Epsps基因为筛选标记的多基因抗虫表达载体构建

目的:为了获得水稻的广谱抗虫性,同时也避免由潮霉素抗性基因引起的安全性问题.构建以抗除草剂基因(Epsps 基因)为筛选标记的多基因抗虫植物表达载体 pCTSK.方法:以双元载体pCAMBIA1300为基础,将潮霉素抗性基因hpt替换成携带烟草叶绿体转运肽序列TSP的草甘膦抗性突变基因aroAM12(编码细菌5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶Epsps)作为筛选标记基因,获得中间表达载体pCISM1300.然后再连接上3个抗虫基因(马铃薯蛋白酶抑制剂基因Pin-Ⅱ、苏云金杆菌毒蛋白基因Bt cryI(A)及雪花莲外源凝集素基因 CNA)的完整表达片段(包含各自的启动子和终止子).结果:通过PCR方法和酶切方法鉴定已成功地构建了该表达载体;通过不同实验方案的数据分析,得出在载体构建的大分子连接中优化的一次连接法连接效率高于二次连接法的结论.     

黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶基因的植物表达载体构建

目的:构建除草剂抗性基因黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶的植物表达载体.方法:通过PCR从重组质粒pGWB2/Cjhppd中扩增出大小为1 300bp的目的片段,亚克隆到pGEM-T easy上.BamHⅠ和SpeⅠ双酶切pGEM-T Easy/Cjhppd和质粒pCambia1301,回收得到1 300bp的Cjhppd基因片段和开环质粒pCambia-1301-UbiN,用T4连接酶连接,得到重组质粒,利用三亲法将其导入农杆菌EHA105 中.结果:成功得到农杆菌EHA105的阳性菌落,菌落PCR扩增得到和预期大小一致的1 300bpDNA片段.结论:成功将具有除草剂抗性的Cjhppd构建到了含有玉米泛素启动子Ubi和选择性标记基因Hpt的植物表达载体pCambia-1301-UbiN/Cjhppd,并导入根癌农杆菌EHA105中,可以用于水稻等单子叶植物的遗传转化.     

酵母高效克隆表达T载体pYES2-T的构建及应用

为了在酵母中高通量、高效率地对外源基因进行克隆和表达,本研究以酵母表达载体pYES2为基础,构建高效克隆表达T载体。pYES2是酿酒酵母的一种高效表达载体,在其多克隆位点处设计插入XcmⅠ-Intron-XcmⅠ片段,同时将其载体中URA3基因中原有的XcmⅠ酶切位点进行定点突变,构建出pYES2-T酿酒酵母高效表达T载体。利用XcmⅠ酶切载体pYES2-T,使其产生两个突出的T末端,一方面可以通过PCR产物加A的方式直接进行TA克隆;另一方面可在半乳糖诱导启动子的调控下,对TA克隆后的外源基因在酵母中诱导表达。利用该系统高通量地对人工合成耐盐系列基因NLEAs进行筛选,研究结果表明,该系统可以在酿酒酵母中一步式完成片段克隆及耐盐基因的筛选。本研究构建的酵母表达T载体使用方便、效率高、成本低,应用前景广阔。     

菘蓝APX基因克隆及序列分析

为进一步研究菘蓝APX基因的功能,构建了菘蓝APX基因真核表达载体。从菘蓝植株中提取总RNA,逆转录为cDNA,根据APX基因在该类植物中的同源性设计简并引物,利用PCR方法钓取目的基因,将目的基因与T载体连接,PCR检测阳性克隆,同时菌液送往测序公司进行测序。结果表明:测序片段的生物信息学分析证实了该序列与GenBank登录的APX基因一致。说明成功构建了菘蓝APX重组质粒和克隆鉴定了菘蓝APX基因,可进一步用于基因表达和表达产物的功能研究。     

用于植物基因表达载体构建的质粒改造及其应用

为克服目前常用于植物基因表达载体构建的质粒所具有的酶切位点有限,目的基因片段难于插入和连接,缺少植物基因表达所必须的启动子、终止子、筛选标记等功能元件的缺点,本研究构建了一个用于植物基因表达载体构建的质粒载体pNULPGE200。该质粒载体引入了植物基因表达最常用的CaMV 35S启动子(cauliflower mosaic virus 35S promoter)和NOS终止子(nopaline synthase terminator),以及之间的多克隆酶切位点MCS(multiple cloning site)。利用pNULPGE200构建植物基因表达载体,经PCR等方法克隆得到的目的基因可以直接连接到35S启动子与NOS终止子之间,使目的基因能够在植物体内稳定表达;同时该质粒载体还具有独立表达的卡那霉素NPT Ⅱ(neomycin phosphotransferase Ⅱ)耐性基因和sGFP(synthetic green-fluorescent protein with S65T mutation)绿色荧光蛋白报告基因,可用于基因转化时的筛选。本研究以假单胞菌(Pseudomonas putida)携带质粒的二甲苯单加氧酶(xylene monooxygenase)编码基因为材料,分别利用本文质粒载体和常规的质粒载体pBI121构建了植物表达载体,验证了文中质粒载体的实用性。     

Cloning and identification of APX gene from Isatis indigotica

为进一步研究菘蓝APX基因的功能,构建了菘蓝APX基因真核表达载体.从菘蓝植株中提取总RNA,逆转录为cDNA,根据APX基因在该类植物中的同源性设计简并引物,利用PCR方法钓取目的基因,将目的基因与T载体连接,PCR检测阳性克隆,同时菌液送往测序公司进行测序.结果表明:测序片段的生物信息学分析证实了该序列与GenBank登录的APX基因一致.说明成功构建了菘蓝APX重组质粒和克隆鉴定了菘蓝APX基因,可进一步用于基因表达和表达产物的功能研究.     

短发夹RNA载体稳定抑制端粒相关蛋白TERF2IP1表达的HCT116细胞的构建

目的:构建针对TERF2IP1基因的短发夹RNA(sh RNA)表达载体,在HCT116细胞中鉴定该载体对TERF2IP1基因的干扰效果。方法:设计针对TERF2IP1基因的sh RNA序列,将其克隆至p GPHI/Hygro载体中,瞬时转染HCT116细胞48 h后,用400 mg/m L的潮霉素筛选抗性克隆,获得阳性单克隆细胞株;分别提取细胞总RNA和蛋白,进行RT-PCR和Western印迹,检测TERF2IP1的表达水平。结果:构建了4对针对TERF2IP1基因的sh RNA表达载体,通过潮霉素筛选获得稳定干扰TERF2IP1基因的HCT116细胞系,实时定量PCR和Western印迹实验均证实潮霉素筛选后,HCT116细胞中TERF2IP1的表达水平明显降低。结论:构建了4对人TERF2IP1基因的sh RNA表达载体,获得4株分别针对TERF2IP1基因不同位点的稳定干扰HCT116细胞株。     

基于XcmⅠ的T载体及其在合成生物学中的应用

为了节约成本和提高实验效率,以商用p MD18-T载体为基础,构建获得了p FL-XS-T载体,其具有符合Biobrick标准的串联XbaⅠ-XcmⅠ-XcmⅠ-SpeⅠ克隆序列,通过对XcmⅠ的酶切处理即可以通过TA克隆方便地克隆PCR片段。克隆验证实验结果表明,经XcmⅠ处理的该载体可以与PCR片段进行TA连接,连接效率及阳性率均可以满足实验室要求并且可以得到Biobrick标准质粒。此外,该载体不仅可以与其余Biobrick标准元件进行串联,还可以作为功能DNA元件的筛选载体。     

使用与Gateway技术兼容的T载体获得入门克隆

与Gateway技术兼容的农杆菌双元载体系统已开始应用于植物功能基因组的研究,但应用这些载体系统的一个瓶颈问题,是如何简单、经济和高效地将PCR产物或其他来源的目的DNA片段构建到入门载体上获得入门克隆.为此,将传统的TA克隆技术与Gateway重组克隆技术进行整合,构建了与Gateway技术兼容的两种TA克隆载体,用于在克隆PCR产物或其他来源的目的DNA片段的同时获得入门克隆.利用兼容Gateway技术的TA克隆载体有效地解决了上述瓶颈问题.     

农杆菌介导凝乳酶基因转化黑曲霉载体的构建

目的:研究针对黑曲霉中高表达的糖化酶基因( glaA)位点,构建含有潮霉素抗性的农杆菌介导的牛凝乳酶基因转化黑曲霉基因置换载体,并在潮霉素基因两端设计了正向重复序列,使在后续的研究中消除抗性基因成为可能.方法:将glaA上游( Gla5)和下游(Gla3)片段作为同源臂,通过重叠延伸PCR技术连接在Cym基因两端构成GlaA5-Cym-GlaA3( CYM)片段,并在潮霉素基因下游引入与Cym基因下游方向相同的Gla3,通过中间载体获得GlaA5-Cym-GlaA3-hph-Gla3结构.结果:将上述结构克隆至在T-DNA区内只含有多克隆位点的Ti质粒载体pSZA,经过酶切鉴定,成功获得载体pSZH-CYM.     

中国水仙NtSAMT基因的克隆及转化金鱼藤

本研究以中国水仙花瓣总RNA为模板进行反转录PCR,扩增得到与预期大小相同的PCR产物带,回收反转录PCR产物,将其与p EASY-T1克隆载体连接并导入大肠杆菌DH5α进行克隆,经菌落PCR和双酶切鉴定,筛选带有目的基因的重组质粒并进行测序。测序结果表明中国水仙花香基因SAMT c DNA的ORF片段1 131 bp编码376个氨基酸残基,与已报导的中国水仙SAMT(JX273470)的同源性为99.2%。将目的基因片段与PBI121表达载体连接,并利用农杆菌介导法将Nt SAMT基因转化到金鱼藤(Asarina procumbens)中,以金鱼藤无菌苗茎段为遗传转化外植体,通过抗性筛选获得12株转化植株,对获得的12株疑似转基因植株进行PCR检测,其中有8株呈阳性;通过RT-PCR检测得到的阳性植株,其中有5株呈阳性。检测结果表明,该研究成功克隆水仙花Nt SAMT基因并在金鱼藤植物中得到表达。     

野生罂粟RNAi表达载体的构建及遗传转化

通过PCR方法从质粒pGEM-bc中克隆野生罂粟BBE-COR融合基因片段约760 bp,以pHANNIBAL和植物表达载体pCAMBIA3300为基础,将克隆到的BBE-COR融合基因正向和反向片段分别插入pdk内含子的两边,经酶切、PCR鉴定及序列分析表明,特异性RNAi表达载体p3300-pHR构建成功.采用直接转化法,将重组子导入根癌农杆茵AGL1中.以野生罂粟茎尖生长点为转化受体,用农杆茵介导法将目的基因转入野生罂粟中.经卡那霉素和除草剂筛选后,共获得53株转基因植株,PCR检测后,其中14株表现阳性,可初步确定目的基因已经整合到野生罂粟基因组中.     

鞘蕊苏贝壳杉烯酸氧化酶基因的克隆及表达载体的构建

为提高鞘蕊苏有效成分的含量,开展Coleus Ent-kaurenoic acid oxidase(KAO)基因的克隆以及表达载体构建方面的研究。提取鞘蕊苏叶片的总RNA,利用套式PCR技术克隆获得KAO基因全长,将该基因连接到克隆载体p MD-18T,经测序鉴定正确后,再将该基因连接到p ET-28a表达载体中。结果显示,成功克隆出的鞘蕊苏KAO基因大小为1 500 bp,对克隆基因进行测序及酶切鉴定,均得到正确大小的DNA片段,说明表达载体构建成功。本研究成功克隆得到鞘蕊苏贝壳杉烯酸氧化酶基因并构建其表达载体,为提高鞘蕊苏有效成分含量提供了基础。     

深海真菌Dichotomomyces cejpii胶霉毒素生物合成基因启动子的克隆和功能鉴定

利用染色体步移技术对深海真菌Dichotomomyces cejpii中胶霉毒素的生物合成基因Gli G、Gli I和Gli O启动子进行克隆,并将其核心区域导入p GL3-basic荧光素酶报告基因载体,通过荧光强度分析发现Gli G的启动子转录活性最强。进一步将Gli G启动子核心区域导入含潮霉素抗性标记的p AN7-1载体,以替换原有启动子pgpd A,并将重组质粒导入酿酒酵母,用潮霉素抗性平板进行筛选,发现Gli G启动子能在酿酒酵母中启动潮霉素抗性基因的表达。     

可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体

从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体（毕赤酵母表达型T载体）。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片断的上游含XhoⅠ和Eam1105Ⅰ酶切位点,下游含Eam1105Ⅰ和XbaⅠ酶切位点。通过XhoⅠ和XbaⅠ位点将扩增产物与质粒pPICZαA连接形成重组质粒。用Eam1105Ⅰ酶切重组质粒,回收大片段即得到毕赤酵母表达型T载体pPICZαT。使用该表达型T载体进行了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因（cbh2）的克隆和在巴氏毕赤酵母中的表达。结果表明,使用表达型T载体可以直接克隆PCR产物,而且可以使外源基因在毕赤酵母中成功表达。另一方面,使用该载体时不需要使用限制性内切酶,从而可以避免在所表达蛋白的N-末端引入多余的氨基酸。     

拟南芥NPR1基因的克隆与表达载体的构建

NPR1基因为植物抗病基因表达和系统获得性抗性中的一个关键基因。该文以DNA PCR扩增的方法,从拟南芥基因组DNA中克隆出NPR1基因,通过序列分析,所克隆的 NPR1 基因与报道的基因序列完全一致。将其构建成植物表达载体,为今后植物抗病基因工程的开展奠定了基础。     

大白菜抗软腐病基因BrWRKY33植物表达载体的构建

利用农杆菌侵染法获得抗软腐病转BrWRKY33基因大白菜,首先要构建植物表达载体。本实验根据BrWRKY33基因的序列及pROK2表达载体的酶切位点设计引物(FN/RN),获得BrWRKY33基因,然后将该基因连接到克隆载体pGEM-TEasy,重新构建了克隆载体T-WRKY。经测序及酶切验证,选取PCR反应中错配率最低的产物,构建了表达载体pROK2-WRKY,并将该表达载体转入到根癌农杆菌EHA105中,并对其转化子进行了鉴定。结果表明,PCR扩增获得目的基因BrWRKY33全长约1443bp,PCR及酶切结果鉴定表明克隆载体T-WRKY已经重新构建成功。表达载体的PCR及BamHⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定表明有4个重组子表现阳性,表明目的基因已经插入到pROK2表达载体,表达载体构建成功。PCR鉴定表明表达载体pROK2-WRKY已经转入根癌农杆菌EHA105中。本实验结果将为进一步研究大白菜抗软腐病基因的转化奠定基础。     

黑曲霉pepD基因阻断突变菌株的构建及功能分析

运用同源重组技术破坏了黑曲霉基因组中的pepD基因,该基因编码一种类subtilisin的胞外蛋白酶PEPD。实验以黑曲霉GICC2773基因组DNA为模板,PCR扩增pepD基因,并在此基因中间插入潮霉素抗性基因(hph)表达单元,由此产生了3.7kb的pepD阻断基因片段。将此阻断基因片段与载体pBS连接,构建成pepD基因阻断质粒pBSDH。采用原生质体-CaCl2/PEG法将酶切阻断质粒得到的含pepD基因和hph表达单元的3.7kb线性片段转化AspergillusnigerGICC2773菌株,在含潮霉素的平板上筛选潮霉素抗性转化子,从这些抗性转化子中经PCR检测分离到到1个pepD基因阻断突变菌株?pepD66。外源漆酶分泌活性分析显示,黑曲霉pepD基因的破坏使其外源漆酶的分泌表达有所提高。