广西巴马小型猪小RNA启动子U6和7SK的克隆及功能验证

为了探讨巴马小型猪启动子U6和7SK的功能以及为生产GGTA1基因沉默的广西巴马小型猪奠定基础,文章克隆并分析了siRNA启动子U6和7SK,并分别连接pMD18-shEGFP载体,分别与PEGFP-N1共转猪肾细胞,进行RNAi实验。以pMD18-hU6-shEGFP为阳性对照,无启动子的pMD18-shEGFP载体为阴性对照,单独转染PEGFP-N1为第一组空白对照,以ddH2O替代质粒为第二组空白对照组,验证这两种启动子在猪细胞中的功能。结果表明:广西巴马小型猪RNA聚合酶III型siRNA启动子U6和7SK的序列全长分别为553 bp和437bp。成功构建了pMD18-pU6-shEGFP和pMD18-p7SK-shEGFP干扰载体,转染猪源PK-15细胞,证明U6以及7SK两个启动子具有较高的siRNA表达活性,可以用于α-1,3半乳糖转移酶等猪源基因的沉默实验。     

利用启动子缺陷型打靶载体敲除五指山小型猪GGTA1基因

目的:获得α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)基因敲除的五指山小型猪胎儿,为异种器官移植研究提供基础平台。方法:以新霉素磷酸转移酶基因(neo)为筛选标记基因构建启动子缺陷型打靶载体,打靶载体线性化后用电转染法将其导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞经G418筛选后,用PCR法检测药物抗性的细胞克隆,对阳性细胞进行核移植构建重构胚胎及胚胎移植。结果:转染后,经筛选共得到176个具有G418抗性的细胞克隆,经PCR检测,其中2个细胞克隆发生了同源重组;以其中1个GGTA1+/-细胞克隆为供体细胞进行核移植,将重构胚移植到2头自然发情的受体母猪中,1头受体妊娠;第37 d将代孕母猪处死,获得2个胎儿,经PCR和Southern印迹鉴定,均为GGTA1单等位基因敲除胎儿。结论:构建了五指山小型猪GGTA1基因部分外显子4区域敲除的启动子缺陷型打靶载体,获得了GGTA1单等位基因敲除的胎儿,为培育GGTA1基因敲除的五指山小型猪奠定了基础。     

猪α-1,3-半乳糖转移酶基因打靶载体的构建

目的:构建猪α-1,3-半乳糖转移酶(GGTA1)基因的正负筛选打靶载体。方法:以原代猪胚胎成纤维细胞基因组DNA为模板,采用长程PCR方法扩增出GGTA1基因的2条片段;以长约2kb包含部分第9外显子的片段为同源短臂,在XbaⅠ和ClaⅠ位点插入pLoxP质粒正筛选标记neo基因的3'端;以长约5.4kb包括部分第8外显子、全部第8内含子及部分第9外显子的片段为同源长臂,于NotⅠ位点插入该质粒中neo基因的5'端;2.7kb的负筛选标记tk基因位于载体中同源短臂的3'端外侧。结果与结论:酶切、PCR及测序结果表明,同源臂被正确连接至质粒pLoxP,成功构建了猪GGTA1基因正负筛选打靶载体pSL/GT。     

广西巴马小型猪GK基因真核表达载体的构建及鉴定

GK基因在糖尿病的发生中具有重要功能,本研究旨在构建广西巴马小型猪GK基因真核表达载体,为生产转GK基因的广西巴马小型猪奠定一定基础。以广西巴马小型猪肝脏组织为材料,通过RT-PCR的方法扩增并克隆猪GK基因的编码序列,并进行生物信息学分析,并将GK基因亚克隆至p EGFP-N1载体上,构建含有GK基因的真核表达载体p EGFP-N1-GK,经过PCR和双酶切的验证,通过脂质体转染,将重组质粒p EGFP-N1-GK转染猪的PK15细胞,48 h之后通过荧光显微镜观察细胞荧光蛋白的表达。研究结果表明广西巴马小型猪GK基因编码区序列长1 575 bp长的片段,共编码524个氨基酸,与Pubmed中查询到的猪(FJ436399.1)的GK基因同源最高,序列比对发现,在461 bp和534 bp处都发生了C-T的碱基突变,只有461 bp位点的突变引起相应编码氨基酸的变化,成功构建p EGFP-N1-GK真核表达载体,并在PK15细胞中成功转录表达。为进一步研究葡萄糖激酶基因(GK)与糖尿病之间的关系,以及生产转GK基因的广西巴马小型猪奠定基础。     

FUT8基因RNAi慢病毒载体的构建及对MCF-7细胞增殖的影响

旨在构建FUT8基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并观察其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。针对FUT8基因设计3组短发夹RNA序列,退火合成双链DNA,通过连接线性化的p GC-LV-GFP载体,构建mi RNA慢病毒载体质粒,并将其转化至感受态细胞DH5α;测序验证正确后进行FUT8基因慢病毒载体的包装及病毒滴度测定,将获得的重组慢病毒p GC-sh FUT8转染MCF-7细胞,利用Real time-PCR、Western blot分别验证转染后MCF-7细胞中FUT8 m RNA及蛋白的表达,MTT法及克隆形成实验检测sh FUT8对MCF-7细胞增殖能力的影响。测序证实成功构建针对FUT8基因的RNAi慢病毒载体;慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒悬液滴度5×108 TU/m L;荧光显微镜下观察各转染组细胞GFP的表达,转染效率达90%以上;Real-time PCR、Western blot结果显示干扰组FUT8的m RNA及蛋白表达水平较对照组显著降低,其中p GC-sh FUT8-2序列对FUT8基因的干扰效率可达80%,干扰效果最佳,FUT8沉默后MCF-7细胞增殖能力下降。     

广西巴马小型猪Presenilin-2基因真核表达载体的构建及其在小鼠N2a细胞中的表达验证

本研究的目的是构建广西巴马小型猪Presenilin-2真核表达载体并在细胞水平对其进行验证。利用RT-PCR的方法扩增并克隆Presenilin-2基因,再将Presenilin-2亚克隆到p EGFP-N1,通过脂质体转染方法将p EGFP-PS2-N1转至N2a细胞,48 h后在荧光显微镜下观察细胞是否表达绿色荧光蛋白。结果显示,本研究成功构建了阅读框架正确的广西巴马小型猪Presenilin-2基因真核表达载体,转染p EGFP-PS2-N1后,N2a细胞有绿色荧光蛋白的表达。该研究将为下一步研究Presenilin-2基因的功能和生产转Presenilin-2基因猪奠定基础。     

广西巴马小型猪miR-423-5p基因慢病毒载体构建和鉴定及其在骨骼肌中的表达

本试验的目的在于检测广西巴马小型猪骨骼肌中mi R-423-5p基因的表达情况及构建p LV-mi R-423-5p慢病毒载体并在C2C12细胞中进行验证。通过q RT-PCR方法检测背最长肌中mi R-423-5p的表达,设计特异性引物对mi R-423-5p基因的前体序列进行扩增并定向克隆到慢病毒载体p LV-CMV-mcs-3xflag-EF1-GFP(p LV)上,鉴定正确的重组质粒用脂质体转染法转染进C2C12细胞,q RT-PCR检测mi R-423-5p的表达情况。结果表明广西巴马小型猪背最长肌中mi R-423-5p的表达水平随着月龄的增长而不断上升,同时成功构建了p LV-mi R-423-5p慢病毒载体。该项研究为进一步寻找mi R-423-5p基因调控骨骼肌生长发育的机制提供理论基础,对肉质性状分子改良提供有益的线索。     

广西巴马小型猪PGC-1α基因克隆与组织表达分析

目的克隆广西巴马小型猪PGC-1α基因编码区（CDS）序列,利用RT-PCR和QRT-PCR方法分析PGC-1αmRNA组织表达情况。方法本实验以广西巴马小型猪背最长肌cDNA为模版,PCR扩增PGC-1α基因CDS序列,将其连接至pEASY-T5载体,转染细菌、验证和序列测定;通过RT-PCR半定量和QRT-PCR实时荧光定量检测PGC-1α基因在小型猪多个组织中的表达情况。结果克隆获得广西巴马小型猪PGC-1α基因CDS序列,全长2391 bp,编码796个氨基酸,与参考序列的同源性为99.9%,两处碱基发生同义突变,分别是C-A1105和GA1524;PGC-1α基因在广西巴马小型猪心脏和肾脏中的表达丰度最高,其次是肝脏、皮下脂肪和背最长肌,而在胰腺中未检测到其表达。结论成功克隆了广西巴马小型猪PGC-1α基因编码区序列并进行了多种组织表达分析,为后续研究PGC-1α在小型猪2型糖尿病发生过程中作用途径打下基础。     

反义RNA对猪α-1,3-半乳糖苷转移酶活性的影响

 α 1,3 半乳糖表位是猪 人异种移植超急性排斥反应的主要抗原 ,由α 1,3 半乳糖苷转移酶催化合成 .用RT PCR方法扩增中国实验用小型猪α 1,3 半乳糖苷转移酶cDNA的前 582bp ,测定碱基序列并构建其反义表达载体pLXRN ,将其转染入猪主动脉内皮细胞 .NorthernBlotting表明α 1,3 半乳糖苷转移酶mRNA减少 .检测α 1,3 半乳糖苷转移酶活性表明 ,反义RNA可使其活性下降32 2 % .研究结果表明可能通过反义RNA来抑制猪 人异种移植超急性排斥反应     

广西巴马小型猪ABCA1基因真核表达载体的构建与鉴定

本研究目的是克隆广西巴马小型猪ABCA1基因CDs序列并构建真核表达载体。利用RT-PCR技术从广西巴马小型猪肝脏组织中扩增出ABCA1基因编码序列,直接插入至pEGFP-N1真核表达载体的KpnⅠ酶切位点,构建出重组质粒。之后将重组质粒pEGFP-N1-ABCA1转染PK15细胞,并于24 h、48 h后观察细胞荧光表达情况。收集转染48 h后的PK15细胞通过qRT-PCR检测ABCA1 mRNA相对表达量。结果表明:本实验成功构建了广西巴马小型猪ABCA1基因真核表达载体,重组质粒pEGFP-N1-ABCA1转染PK15细胞后,有绿色荧光蛋白表达,且与转染pEGFP-N1和空白组相比,pEGFP-N1-ABCA1转染组的ABCA1 mRNA表达量显著提高。本研究为下一步研究ABCA1基因的功能和调控及生产转ABCA1基因广西巴马小型猪奠定基础。     

RNA干扰沉默低氧诱导因子-1α对低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

本研究应用基因克隆技术,将合成的发卡样特异性低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1alpha,HIF-1α）干扰寡核苷酸（siRNA）序列插入真核表达载体中,构建出特异性HIF-1α基因RNA干扰（RNAi）真核表达载体。采用组织块种植法,原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs）,将构建出的特异性HIF-1αRNAi真核表达载体转染到PASMCs;分别在常氧和低氧下进行细胞培养,采用RT-PCR检测PASMCsHIF-1αmRNA表达水平,用MTT和流式细胞仪检测细胞增殖水平,探讨低氧条件下HIF-1αRNAi真核表达载体对PASMCs增殖的影响。结果表明,低氧培养48h后,正常PASMCs和转染了HIF-1αsiRNA阴性表达载体的细胞增殖显著,HIF-1αmRNA表达水平也显著升高;而转染了HIF-1αsiRNA阳性表达质粒的细胞增殖不显著,HIF-1αmRNA表达水平较低。结果提示：HIF-1αRNAi真核表达载体能显著干扰培养的PASMCsHIF-1αmRNA表达,同时抑制低氧环境下PASMCs的增殖。     

异源基因α1,3半乳糖转移酶与增强型绿色荧光蛋白融合对荧光蛋白表达的影响

目的 研究异源(猪)基因α1,3半乳糖转移酶(3GT)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因形成的融合蛋白对其荧光表达量的影响.方法 BamHI,EcoRI酶切pcDNA3.1-α1,3GT重组载体后,回收含α1,3GT的片段,与BamHI、EcoRI酶切回收的pEGFP-N1载体连接,并酶切、测序鉴定重组真核表达载体p...     

干扰MDR1基因表达提高急性早幼粒白血病HT9细胞对紫杉醇的敏感性

以人类急性早幼粒白血病HT9细胞为实验对象,利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术干扰MDR1基因表达,提高HT9细胞对紫杉醇的敏感性。构建了3种靶向MDR1基因的重组干扰载体,稳定转染HT9细胞后,采用qRT-PCR和Western blotting方法,分别检测MDR1基因的m RNA和蛋白表达水平,用MTT法检测各转染组细胞对紫杉醇的敏感性,流式细胞术检测各组细胞药物外排功能。结果显示,成功构建了3种靶向MDR1的重组干扰载体p3.1-1、p3.1-2和p3.1-3。3种重组干扰载体不同程度抑制HT9细胞中MDR1基因的表达,其中重组干扰载体p3.1-3对MDR1基因沉默效果最好,对m RNA和蛋白的沉默效率分别为73.80%和47.61%,与对照组相比,转染p3.1-3重组干扰载体的细胞对紫杉醇的IC50由(1.26±0.17)μg/m L降至(0.46±0.07)μg/m L,逆转率达到(63.48±5.91)%,并且药物外排功能也明显降低。以上实验结果表明,3种靶向MDR1的重组干扰载体均能抑制MDR1基因表达,其中p3.1-3对MDR1基因干扰效果最好,并且能够有效提高HT9细胞对紫杉醇的敏感性,降低细胞药物外排功能。     

广西巴马小型猪Glut4基因克隆和真核表达

葡萄糖转运蛋白4(Glut4)是调控肌肉葡萄糖代谢的关键因子。本研究旨在克隆广西巴马小型猪Glut4基因,构建真核表达载体,转染C2C12细胞,研究Glut4功能。以广西巴马小型猪背最长肌组织作为实验材料,通过RT-PCR技术扩增出Glut4基因编码序列,连接入PMD18-T克隆载体,测序鉴定正确后提取克隆质粒。用Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶双酶切克隆质粒,获得Glut4片段,连接至p EGFP-N1载体上,构建p EGFP-N1-Glut4表达载体,提取p EGFP-N1-Glut4重组质粒转染至C2C12细胞,观察细胞荧光表达情况,并检测转染24 h和48 h时培养液的葡萄糖水平。实验结果表明:广西巴马小型猪Glut4基因编码区序列长1 530 bp,编码509个氨基酸,与参考序列(序列号为EU590115.1)的同源性为99.7%;重组质粒转染C2C12细胞能表现出绿色荧光。转染24 h和48 h时,p EGFP-N1-Glut4组细胞培养液的葡萄糖浓度均显著低于空载体组(16.08±0.49 vs.17.13±0.13,4.93±0.19 vs.6.28±0.12,p0.01)。在C2C12成肌细胞中过表达广西巴马小型猪Glut4基因,能增加细胞的葡萄糖摄入量。     

人前列腺癌PC3细胞Bloom解旋酶基因干扰载体的构建

通过RNAi技术干扰人前列腺癌PC3细胞Bloom(BLM)解旋酶基因的表达。实验前期根据BLM解旋酶基因序列设计并合成两对sh RNA,插入到CMV-cop GFP-T2A-Puro-H1-mcs载体,构建针对BLM解旋酶基因的重组干扰载体CMV-cop GFP-T2A-Puro-H1-mcs-BLM1、CMV-cop GFPT2A-Puro-H1-mcs-BLM2。经测序载体构建成功后,用脂质体将所构建的载体及阴性对照载体转染前列腺癌PC3细胞,通过荧光定量PCR和Western blot检测转染细胞的BLM解旋酶表达情况。检测结果显示,成功构建了BLM解旋酶RNAi真核表达载体;利用脂质体转染PC3细胞后,荧光定量PCR和Western blot鉴定结果表明,BLM解旋酶的表达水平显著降低,即Bloom RNAi真核表达载体在m RNA和蛋白质水平阻断了BLM解旋酶的表达。     

TOX3基因RNAi慢病毒载体的构建及对乳腺癌ZR-75-1细胞增殖的影响

旨在构建TOX3基因RNAi慢病毒载体并观察其对人乳腺癌ZR-75-1细胞增殖能力的影响。针对TOX3基因设计干扰靶序列,构建载体,测序正确后进行慢病毒包装及滴度测定。转染ZR-75-1细胞,荧光显微镜下观察表达GFP的细胞数目,实时荧光定量PCR及Western blot实验验证转染后ZR-75-1细胞中TOX3 mRNA和蛋白的表达。MTT及平板单克隆实验检测TOX3对ZR-75-1细胞增殖能力的影响。结果显示,各组载体序列正确,病毒滴度均2×108 TU/mL,表达GFP细胞数目均可达95%以上。各干扰组TOX3 mRNA及蛋白表达水平均降低,其中TOX3-shRNA-3组干扰效果最佳,转染后ZR-75-1细胞的增殖和单克隆形成能力下降。成功构建TOX3基因的RNAi慢病毒载体,沉默TOX3后ZR-75-1细胞的增殖能力下降。     

p300基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌ZR75-1细胞的影响

目的:构建p300基因的小干扰RNA(siRNA)慢病毒表达载体,检测其对p300蛋白表达的干扰,以及对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术设计并合成针对p300基因的siRNA,并将其克隆到siRNA表达载体pSIH-H1上,经酶切和测序验证,用293T人胚肾细胞包装p300 siRNA慢病毒,感染乳腺癌细胞ZR75-1,建立敲低p300表达的稳定细胞株,通过实时定量PCR和Western印迹检验RNAi的干扰效果,利用细胞生长实验检测p300 siRNA对ZR75-1细胞生长的影响。结果:酶切和测序证明构建了p300 siRNA真核表达载体;实时定量PCR和Western印迹证明构建的siRNA能有效抑制p300基因的表达,并建立了敲低p300表达的稳定细胞株;细胞生长实验证实p300 siRNA可有效促进ZR75-1细胞的生长。结论:构建了p300基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效抑制p300基因的表达,且能促进ZR75-1细胞的生长,表明构建的p300 siRNA具有功能。     

广西巴马小型猪Neuritin基因克隆与生物信息学分析及真核表达载体的构建

本研究旨在通过克隆广西巴马小型猪的Neuritin基因并进行生物信息学分析,为后续对Neuritin的研究奠定基础。实验成功获得Neuritin基因的编码区序列,并对Neuritin基因编码区序列和预测蛋白序列进行分析。结果表明,广西巴马小型猪的Neuritin基因编码142个氨基酸,其中含有2个磷酸化位点和2个跨膜信号结构以及1个结构保守域。通过双酶切技术成功获得重组质粒pEGFP-N1-Neuritin并转染到N2a细胞中,在24 h拍照发现N2a细胞发出荧光,证明Neuritin真核表达载体构建成功。     

Bcl-2/C-Raf双基因“敲低”抑制人结肠癌细胞增殖

 RNA干扰是一种具有序列特异性的基因沉默,能够触发具有相应序列的mRNA的降解.构建具有双靶点的RNAi质粒表达载体,与单靶点表达载体比较,探讨其对结肠癌细胞增殖的抑 制作用.本研究分别构建了针对Bcl-2、C-Raf 和Bcl-2/C-Raf靶基因的质粒表达载体,通过Lipofectamine TM2000介导转染人结肠癌细胞系HCT-8后,检测相应转染组靶基因的mRNA和蛋白质表达量,测定各组细胞活性,研究RNAi对各组癌细胞增殖的抑制率.结果表明,分别转染3种质粒表达载体后,3组结肠癌细胞中相应靶基因的mRNA和蛋白质表达量均降低;转染双靶点干扰质粒的试验组;其细胞活性低于单靶点组;对于针对Bcl-2, C-Raf和Bcl-2/C-Raf基因的3组干扰实验,RNAi对结肠癌细胞增殖的抑制率分别为43.87%,40.64% 和63.85%.RNAi是结肠癌细胞中的一种功能途径,以质粒作为表达载体,同时具备Bcl-2/C-Raf双靶点的表达载体,对结肠癌细胞增殖的抑制作用要明显优于单靶点表达载体,双靶点质粒表达载体在结肠癌的基因治疗中是有潜力的.