广西巴马小型猪ABCA1基因真核表达载体的构建与鉴定

本研究目的是克隆广西巴马小型猪ABCA1基因CDs序列并构建真核表达载体。利用RT-PCR技术从广西巴马小型猪肝脏组织中扩增出ABCA1基因编码序列,直接插入至pEGFP-N1真核表达载体的KpnⅠ酶切位点,构建出重组质粒。之后将重组质粒pEGFP-N1-ABCA1转染PK15细胞,并于24 h、48 h后观察细胞荧光表达情况。收集转染48 h后的PK15细胞通过qRT-PCR检测ABCA1 mRNA相对表达量。结果表明:本实验成功构建了广西巴马小型猪ABCA1基因真核表达载体,重组质粒pEGFP-N1-ABCA1转染PK15细胞后,有绿色荧光蛋白表达,且与转染pEGFP-N1和空白组相比,pEGFP-N1-ABCA1转染组的ABCA1 mRNA表达量显著提高。本研究为下一步研究ABCA1基因的功能和调控及生产转ABCA1基因广西巴马小型猪奠定基础。     

广西巴马小型猪Glut4基因克隆和真核表达

葡萄糖转运蛋白4(Glut4)是调控肌肉葡萄糖代谢的关键因子。本研究旨在克隆广西巴马小型猪Glut4基因,构建真核表达载体,转染C2C12细胞,研究Glut4功能。以广西巴马小型猪背最长肌组织作为实验材料,通过RT-PCR技术扩增出Glut4基因编码序列,连接入PMD18-T克隆载体,测序鉴定正确后提取克隆质粒。用Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶双酶切克隆质粒,获得Glut4片段,连接至p EGFP-N1载体上,构建p EGFP-N1-Glut4表达载体,提取p EGFP-N1-Glut4重组质粒转染至C2C12细胞,观察细胞荧光表达情况,并检测转染24 h和48 h时培养液的葡萄糖水平。实验结果表明:广西巴马小型猪Glut4基因编码区序列长1 530 bp,编码509个氨基酸,与参考序列(序列号为EU590115.1)的同源性为99.7%;重组质粒转染C2C12细胞能表现出绿色荧光。转染24 h和48 h时,p EGFP-N1-Glut4组细胞培养液的葡萄糖浓度均显著低于空载体组(16.08±0.49 vs.17.13±0.13,4.93±0.19 vs.6.28±0.12,p0.01)。在C2C12成肌细胞中过表达广西巴马小型猪Glut4基因,能增加细胞的葡萄糖摄入量。     

广西巴马小型猪GK基因真核表达载体的构建及鉴定

GK基因在糖尿病的发生中具有重要功能,本研究旨在构建广西巴马小型猪GK基因真核表达载体,为生产转GK基因的广西巴马小型猪奠定一定基础。以广西巴马小型猪肝脏组织为材料,通过RT-PCR的方法扩增并克隆猪GK基因的编码序列,并进行生物信息学分析,并将GK基因亚克隆至p EGFP-N1载体上,构建含有GK基因的真核表达载体p EGFP-N1-GK,经过PCR和双酶切的验证,通过脂质体转染,将重组质粒p EGFP-N1-GK转染猪的PK15细胞,48 h之后通过荧光显微镜观察细胞荧光蛋白的表达。研究结果表明广西巴马小型猪GK基因编码区序列长1 575 bp长的片段,共编码524个氨基酸,与Pubmed中查询到的猪(FJ436399.1)的GK基因同源最高,序列比对发现,在461 bp和534 bp处都发生了C-T的碱基突变,只有461 bp位点的突变引起相应编码氨基酸的变化,成功构建p EGFP-N1-GK真核表达载体,并在PK15细胞中成功转录表达。为进一步研究葡萄糖激酶基因(GK)与糖尿病之间的关系,以及生产转GK基因的广西巴马小型猪奠定基础。     

广西巴马小型猪Neuritin基因克隆与生物信息学分析及真核表达载体的构建

本研究旨在通过克隆广西巴马小型猪的Neuritin基因并进行生物信息学分析,为后续对Neuritin的研究奠定基础。实验成功获得Neuritin基因的编码区序列,并对Neuritin基因编码区序列和预测蛋白序列进行分析。结果表明,广西巴马小型猪的Neuritin基因编码142个氨基酸,其中含有2个磷酸化位点和2个跨膜信号结构以及1个结构保守域。通过双酶切技术成功获得重组质粒pEGFP-N1-Neuritin并转染到N2a细胞中,在24 h拍照发现N2a细胞发出荧光,证明Neuritin真核表达载体构建成功。     

广西巴马小型猪TRβ1基因真核表达载体的构建及鉴定

本试验为了克隆广西巴马小型猪甲状腺激素受体β1(TRβ1)基因编码序列并构建该基因的真核表达载体,取广西巴马小型猪肝脏组织作为材料,采用RT-PCR技术扩增出TRβ1基因编码序列,与pMD19-T-Simple载体连接,测序正确的重组质粒双酶切后,连接pEGFP-N1载体,构建pEGFP-N1-TRβ1真核表达载体。经双酶切和测序鉴定后,重组质粒pEGFP-N1-TRβ1转染293T细胞,培养48 h后,在荧光显微镜下观察细胞荧光蛋白的表达情况。结果表明,本试验成功克隆了广西巴马小型猪的TRβ1基因cDNA序列,序列长度为1 368 bp,编码455个氨基酸,与参考序列的同源性为99.6%,有5处位点突变,且全为同义突变。阳性重组质粒pEGFP-N1-TRβ1转染293T细胞48 h后,在荧光显微镜下观测出绿色荧光表达。     

广西巴马小型猪miR-181b慢病毒表达载体的构建和鉴定

本试验旨在构建广西巴马小型猪miR-181b慢病毒表达载体,以广西巴马小型猪基因组DNA为模板,利用PCR扩增miR-181b前体序列,构建重组质粒p LV-miR-181b,经PCR和测序鉴定,阳性重组质粒转染C2C12细胞,荧光倒置显微镜下检测转染效率。结果显示,miR-181b前体序列长度为377 bp,与预期片段序列长度一致。将鉴定为阳性的miR-181b重组质粒转染C2C12细胞48 h后,在荧光显微镜下检测到较强的绿色荧光蛋白的表达,说明重组miR-181b质粒在C2C12细胞中具有较高的表达活性。本研究成功构建了具有高表达活性的miR-181b重组慢病毒表达载体,为研究miRNA-181b调控骨骼肌生长发育的功能机制提供实验基础。     

广西巴马小型猪α-1,3-半乳糖转移酶基因RNAi载体构建与检测

α-1,3-半乳糖转移酶基因(α-1,3 GT)在异种器官移植中的免疫排斥反应有重要的作用,本研究旨在构建α-1,3-半乳糖转移酶基因的干扰载体,在m RNA和蛋白质水平鉴定并筛选出干扰效果最佳的序列。根据巴马小型猪GGTA1基因CDS序列,设计合成3对特异性单链si RNA序列以及一对阴性序列,构建GGTA1 RNA干扰载体分别命名为p LLU2G-sh GGTA1-1、p LLU2G-sh GGTA1-2、p LLU2G-sh GGTA1-3和p LLU2G-sh GGTA1-NC。将构建好的载体分别转染转染PK15细胞,通过q RT-PCR和Western blot检测GGTA1 m RNA及其蛋白的相对表达量。结果显示本研究成功构建了3个重组RNAi表达载体,与转染p LLU2G-NC和空白组相比,p LLU2G-sh GGTA1-1、p LLU2G-sh GGTA1-2和p LLU2G-sh GGTA1-3转染组的GGTA1 m RNA和蛋白表达量均明显下降,对m RNA表达的抑制效率分别为85.02%、86.05%和83.85%。本研究成功获得有效抑制广西巴马小型猪GGTA1基因表达的RNAi载体,为下一步生产沉默GGTA1基因广西巴马小型猪奠定基础。     

广西巴马小型猪PGC-1α基因克隆与组织表达分析

目的克隆广西巴马小型猪PGC-1α基因编码区（CDS）序列,利用RT-PCR和QRT-PCR方法分析PGC-1αmRNA组织表达情况。方法本实验以广西巴马小型猪背最长肌cDNA为模版,PCR扩增PGC-1α基因CDS序列,将其连接至pEASY-T5载体,转染细菌、验证和序列测定;通过RT-PCR半定量和QRT-PCR实时荧光定量检测PGC-1α基因在小型猪多个组织中的表达情况。结果克隆获得广西巴马小型猪PGC-1α基因CDS序列,全长2391 bp,编码796个氨基酸,与参考序列的同源性为99.9%,两处碱基发生同义突变,分别是C-A1105和GA1524;PGC-1α基因在广西巴马小型猪心脏和肾脏中的表达丰度最高,其次是肝脏、皮下脂肪和背最长肌,而在胰腺中未检测到其表达。结论成功克隆了广西巴马小型猪PGC-1α基因编码区序列并进行了多种组织表达分析,为后续研究PGC-1α在小型猪2型糖尿病发生过程中作用途径打下基础。     

广西巴马小型猪miR-122慢病毒表达载体的构建及胚胎水平表达

本实验的目的在于构建PLV-miR-122慢病毒载体并在293T细胞和猪胚胎细胞中进行验证。以广西巴马小型猪基因组DNA为模板,克隆miR-122前体及部分侧翼序列,利用T4连接酶将其连入PLV-CMV-MCS-EF1载体,构建PLV-miR-122慢病毒载体。在293T细胞中过表达PLV-miR-122,通过胞质注射生产转PLV-miR-122的猪胚胎。双酶切和测序结果证明成功构建了PLV-miR-122重组载体,将重组载体转染293T细胞,经胞质注射后观察到其在猪胚胎早期和囊胚期均有绿色荧光表达。本实验成功构建了猪miR-122慢病毒表达载体,在293T细胞中过表达同时生产出转miR-122的阳性胚胎,为后续研究miR-122的功能奠定基础。     

猪ANK1新的可变剪接体功能预测、组织表达谱分析与真核表达载体构建

为进一步了解猪ANK1基因,本研究以广西巴马猪作为实验对象,分析ANK1基因结构与功能,并利用实时荧光定量PCR方法,分析ANK1基因在广西巴马小型猪11个不同组织(心脏,肝脏,脾脏,肺脏,肾脏,大肠,小肠,胰腺,皮下脂,胃,背最长肌)中的表达水平。组织表达谱分析结果表明ANK1基因在11个组织中均有表达,mRNA表达量表现为:胰腺心脏背最长肌胃大肠肝脏肾脏小肠脾脏肺脏脂肪。ANK1基因编码的蛋白通过生物信息学分析表明,编码156个氨基酸,存在跨膜结构和跨膜信号肽,分子量为17 799.27,理论等电点6.31,α螺旋和无规则卷曲所占比例比较大。通过酶切技术成功获得p EGFP-ANK1重组质粒并转染到C2C12细胞中,于48 h拍照发现细胞发出荧光,说明ANK1基因真核表达载体构建成功。     

广西巴马小型猪SLC30-A8基因克隆及组织表达差异分析

本研究的目的是克隆广西巴马小型猪SLC30-A8基因,并确定各组织的表达量。利用RT-PCR的方法扩增并克隆SLC30-A8基因;荧光定量PCR检测SLC30-A8基因在12月龄广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、小肠和脂肪中的表达。结果显示,成功克隆广西巴马小型猪SLC30-A8基因CDS区全长1 110 bp,荧光定量PCR结果显示SLC30-A8基因在12月龄广西巴马小型猪胰腺组织中表达量最高,其次是心脏、脾脏,在肺脏、小肠以及脂肪组织中几乎不表达。本研究成功克隆了广西巴马小型猪SLC30-A8基因并确定在胰腺组织中表达最高。该研究将为下一步研究SLC30-A8基因在糖尿病的发生过程中对糖代谢的作用奠定基础。     

广西巴马小型猪SAP真核表达载体的构建及胚胎水平表达

本研究的目的是构建广西巴马小型猪SAP真核表达载体并在胚胎水平对其进行验证。利用RT-PCR技术扩增并克隆SAP基因,再用T4连接酶将其连入P-Dsred-N1载体,构建P-Dsred-N1-SAP载体,并通过胞质注射生产转SAP的猪胚胎。结果表明,本研究成功构建了P-Dsred-N1-SAP重组载体,经胞质注射后在胚胎发育早期和囊胚期均有红色荧光表达。本研究为下一步研究SAP基因的功能和生产转SAP基因猪奠定基础。     

广西巴马小型猪miR-423-5p基因慢病毒载体构建和鉴定及其在骨骼肌中的表达

本试验的目的在于检测广西巴马小型猪骨骼肌中mi R-423-5p基因的表达情况及构建p LV-mi R-423-5p慢病毒载体并在C2C12细胞中进行验证。通过q RT-PCR方法检测背最长肌中mi R-423-5p的表达,设计特异性引物对mi R-423-5p基因的前体序列进行扩增并定向克隆到慢病毒载体p LV-CMV-mcs-3xflag-EF1-GFP(p LV)上,鉴定正确的重组质粒用脂质体转染法转染进C2C12细胞,q RT-PCR检测mi R-423-5p的表达情况。结果表明广西巴马小型猪背最长肌中mi R-423-5p的表达水平随着月龄的增长而不断上升,同时成功构建了p LV-mi R-423-5p慢病毒载体。该项研究为进一步寻找mi R-423-5p基因调控骨骼肌生长发育的机制提供理论基础,对肉质性状分子改良提供有益的线索。     

猪miR-486慢病毒表达载体的构建及鉴定

mi R-486在肌肉生长发育和肌肉疾病的发生中具有重要的功能,本研究旨在构建猪mi R-486慢病毒表达载体,鉴定其在巴马小型猪成纤维细胞中过表达水平,并利用胞质注射生产转基因胚胎,为研究mi R-486在肌肉生长发育中的功能奠定基础。以巴马小型猪基因组DNA为模板,扩增mi R-486前体及部分侧翼序列,利用T4连接酶将其连入p CDH-CMV-MCS-EF1载体,构建LV-mi R-486慢病毒表达载体;在巴马小型猪成纤维细胞中过表达mi R-486并利用Real-time PCR验证其过表达效率,通过胞质注射生产转mi R-486的猪胚胎。双酶切和测序结果证明成功构建了LV-mi R-486重组载体,将慢病毒载体转染巴马小型猪成纤维细胞后mi R-486上调,经胞质注射后在胚胎发育早期和囊胚期均有绿色荧光表达。本研究成功构建了猪mi R-486慢病毒表达载体,在巴马小型猪成纤维细胞中过表达并生产出转mi R-486的阳性胚胎,为后续研究mi R-486的功能奠定基础。     

小鼠DLL1真核表达载体的构建及其在肿瘤细胞中的表达

目的：构建带绿色荧光蛋白的小鼠DLL1全长基因真核表达载体,并在肿瘤细胞中表达。方法：利用PCR特异性引物扩增出DLL1基因全长,将克隆的基因片段插入带绿色荧光蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP质粒中。然后利用脂质体将重组质粒pIRES2-EGFP-DLL1转染进小鼠B16黑色素瘤细胞中,并通过G418筛选后选取生长良好、荧光强度高的三株单克隆进行mRNA水平DLL1表达的鉴定。结果：成功扩增小鼠DLL1的全长基因。克隆入质粒载体后,通过DNA序列测定证实其序列正确。将构建的pIRES2-EGFP-DLL1质粒转染小鼠B16黑色素瘤细胞,经过G418筛选和荧光显微镜观察后,挑选得到GFP阳性率90%以上的稳定转染细胞株。RT-PCR检测稳定转染细胞的mDLL1的表达显著增加,进一步证实了pIRES2-EGFP-DLL1的表达效能。结论：成功构建了小鼠DLL1基因的真核表达质粒,证实其在真核细胞B16中可以表达。     

小鼠DLL1真核表达载体的构建及其在肿瘤细胞中的表达

目的:构建带绿色荧光蛋白的小鼠DLL1全长基因真核表达载体,并在肿瘤细胞中表达。方法:利用PCR特异性引物扩增出DLL1基因全长,将克隆的基因片段插入带绿色荧光蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP质粒中。然后利用脂质体将重组质粒pIRES2-EGFP-DLL1转染进小鼠B16黑色素瘤细胞中,并通过G418筛选后选取生长良好、荧光强度高的三株单克隆进行mRNA水平DLL1表达的鉴定。结果:成功扩增小鼠DLL1的全长基因。克隆入质粒载体后,通过DNA序列测定证实其序列正确。将构建的pIRES2-EGFP-DLL1质粒转染小鼠B16黑色素瘤细胞,经过G418筛选和荧光显微镜观察后,挑选得到GFP阳性率90%以上的稳定转染细胞株。RT-PCR检测稳定转染细胞的mDLL1的表达显著增加,进一步证实了pIRES2-EGFP-DLL1的表达效能。结论:成功构建了小鼠DLL1基因的真核表达质粒,证实其在真核细胞B16中可以表达。     

人Notch受体胞内区基因N2ICD和N3ICD克隆及真核表达体系的构建

Notch信号通路与多种肿瘤的发生发展密切相关。对该通路中各受体功能的深入研究能够为揭示其致癌作用奠定基础。本研究采用RT-PCR的方法从人宫颈癌细胞系HeLa细胞的cDNA中克隆人Notch2和Notch3受体胞内区基因(N2ICD和N3ICD基因),并构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体N2ICD/pEGFP和N3ICD/pEGFP,将序列正确的重组质粒转染HeLa细胞,显微镜下可见明显的绿色荧光,并定位在细胞核内。Western blotting检测目的蛋白成功融合表达,并能够提高其下游靶基因Hes1的转录活性。     

2A肽介导猪PID1与CuZnSOD双基因真核共表达载体的构建与细胞表达

构建PID1基因与CuZnSOD基因的真核共表达载体,在PK15细胞中鉴定基因的表达。PCR扩增的PID1与CuZnSOD两基因分别经双酶切后定向插入pIRES2-AcGFP1空载体,构建pIRES2-CuZnSOD-PID1真核双表达载体并进行测序与酶切鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒转染至PK15细胞,细胞内荧光显微镜下观察其荧光的表达,RT-PCR、Westernblot技术分别检测PID1基因与CuZnSOD基因mRNA和蛋白表达情况。重组克隆载体插入目的片段序列与PID1基因与CuZnSOD基因序列完全一致。PIRES2-CuZnSOD-PID1真核双表达载体测序、酶切鉴定结果与预期结果一致。荧光显微镜下观察转染后的PK15细胞出现绿色荧光。RT-PCR检测结果显示,转染细胞中PID1基因与CuZnSOD基因表达量明显高于对照组（P〈0.05）。Westernblot检测结果表明pIRES2-CuZnSODPID1真核双表达载体稳定有效表达。成功构建pIRES2-CuZnSOD-PID1真核共表达载体,且双基因在真核细胞独立稳定表达,为转基因猪等育种新材料的制备奠定基础。     

荷包猪SLA-2-HB01真核表达载体的构建及在PK15细胞中的表达

为构建荷包猪SLA-2-HB01真核细胞表达载体,观察其在PK15细胞中的表达情况。首先参考SLA-2-HB01基因编码区序列设计了引物对,以SLA-2-HB01-pMD 18-T为模板PCR扩增获得SLA-2-HB01编码区基因片段,经TA克隆及菌落PCR筛选得到阳性克隆菌。测序正确后大量双酶切回收目的基因片段并与真核表达载体pEGFP N3相连接获得重组质粒SLA-2-HB01/pEGFP N3,重组质粒转化至大肠杆菌经大量克隆后,抽提阳性重组质粒并通过脂质体介导转染至PK15细胞,通过荧光显微镜观察转染后PK15细胞的荧光强度,进一步通过Western Blotting检测PK15细胞中SLA-2-HB01蛋白的表达情况。结果显示PCR成功扩增得到SLA-2-HB01,大小为1 104 bp,并成功构建重组质粒SLA-2-HB01/pEGFP N3,酶切鉴定证实插入片段大小为1 092 bp。SLA-2-HB01/pEGFP N3重组质粒转染PK15细胞后具有绿色荧光,Western Blotting显示SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白分子量大小为70 kD,与理论值相符。成功构建了SLA-2-HB01/pEGFP N3重组质粒,并初步确认SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白成功在PK15细胞中表达,为下一步进行SLA-2-HB01递呈多肽表位的研究奠定基础。     

GFP-LC3B真核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建人自噬相关基因LC3B的真核表达载体p EGFP-C1-LC3B,并鉴定其表达。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增LC3B全长基因,将其克隆至p EGFP-C1表达载体,得到p EGFP-C1-LC3B重组质粒,酶切和测序鉴定后,转染ZR75-1细胞,Western印迹检测真核细胞中GFP-LC3B融合蛋白的表达,用倒置荧光显微镜观察自噬诱导剂雷帕霉素处理和未处理ZR75-1细胞质中GFP-LC3B的分布。结果:Western印迹可见GFP-LC3B融合蛋白表达条带;在荧光显微镜下,ZR75-1细胞内可见绿色荧光,雷帕霉素刺激后有明显绿色荧光聚集体形成。结论:人自噬相关基因LC3B的真核表达载体p EGFP-C1-LC3B构建成功,为进一步研究自噬在乳腺癌细胞中的作用机制奠定了基础。