观察胚胎的存活率、siRNA转染率以及阳性转染存活胚胎的囊胚发育率。结果显示小鼠附植前胚胎在使用台氏液消化胚胎透明带10 s后,以opti-MEM作为电转缓冲液,电穿孔参数设置为30 V,1 ms,3次的条件下取得最佳转染效果。总之,电穿孔方法可实现siRNA简便、高效地转染小鼠附植前胚胎。     

外电场诱导叶肉原生质体融合

应用一交变电场(正弦波,500KHz,175—225V/cm),分别将裸大麦(正常或正常与黄化)、蚕豆、烟草的叶肉原生质体在一定间隔、平行的两电极间排列成串。再附加单个的方波脉冲(10—40μs,800V/cm,因不同的材料而异),以诱导相邻原生质体局部接触区发生质膜的可逆击穿而形成融合。上述正弦波和方波脉冲均由自制的细胞融合仪发生。在本实验条件下,融合率可达50%以上,并探讨了方波脉冲讯号以及其它有关的条件对于融合率的影响。     

猪胚胎玻璃化冷冻保存技术的优化

在以往工作的基础上本研究对现有猪胚胎玻璃化冷冻保存技术进行了优化。以巴马小型猪为供体,采用超数排卵技术,采集5~6日龄的胚胎(囊胚/桑椹胚),比较冷冻方法、胚胎承载工具胚胎、透明带处理和冷冻胚胎移植受体对猪胚胎冷冻效果的影响。结果表明,冷冻方法I[胚胎首先在冷冻液1(TCM199+20%FBS+10%EG+10%DMSO)中平衡3min,然后立即转入冷冻液2(TCM199+20%FBS+20%EG+20%DMSO+0.4mol/LSUC)中并在1min内装管(每管含2~6枚胚胎),直接投入液氮保存]与冷冻方法II[透明带完整的胚胎在NCSU23(含7.5μg/mLCB)培养液中平衡25min,13000×g离心12~13min,然后在含2mol/LEG的NCSU23中平衡5min,再在含8mol/LEG+7%PVP的NCSU23中快速漂洗,装进OPS/GMP管,放入液氮保存]冷冻效果没有显著差异;GMP法能显著提高冷冻胚胎存活率(83.8%vs77.6%,P<0.05)和囊胚细胞数(47.5vs53.1,P<0.05);以0.5%链蛋白酶(Pronase)处理透明带10s,虽然对猪胚胎存活率没有显著影响,但能...     

延迟激活对猪克隆胚胎体外、体内发育效率的影响

为了提高猪克隆效率,获得更多的克隆猪,研究了延迟激活对猪体细胞克隆胚胎体外、体内发育的影响。研究发现,和同步融合激活方法相比,延迟激活虽然会降低克隆重构胚的融合率(P 0. 05),但能够显著提高克隆胚胎的卵裂率(P 0. 01)和囊胚率(P 0. 05);延迟激活方法重构胚使用CB辅助激活4h,其囊胚率均极显著高于不使用CB组(P 0. 01);将克隆胚胎移植到126头受体母猪后,延迟激活组受体母猪分娩率显著高于同步激活组(P 0. 05),虽然在窝均总仔、窝均活仔、克隆效率方面没有显著差异,但延迟激活组显然获得了更多的克隆仔猪。以上结果说明,延迟激活方法能够提高猪克隆胚胎的体外、体内发育效率。     

培养基中能量底物对猪胚胎发育的影响

旨在探讨丙酮酸和乳酸对猪(Susscrofa)胚胎早期发育的影响,将NCSU-23培养基中的5.56mmol/L葡萄糖替换为0.2mmol/L丙酮酸、5.7mmol/L乳酸,并将此培养基命名为mNCSU-23。根据实验设计,孤雌胚及核移植胚转移到mNCSU-23或NCSU-23中培养。激活第2天统计孤雌胚及核移植胚中的5～8细胞胚胎数。激活第6天统计孤雌胚及核移植胚囊胚形成率及囊胚细胞数。实验结果表明,mNCSU/NCSU处理组的5～8细胞胚胎数及囊胚数显著高于对照组(P0.05);单纯使用mNCSU培养猪胚胎时,囊胚率最低,发育结果最差(P0.05)。本研究证实,在体外培养前两天,用乳酸和丙酮酸代替培养基中的葡萄糖对胚胎发育有利。     

小鼠胚胎体外培养方法的优化及胚胎质量评估

实验采用输卵管收集获得的 2 细胞、原核受精卵和体外受精得到的胚胎。 2 细胞胚胎在所有培养浓度下均达到较高的囊胚发育率 ,而ISF和IVF受精卵在减低培养浓度后发育率显著降低 (p <0 .0 1 ) ,ISF受精卵从高密度 (1 /μl)下约 82 .5 %的发育率到低密度 (1 /1 0 0 0 μl)下 2 2 .3 %的发育率。而IVF胚胎的这两个值分别为 46 .3 %和5 .2 %。2 细胞胚胎与其他两种受精卵相比 ,每个囊胚所含的细胞数目差异显著 (p <0 .0 1 )。添加 1ng/ml(1 /1 0 μl)和 1 0ng/ml(1 /1 0 0 μl)的PAF显著增加了IVF胚胎的囊胚发育率 (p <0 .0 1 )。在胚胎密度为 1 /1 0 μl的培养密度下 ,添加 1 0ng/ml以上的IGF Ⅰ同样改善IVF受精卵的发育能力 (p <0 .0 1 )。培养液中添加EGF对囊胚的发育率没有影响。PAF和IGF Ⅰ协同作用的效果与IGF Ⅰ单独处理的结果并无差异 (p >0 .0 5) ,但高于PAF单独处理组 (p <0 .0 5)。结果表明 ,胚胎生长所需的生长因子在低密度培养条件下被稀释并影响胚胎的正常发育。PAF和IGF Ⅰ作为自分泌性胚胎营养因子在一定程度上补偿了由于低密度培养所带来的负效应。     

绵羊胞内单精子注射技术

本文的主要目标是建立绵羊胞内单精子注射技术(intracyioplasmic sperm injection,ICSI)。并且尝试了ICSI技术生产绵羊转基因胚胎的可能性。实验1比较了绵羊卵母细胞孤雌激活的3种化学方法。结果显示,Ionomvcin/3 h/6-dimethylaminopurine(6-DMAP)和Ionomycin激活胚的卵裂率(71.7%和91.8%)和囊胚率(17.4%和11%)显著(P<0.01)高于Ca~(2+)激活胚(18.4%和0)。Ionomycin/3 h/6-DMAP激活胚的囊胚发育形态和比例相对较高。实验2中,活精子注射至卵母细胞质后,用Ionomycin/3 h/6-DMAP激活,排出第二极体(PB2)的71枚ICSI胚胎用SOFaaBSA溶液培养,卵裂率为71.8%(51/71),显著(P<0.01)高于体外受精(41.4%,IVF)和阴性对照胚胎(30.2%,sham-ICSI)。培养7天后,sham-ICSI组没有囊胚生成;ICSI和IVF胚胎的囊胚率分别为7.0%(5/71)和16.1%(9/56),两者差异不显著(P>0.05)。这些ICSI囊胚在冷冻前后均能孵化,显示初步建立了绵羊ICSI技术。另外,我们探索了ICSI技术生产转基因胚胎的可能性,-20℃冻融1次的死精子与pEGFP-N1质粒共注射,33枚2-细胞期ICSI胚胎中,2枚可见GFP蛋白。其中1枚停止发育,另外1枚继续发育至16-细胞期,仍然可见GFP基因的表达。4枚解冻的ICSI囊胚手术移植给2只发情同期化受体绵羊,60天时,B超未见怀孕。本文初步结果表明,ICSI技术生产转基因绵羊有可能性,需深入研究。     

兔体细胞核移植的初步研究

实验以兔胎儿成纤维细胞为核供体,对兔体细胞核移植技术的融合,激活和发育等环节进行了初步研究。实验通过比较不同电场强度对兔2细胞胚胎卵裂球融合以及卵母细胞激活的影响,证实200和260V/mm的电场强度可有效地诱导2细胞胚胎的融合和兔卵母细胞的孤雌激活。然后将200和260V／mm电场强度用于体细胞核移植,融合率分别为44．4％和48．4％,卵裂率分别为58．8％和53．8％,桑椹胚／囊胚发育率分别为5．9％和5．5%。但112枚核移植胚胎移植到5只受体后没有幼子出生。结果表明,实验中所建立的程序至少可以支持兔体细胞克隆胚胎的早期发育。     

广西巴马小香猪体细胞克隆

本研究旨在检验新生广西巴马小香猪肾脏成纤维细胞支持克隆胚胎完全的体内发育潜能,亦即能通过其构建出存活的克隆猪,从而为克隆技术在广西巴马小香猪资源保存和开发上的应用奠定基础。首先制备新生雄性广西巴马小香猪肾脏成纤维细胞,用其制备体细胞核移植胚胎,追踪观察体细胞核移植胚胎体外发育潜能,最后通过胚胎移植检验其完全的体内发育潜能。实验结果表明,制备的新生雄性广西巴马小香猪肾脏成纤维细胞具有良好的细胞增殖活性,用其制备的体细胞核移植胚胎分裂率和囊胚率分别为77.7%(334/430)和16.5%(71/430),将1 658枚克隆胚胎移植给6头代孕母猪,其中2头妊娠并最终产下8头存活雄性克隆小猪和3头死胎,整体克隆效率为0.66%,存活克隆猪健康状况良好。本研究表明,新生猪肾脏成纤维细胞是一种理想的用于生产体细胞克隆广西巴马小香猪的细胞资源。     

Scriptaid处理可提高近交系五指山猪克隆胚胎的发育能力和克隆效率

为探讨一种新型低毒的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid处理克隆胚胎时对其发育能力和克隆效率的影响,本研究以近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞为供体细胞进行体细胞核移植构建重构胚胎,重构胚胎激活后培养在添加Scriptaid不同浓度(0～300 nmol/ L)的胚胎培养液中培养不同的时间(0～36 h),观察克隆胚胎的卵裂率和囊胚率,评价克隆胚胎体外的发育能力.实验结果发现100 nmol/L Scriptaid处理24 h组克隆胚胎的囊胚发育率(30.4%)较对照组(17.5%)显著提高,P<0.05.将100 nmol/L Scriptaid处理24 h组克隆胚胎和对照组胚胎分别移植到4头受体母猪中,进一步观察其体内的发育能力.处理组克隆胚胎的受体在平均窝产仔数和克隆效率(分别为5头,2.4%)均显著高于对照组(分别为1.5头,0.7%),P<0.05.以上结果表明,100 nmol/L Scriptaid处理24 h近交系五指山小型猪克隆胚胎,有利于提高克隆胚胎的发育能力和克隆效率.     

绒山羊表达红色荧光及转胰岛素样生长因子Ⅰ基因体细胞核移植胚胎的制备

利用含有红色荧光和Neor基因双选择标记的IGF1毛囊特异表达载体pCDsR-KI转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得具有红色荧光的IGF1转基因细胞.核移植操作前,通过比较卵母细胞体外成熟培养不同时间的成熟率以及核与极体的距离,确定20h为绒山羊卵母细胞的最佳成熟时间.比较了不同激活方法和培养体系对孤雌胚激活效率和孤雌胚早期发育的影响,结果表明：IA23187＋6-DMAP组的激活效率和囊胚率（88.7%＆21.6%）均稍高于乙醇＋6-DMAP组（86.4%＆20.4%）,但二组相应数据之间差异均不显著（P〉0.05）,选择前者作为转基因核移植胚的激活方案;SOFaa和CR1aa两种体外培养体系中,孤雌胚卵裂率（86.8%vs83.9%）和囊胚率（23.1%vs17.2%）均差异不显著（P〉0.05）,选择结果较好的SOFaa组.比较了不同电融合参数的融合效果,结果表明：190V/mm处理组结果（62.4%）显著高于130V/mm（32.8%）和200V/mm（42.9%）组（P〈0.05）.通过T-SCNT获得转基因重构胚胎203枚,48h卵裂率为79.3%（161/203）,第7~9天囊胚发育率为15.3%（31/203）.所得到的31枚囊胚中,较强表达红色荧光蛋白的囊胚数为17枚（阳性率为54.8%）.随机挑选两枚红色荧光囊胚以PCR法进行鉴定,结果全部为转基因阳性.以上结果显示：（i）表达载体的红色荧光蛋白和Neor基因可以正常表达可获取转基因细胞和阳性转基因胚胎;（ii）所制备转基因囊胚仍有部分不表达红色荧光蛋白,说明即使选择转基因阳性细胞进行核移植所得囊胚也并非全部为转基因阳性,在囊胚期进一步筛选是必要的;（iii）通过TSCNT操作及优化,成功获得了表达红色荧光并同时转有IGF1基因的绒山羊胚胎,为绒山羊的转基因研究提供基础数据.