iTRAQ结合2D LC-MS/MS技术在草菇不同生长发育时期蛋白质组分析中的应用

【目的】旨在采用iTRAQ标记结合二维液相色谱串联质谱技术对草菇不同生长发育阶段的差异蛋白质组进行研究。【方法】首先将提取的草菇不同生长阶段蛋白样品进行SDS-PAGE分析,其次将经二维液相色谱串联质谱技术获取的串联质谱数据通过MASCOT软件搜库,之后对鉴定蛋白质数据进行了主成分分析(Principal componentanalysis,PCA)、层次聚类(Hierarchy clustering)分析、K-均值(K-means)聚类和GeneOntology(GO)注释分析。【结果】试验结果显示,共计获得2 335个不同肽段,鉴定到1 039个蛋白质,其中1 030个蛋白质具有定量信息。在子实体阶段中显著上调蛋白质64个,下调蛋白质150个。生物信息学分析表明,iTRAQ标记技术结合二维液相色谱串联质谱可对不同生长发育时期的草菇蛋白样品进行有效地分离和鉴定。【结论】这一研究结果为深入研究草菇乃至其他大型担子菌子实体形成和发育的分子机制提供借鉴。     

草菇子实体不同成熟阶段的比较蛋白质组学分析

采用iTRAQ标记结合二维液相色谱串联质谱技术对草菇不同成熟阶段的差异蛋白质组进行研究。首先将提取的草菇不同成熟阶段蛋白样品进行SDS-PAGE分析,其次将经二维液相色谱串联质谱技术获取的串联质谱数据通过MASCOT软件搜库,之后对鉴定蛋白质数据进行了KEGG代谢通路分析。试验共计获得2 335个不同肽段, 鉴定到1 039个蛋白质,其中1 030个蛋白质具有定量信息。与蛋形期相比,在伸长期和成熟期阶段显著上调蛋白质85个,下调蛋白质103个。KEGG代谢通路分析结果显示,草菇不同成熟阶段中的68个差异蛋白质可定位于4种伞菌目模式真菌（灰盖鬼伞、双色蜡蘑、可可丛枝病菌和裂褶菌）的45个不同生物代谢途径,全景展示出草菇成熟阶段差异表达蛋白质定位的代谢网络。结果表明,iTRAQ标记技术结合二维液相色谱串联质谱可对不同生长发育时期的草菇蛋白样品进行有效地分离和鉴定。     

基于LC-MS/MS策略建立水牛卵母细胞蛋白质表达谱的方法研究

本研究采用了LC-MS/MS策略对如何建立水牛卵母细胞蛋白质表达谱进行了探讨,为后续研究不同时期的水牛卵母细胞和早期胚胎卵裂分化过程中蛋白质组变化建立研究平台。本实验收集水牛GV期和MⅡ期卵母细胞各500枚,去除透明带后将两个时期的细胞混合后提取蛋白质,蛋白质酶解后通过强阳离子交换色谱预分离多肽混合物,预分离后的馏分采用EASY-n LC结合LTQ-Orbitrap质谱鉴定蛋白质表达谱。通过SEQUEST检索,共鉴定出574种蛋白质,生物信息学分析表明,有明确分子功能相关的蛋白质有487种,与组成细胞成分相关的蛋白质有476种,与生物学进程相关的蛋白质有490种,初步建立了一套获得水牛卵母细胞蛋白质表达谱的方法。结果表明建立的LC-MS/MS策略方法适合于水牛卵母细胞蛋白质组学的研究,卵母细胞蛋白质表达谱数据为今后研究水牛不同时期的卵母细胞和早期胚胎卵裂分化过程中蛋白质组学奠定了方法与理论基础。     

水牛卵巢黄体形成和退化的蛋白质表达谱构建及生物信息学分析

本研究构建了水牛卵巢黄体形成及退化过程的定量蛋白质表达谱,从中寻找与水牛发情周期相关的重要蛋白质。为研究水牛卵巢周期性变化的分子机制提供蛋白质水平的数据支撑,进而为提高水牛繁殖效率奠定实验基础。以水牛排卵后的红体期(corpus hemorrhagicum,CH)、黄体期(corpus luteum,CL)和白体期(corpus fibrosum,CF)的卵巢作为研究对象,利用串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)标记结合液质联用((liquid chromatography/mass spectrometry,LC-MS/MS)的定量蛋白质组学技术,采用相关软件对得到的差异表达蛋白质进行生物信息学分析。同时对与水牛发情周期相关的重要差异蛋白质:单核巨噬细胞分化抗原(CD14)、通用转录因子Ⅱ-Ⅰ(GTF2I)、羟基类固醇(17β)脱氢酶1(HSD17B1)、U6 sn RNA相关Sm样蛋白质(LSM1)和纤溶酶原激活物抑制物(SERPINE1)进行了qRT-PCR分析验证。结果显示,共鉴定得到2 343种蛋白质,其中差异表达蛋白质有284种(差异倍数≥2.0),初步构建了水牛卵巢黄体形成和退化的定量蛋白质表达谱。对其中的五种重要差异蛋白质(CD14、GTF2I、HSD17B1、LSM1和SERPINE1)进行qRT-PCR验证,结果有四种(CD14、HSD17B1、LSM1和SERPINE1)的qPCR结果与质谱结果相一致,仅GTF2I与质谱结果不一致,可能是由于GTF2I存在转录后调控。本研究首次从蛋白质水平对水牛卵巢排卵后的周期性变化的分子机制进行了探究,同时为其他家畜品种发情周期的研究提供了新的研究思路。     

纳升电喷雾串联质谱技术对阻断泛素通路诱导凋亡相关蛋白质的鉴定

应用毛细管液相色谱 电喷雾 四极杆 飞行时间串联质谱和纳升电喷雾 四极杆 飞行时间串联质谱技术 ,对阻断白血病细胞泛素通路诱发的凋亡相关蛋白质进行了鉴定。通过双向电泳发现 ,蛋白质斑点H在阻断Mo7e白血病细胞泛素通路 2h之后 ,表达量明显增加 ,6h达到最高。该斑点经MALDI TOF MS肽质量指纹谱分析未获结果 ,但通过上述 2种串联质谱技术获得其胰蛋白酶水解肽段的串联质谱图和肽段的全长序列 ,经检索均确认为RhoGDIβ蛋白。进一步发现阻断泛素通路还诱发了另 2个斑点出现 ,位于H点附近 ,经鉴定为同一蛋白质 ,可能是不同翻译后修饰所造成     

基于液相色谱质谱联用的蛋白质组非标记定量研究策略的建立及应用

定量蛋白质组研究是蛋白质组研究的热点和难点,而液相色谱质谱技术已经被广泛地应用于蛋白质的定性和定量研究.该研究建立和优化了一种基于液相色谱质谱联用技术的蛋白质组非标记定量方法,并对两种肽段质谱检测计数的归一化算法进行了比较,结果发现ASC法要优于Rsc法.最后,将建立的方法应用于肝癌细胞模型HepG2和HepG2-HBx细胞系的差异蛋白质组表达研究.质谱鉴定结果用聚类分析软件cluster3.0进行分析,最后鉴定出107个重叠蛋白,其中9个蛋白质表达上调(Ratio>1.75),6个蛋白质表达下调(Ratio<0.5),这些蛋白质均与肝癌发生和恶化密切相关.结果表明,该技术操作简单、方便,具有较高的灵敏度和动态范围,利用该方法进行差异蛋白质组研究和发现生物标志物在理论和临床上具有十分重要的意义.     

基于iTRAQ技术分析五倍子作用白念珠菌后的差异蛋白表达

为了探讨五倍子抗白念珠菌的作用机制,提取4 μg/mL五倍子提取液作用后的白念珠菌（SC5314）总蛋白,采用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）蛋白质组学技术、液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术分析和鉴定差异表达的蛋白质,并对差异表达蛋白进行生物信息学分析。经LC-MS/MS鉴定出3 721种蛋白质,其中,差异表达蛋白104种,包括57种表达上调蛋白和47种表达下调蛋白。通过生物信息学分析发现,上述差异蛋白参与了氧化还原反应、过氧化氢分解代谢以及能量代谢等生物学过程。研究表明,五倍子抗白念珠菌的作用机制可能是通过抑制氧化磷酸化,进而影响菌体能量代谢和物质生成,最终导致细胞结构与功能的改变。     

高畸形率水牛精子与正常水牛精子差异表达蛋白的分离和鉴定

旨在分析高畸形率和正常水牛精子的差异表达蛋白.运用双向凝胶电泳以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS/MS)分析鉴定出高畸形率和正常的水牛精子的差异表达蛋白,并对部分蛋白进行生物信息学分析.结果显示,高畸形率和正常水牛精子之间存在16个表达差异明显的蛋白点,与正常水牛精子相比,5个蛋白斑点表达量上调,6个蛋白斑点下调,3个蛋白斑点缺失,2个蛋白斑点在畸形率高的水牛精子特有.质谱鉴定16个差异蛋白,成功鉴定出6个差异蛋白斑点,对应4种蛋白:左旋天冬酰胺酶、热应激蛋白β-9、半乳糖激酶、β-微管蛋白-2C.研究表明,高畸形率和正常水牛精子蛋白质表达存在一定的差异.     

人表皮生长因子肽谱及一级结构的质谱法分析

采用液相色谱－质谱联用法（ＬＣ－ＭＳ）,分别对基因工程表达的人表皮生长因子胰蛋白酶和Ｖ８蛋白酶的酶解产物进行了肽质谱分析,获得各肽段的分子量信息。并对大部分肽段用串联质谱（ＭＳ－ＭＳ）分析了肽的序列,获得其氨基酸序列信息。此外,还测定了分子中二硫键的数目。均获得满意的结果。这一方法的建立将有助于天然的,人工合成的及基因工程表达的蛋白质或多肽的鉴定和结构分析,其精确度及分辨率都超过常规方法。     

多维色谱-串联质谱联用技术分离和鉴定小鼠肝脏质膜蛋白质

采用自动在线纳流多维液相色谱 串联质谱联用的方法分离和鉴定蔗糖密度梯度离心法分离和富集的小鼠肝脏质膜蛋白质 .以强阳离子交换柱为第一相 ,反相柱为第二相 ,在两相之间连接一预柱脱盐和浓缩肽段 .用含去污剂的溶剂提取细胞质膜中的蛋白质 ,获得的质膜蛋白质经酶解和适当的酸化后通过离子交换柱吸附 ,分别用 10个不同浓度的乙酸铵盐溶液进行分段洗脱 .洗脱物经预柱脱盐和浓缩后进入毛细管反相柱进行反相分离 ,分离后的肽段直接进入质谱仪离子源进行一级和二级质谱分析 .质谱仪采得的数据经计算机处理后用Mascot软件进行蛋白质数据库搜寻 ,共鉴定出 12 6种蛋白质 ,其中 4 1种为膜蛋白 ,包括与膜相关的蛋白质和具有多个跨膜区的整合膜蛋白 ,为建立质膜蛋白质组学研究的适宜方法和质膜蛋白质数据库提供了有价值的基础性研究资料 .     

羟基喜树碱诱导肝癌细胞凋亡前后细胞核蛋白质组变化的定量分析

对羟基喜树碱诱导肝癌细胞凋亡前后的细胞核蛋白质组进行定量研究,获得凋亡前后细胞核蛋白质组中差异蛋白表达量相对变化的信息,为在亚细胞定量蛋白质组水平上深入探讨羟基喜树碱的作用机理提供实验依据。分离提取羟基喜树碱诱导肝癌细胞凋亡前后的细胞核并鉴定其纯度,用含稳定同位素的化学试剂c-ICAT标记细胞凋亡前后的细胞核蛋白,对细胞核标记蛋白进行消化和纯化,利用基于多维色谱-线性离子阱/静电场轨道阱质谱联用技术的鸟枪（Shotgun）法策略及c-ICAT定量策略分析鉴定蛋白质,获得同一种肝癌细胞核蛋白质在凋亡前后细胞中的表达量变化比值。分析鉴定了在细胞凋亡前后的表达量差异有显著统计学意义（P〈0.05）的肝癌细胞核蛋白42个,其中,12个蛋白的表达量在羟基喜树碱诱导细胞凋亡后下调,30个蛋白的表达量在凋亡细胞中上调。这些差异蛋白的分子功能主要与细胞增殖、凋亡和分化、能量代谢、核酸代谢以及细胞骨架相关。     

混合谱图所引发的肽段质谱数据分析的问题及其解决方案

基于数据依赖性采集模式(DDA)的质谱分析是进行规模化蛋白质组学研究的常用方法。由于这类方法往往是液相色谱与质谱联用,因此肽段分离及其质量鉴定是该方法的核心指标。对于复杂肽段混合物而言,混合质谱图是广泛存在的;它们给肽段定性和定量都带来严重的问题。在当前的技术条件下,开发用于识别和分析混合质谱图的生物信息学工具是解决这一问题的可行方案。本文主要介绍了混合质谱图产生的原因和影响因素,以及识别和分析混合谱图的相关生物信息学工具的最新开发进展。     

生物活性肽蛋白质组分分离与鉴定方法的建立

目的:评估大规模蛋白质组分离与鉴定技术策略在生物活性肽研究中的应用价值。方法:采用全溶液酶解及胶内分离与酶解方法分离生物活性肽;肽段离子阱串联质谱鉴定时,采用碰撞诱导解离与电子转移解离2种互补的肽段碎裂模式。结果:几种方法联用,鉴定到复杂生物活性肽样品中236个多肽大分子;不同分离和鉴定策略显示出良好的互补性,基于凝胶电泳分离的策略提供了最好的鉴定效果。结论:大规模的蛋白质组学分离与鉴定技术策略可以有效应用于生物活性肽组分的表征。     

评价新型稳定同位素赖氨酸标记在定量蛋白质组学中的应用

为了评价基于2-甲氧基-4,5-二氢-1氢-咪唑稳定同位素试剂在定量蛋白质组学中的应用价值,合成了轻型(D0)和重型(D4)的2-甲氧基-4,5-二氢-1氢-咪唑,通过对标准蛋白BSA酶解后产物的标记确认标记反应的特异性,并观察了标记物在MALDI-TOF-MS和LC-ESI-MS中定量的准确性,标记肽在串联质谱中的离子特点,以及对反相液相色谱行为的影响。结果表明,2-甲氧基-4,5-二氢-1氢-咪唑只与酶解后的肽段赖氨酸侧链氨基反应,具有良好的标记特异性;差异表达蛋白的定量可以通过MALDI和ESI电离模式实现;标记肽的串联质谱主要产生y离子,测序更为简便;反相液相色谱可以保持较好的分离效果,氘原子的引入不会影响保留时间,侧链修饰可以用于涉及液相色谱分离的蛋白质组学技术。2-甲氧基-4,5-二氢-1氢-咪唑稳定同位素试剂可以用于定量蛋白质组学。     

大鼠海马的表达蛋白质组学实验研究

目的：用蛋白质组学方法初步分析大鼠海马蛋白质的表达。方法：提取大鼠海马蛋白质样品后,用双向凝胶电泳对其分离,经考马斯亮蓝染色后,产生大鼠海马蛋白质双向凝胶电泳图谱。从凝胶上切割分离的蛋白质,经胰蛋白酶胶内酶解,通过基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对酶解后的肽段进行分析。根据肽段质谱数据,经数据库（NCBI）检索,对蛋白质进行鉴定。结果：鉴定了37种具有明确功能的蛋白质,它们分别属于代谢酶、细胞骨架蛋白、热休克蛋白、抗氧化蛋白、信号传导蛋白、蛋白酶体相关蛋白、神经元特异蛋白及神经胶质蛋白。另外,鉴定了3种未知功能蛋白。结论：为建立大鼠海马蛋白质组数据库提供必要的资料,为在大鼠模型上研究神经疾病发病机理奠定基础。     

脊髓全横断损伤后差异表达蛋白的蛋白质组学分析

 对脊髓全横断损伤前后的大鼠脊髓全蛋白质进行双向凝胶电泳,借助PDQuest软件从中找出差异表达蛋白质点.应用基质辅助激光解吸电离串联质谱,对差异表达的蛋白质点进行鉴定,成功鉴定出18种蛋白质.脊髓损伤3 d后表达上调的蛋白质有巨噬细胞游走抑制因子、S期激酶相关蛋白 1、热休克蛋白 27、多配体蛋白聚糖 3、T细胞受体β链可变区、膜联蛋白Ⅲ、腺苷酸激酶 1、半乳凝素 3、丙酮酸脱氢酶、磷脂酶 B、嗜铬粒蛋白 A、热休克蛋白70凝结蛋白 1;同时表达下调的蛋白质有磷酸丙糖异构酶、神经鞘氨醇磷酸化受体、热休克蛋白10、肽酰 脯氨酰 顺反式异构酶 A多数差异蛋白质涉及到神经细胞的增殖、凋亡、应激反应等过程,为进一步阐明中枢神经系统的损伤和修复机制提供了理论依据.摘要 对脊髓全横断损伤前后的大鼠脊髓全蛋白质进行双向凝胶电泳,借助PDQuest软件从中找出差异表达蛋白质点.应用基质辅助激光解吸电离串联质谱,对差异表达的蛋白质点进行鉴定,成功鉴定出18种蛋白质.脊髓损伤3 d后表达上调的蛋白质有巨噬细胞游走抑制因子、S期激酶相关蛋白 1、热休克蛋白 27、多配体蛋白聚糖 3、T细胞受体β链可变区、膜联蛋白Ⅲ、腺苷酸激酶 1、半乳凝素 3、丙酮酸脱氢酶、磷脂酶 B、嗜铬粒蛋白 A、热休克蛋白70凝结蛋白 1;同时表达下调的蛋白质有磷酸丙糖异构酶、神经鞘氨醇磷酸化受体、热休克蛋白10、肽酰 脯氨酰 顺反式异构酶 A多数差异蛋白质涉及到神经细胞的增殖、凋亡、应激反应等过程,为进一步阐明中枢神经系统的损伤和修复机制提供了理论依据.     

双孢蘑菇子实体发育不同阶段蛋白质组分析

为探讨双孢蘑菇子实体发育不同阶段的蛋白质表达变化,对双孢蘑菇As2796菌株子实体原基期、幼菇期、采收期、开伞期的蛋白质组进行了二维液相色谱串联质谱（iTRAQ-MS/MS）分析,共获得不同肽段5 869个,鉴定到1 059个蛋白质,其中1 007个具有相对定量信息。与双孢蘑菇原基期相比,幼菇期、采收期和开伞期分别有差异蛋白质242、200、240个,分别占鉴定蛋白质总数的24.0%,19.9%和23.8%。对这些蛋白质及不同阶段之间的差异蛋白质进行了系列生物信息学分析,对8个上、下调表达具有连续性的差异蛋白质相关基因进行了荧光定量PCR验证,其中3个蛋白质（错配碱基识别蛋白、细胞色素C1及某推定的未知蛋白质）基因的转录与蛋白质的表达具有较为一致的趋势。这些结果为后续双孢蘑菇子实体发育相关基因的功能研究奠定了良好的基础。     

家兔肠系膜上动脉闭塞性休克前后的血清比较蛋白质组学初步研究

目的：探讨家兔肠系膜上动脉闭塞性（SMAO）休克前后血清蛋白质组学变化及其在SMAO休克发生中的作用。方法：应用家兔肠系膜上动脉夹闭法复制家兔SMAO休克模型,在此基础上通过双向电泳分离家兔SMAO休克前后血清中的蛋白,找出凝胶上的差异蛋白点,用基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱技术进行鉴定,并通过生物信息学对差异蛋白的功能进行分析。结果：在家兔SMAO休克前后血清双向电泳图谱中发现19个差异蛋白点,其中11个蛋白质点在SMAO休克后血清中表达明显上调;8个蛋白质点在SMAO休克后血清中表达明显下调。从中选取4个差异最明显的点经基质辅助激光解吸/电离串联飞行和数据库搜索共鉴定出符合条件的2个差异蛋白点,为对氧磷酶和触珠蛋白,均在SMAO休克后血清中含量增高。结论：家兔SMAO休克前后血清蛋白质组会发生明显变化,对氧磷酶和触珠蛋白可能参与了SMAO休克后机体的代偿调节。     

人皮肤成纤维细胞和脐带间充质干细胞分泌蛋白差异比较研究

该文探讨人皮肤成纤维细胞(NCF)和脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)分泌蛋白的差异,从而初步阐明脐带间充质干细胞分泌蛋白对于治疗退行性疾病的可能分子机理。基于串联质谱(LC-MS/MS)的方法,收集用无血清培养基培养48 h的NCF和hUC-MSCs上清样品,进行TMT(tandem mass tags for relative and absolute quantitation)检测,从而对蛋白质酶解之后的肽段进行同位素标记,之后对分泌蛋白的表达差异进行精确的鉴定和定量。通过生物信息学分析,建立NCF和hUC-MSCs分泌蛋白谱图,并通过GO(gene ontology)对这些分泌蛋白进行功能分析,对于在蛋白分子互作图中处于中心位置的CCL2、COL4A1、TGFβ1、SERPINE1、SEMA7A我们进行了Real-time PCR定量分析。通过TMT以及生物信息学分析,该文鉴定出1 000多种共有蛋白,其中有704种蛋白在hUC-MSCs中的表达量比NCF中高。通过Real-time PCR,我们证实了CCL2、COL4A1在hUC-MSCs中的分泌量的确高于其在NCF中的分泌量,且差异具有显著性。通过检索文献以及Uniprot的相应数据库数据,该文发现,这两种分子在炎症的消除方面起到十分重要的作用,而炎症反应在帕金森病等退行性疾病的发生与发展过程中起到重要作用。通过对NCF和hUC-MSCs培养基中分泌的蛋白进行检测分析,该研究为探讨脐带间充质干细胞分泌蛋白治疗神经退行性疾病的可能分子机制提供启示。     

白癜风患者病变表皮与正常表皮的比较蛋白质组学研究（英文）

目的 本文通过开展白癜风患者病变表皮与正常表皮的比较蛋白质组学研究，发现和鉴定白癜风患者病变表皮与正常表皮之间的差异表达蛋白，以探讨白癜风患者表皮发生病变的分子机制。方法 首先，建立和优化了表皮样品中蛋白质的最佳酶切条件。其次，采用基于串联质谱标签（TMT）标记的定量蛋白质组学技术策略开展了稳定期白癜风患者病变表皮与正常表皮的比较蛋白质组学研究，并筛选了差异表达蛋白。最后通过生物信息学分析工具及数据库（GO、KEGG、STRING、GSEA）对差异蛋白进行功能富集分析。结果 优化所得到的最佳酶解条件是由Lys-C （酶∶底物，1∶100）和胰酶（酶∶底物，1∶50）组合而成的顺序酶切。比较蛋白质组学研究共鉴定4 496个蛋白质，其中181个蛋白质为白癜风患者病变表皮中的差异表达蛋白。生物信息学分析表明差异表达蛋白主要与代谢、免疫、氧化还原和细胞黏附相关。其中119个上调蛋白主要参与角质化、转录、氧化应激及蛋白酶解等过程。62个下调蛋白主要参与细胞内物质运输、谷胱甘肽代谢和肌动蛋白细丝封端等过程。结论 比较蛋白质组学研究揭示了白癜风患者病变表皮与正常表皮之间主要存在角质化、免疫、脂质代谢...