草菇菌丝体与原基差异表达基因分析

采用Solexa测序技术,对草菇菌丝体和原基进行了数字基因表达谱(DGE)测序,在菌丝体和原基文库中分别得到5701781个和5659262个高质量测序标签(cleantags),对应的标签种数(distinct clean tags)分别为85626和95363。将所有高质量测序标签与参考基因库进行比对,在菌丝体和原基文库中,占标签种数的43.32%和52.57%的标签可以唯一定位(map)到参考序列上,占标签种数的21.65%和21.47%的标签可以被定位到基因组序列上。最终,被菌丝体和原基标签唯一定位的基因数(unambiguous tag-mapped genes)分别为14794和15534。差异基因分析显示,两个文库中共有显著性差异表达的基因4163个,其中在原基中上调、下调的基因数分别为2486和1677,只在原基中表达的基因321个。经过Blastnr比对,在原基中特异表达的基因,涉及蛋白质(氨基酸)合成与代谢、糖代谢、脂类代谢和抗逆反应等多个代谢途径。GO功能富集分析结果表明,葡萄糖、己糖和乙醇等代谢途径大部分基因下调表达。Pathway功能富集分析结果表明,合成核糖体蛋白的基因均下调表达,表明原基形成时细胞代谢减弱,蛋白质合成量减小。     

与草菇原基形成相关的过氧化物酶基因VvDyP的结构与表达分析

DyP-type过氧化物酶作为氧化物酶家族中的一员,参与了菌体氧化应激调节反应以及基质降解等过程。本研究从草菇基因组中获得一个DyP-type 过氧化物酶的编码基因,将其命名为VvDyP。对该基因进行结构分析,结果显示草菇的DyP-type 过氧化物酶编码基因全长为 2 333bp,含有8个外显子,7个内含子;开放阅读框长为1 485bp,编码494个氨基酸。通过系统发育分析发现它与灰盖鬼伞以及糙皮侧耳DyP蛋白同源性最高;分析DyP-type 过氧化物酶编码基因在草菇各个时期的表达谱情况并进行荧光定量PCR实验验证发现,草菇的DyP-type过氧化物酶编码基因只在原基中高表达,推测DyP-type过氧化物酶编码基因可以清除过量的活性氧自由基以保证原基的正常形成。     

稀有密码子对proUK基因在大肠杆菌中高表达的影响

ＡＧＧ／ＡＧＡ密码子在ｐｒｏＵＫ基因中出现的频率高达２％,大肠杆菌中现有的编码ｔＲＮＡＵＣＵ的ａｒｇＵ基因不能满足ｐｒｏＵＫ高表达的需要。本文研究了ａｒｇＵ基因剂量对ｐｒｏＵＫ表达的影响,结果表明带有ａｒｇＵ基因的中等拷贝数质粒能促进ｐｒｏＵＫ基因表达。     

水稻醛缩酶嵌合基因的克隆和在大肠杆菌中高表达

水稻醛缩酶嵌合基因的克隆和在大肠杆菌中高表达陈海宝杨春松＊＊（中国科学院上海有机化学研究所,生命有机化学国家重点实验室,中国科学院计算机化学实验室,上海２０００３２）关键词果糖－１,６－二磷酸醛缩酶;ＤＮＡ单链合成法;反转录ＰＣＲ;基因工程收稿日期：...     

hnRNPA1基因在家蚕翅原基组织中的表达与定位分析

核不均一蛋白A1(hnRNPA1)是一个重要的RNA结合蛋白。本研究旨在获得家蚕hnRNPA1基因的cDNA,并对其在家蚕翅原基组织进行表达和定位分析。以家蚕幼虫期翅原基mRNA为模板通过反转录克隆家蚕BmhnRNPA1基因的全长cDNA,并对其进行生物信息学分析。构建pET32a-BmhnRNPA1蛋白表达载体,表达且纯化得到BmhnRNPA1重组蛋白,并制备该蛋白多克隆抗体,通过实时荧光定量RT-PCR、Western blot和免疫组化方法检测BmhnRNPA1在家蚕幼虫和蛹翅原基组织中的表达与定位。克隆得到了家蚕hnRNPA1基因的全长cDNA片段,其开放阅读框(ORF)序列为951 bp,编码316个氨基酸,预测分子量为34.98 kDa,等电点为5.15。编码蛋白在第18～90个氨基酸和109～181个氨基酸处为保守的RRM结构域。系统进化分析显示,家蚕hnRNPA1与小菜蛾hnRNPA1的亲缘关系最近。QRT-PCR结果显示,BmhnRNPA1在家蚕幼虫和蛹期的翅原基组织中均有表达,且在蛹期第3天的表达量达到峰值。Western blot进一步证实了实验结果。免疫组化分析结果显示,该蛋白存在于翅原基组织中,并定位于细胞核内。家蚕BmhRNPA1具有两个RNA结合结构域,属于hnRNPs家族,定位于细胞核内,表明其可能参与mRNA的选择性剪接作用。本研究结果为进一步探索该基因的功能提供了基础。     

草菇冷诱导基因Cor1在低温下表达变化的研究

将草菇菌株V23和耐低温诱变草菇菌株VH3的菌丝在4℃下处理不同时间,分别提取RNA,反转录获得cDNA作为模板,构建含Cor1基因和GPD内标基因片段的质粒作为标准品,采用荧光定量PCR技术研究Cor1基因在低温下的表达变化。结果表明草菇V23菌株的Cor1基因未经低温处理的表达量最大,低温处理后表达量持续下降,在6h达到最低值,8h开始该基因的表达量上升;而VH3菌株Cor1基因低温处理后表达量明显增加,2h达到最大值,4h下降,但6h开始上升,10h又下降。通过推测Cor1基因表达与草菇耐低温特性有相关性,为今后利用草菇自身的抗寒机制进行遗传改造提供理论依据。     

THP基因的重新克隆及草菇表达载体的构建

草菇 (Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａｖｏｌｖａｃｅａ)是一种高温型的食用菌 ,在 4℃低温条件下 ,其菌丝自溶死亡 ,子实体发软、液化直至腐烂[1～ 3 ] 。草菇的这一特性严重地限制了草菇的生产、新鲜草菇的流通、低温冷冻保鲜和出口创汇以及草菇菌种的低温冷冻储藏。草菇是同宗结合的真菌 ,生活史复杂[4 ] ,菌丝没有锁状联合 ,杂种选择缺乏标记 ,这给草菇的杂交育种带来极大的困难[5,6] 。基因工程的发展为解决草菇不耐低温冷藏这一难题提供了可能。ＴＨＰ(ＴｈｅｒｍａｌＨｙｓｔｅｒｅｓｉｓＰｒｏｔｅｉｎ)基因—热滞后蛋白基因 ,是加拿大科学…     

稀有密码子对proUK基因在大肠杆菌中高表达的影响

AGG/AGA密码子在proUK基因中出现的频率高达2%,大肠杆菌中现有的编码tRNA UCU的argU基因不能满足proUK高表达的需要。本文研究了argU基因剂量对proUK表达的影响,结果表明带有argU基因的中等拷贝数质粒能促进proUK基因表达。     

肝癌中高表达基因fup1的克隆及其功能

原发性肝细胞癌是我国高发的恶性肿瘤之一，开展肝癌相关基因的研究具有重要的意义。从已经获得的在肝癌和正常肝对照中表达量有明显差异的EST片段入手，克隆了一个功能未报道的而可能与肝癌相关的基因。暂命名为fup1，该基因编码区全长1233bp，其产物的分子量约为46kD，等电点为5.48,可能是一个核蛋白。Northern 迹结果表明该基因在人类除心脏以外的多种正常组织中表达量很小，说明其分布具有一定的组织特异性，将整合有该基因的真核表达载体转染NIH3T3细胞后，MTT检测结果证明该基因的产物可能对细胞的增殖具有促进作用。     

TBX2和PAX9在膀胱尿路上皮癌中高表达

目的研究TBX2和PAX9在膀胱尿路上皮癌中的表达及临床意义。方法收集武汉大学人民医院病理科2006-2009年有完整临床和病理资料的膀胱尿路上皮癌存档蜡块50例和5例癌旁组织,采用免疫组织化学S-P法检测50例膀胱尿路上皮癌和5例癌旁组织中TBX2和PAX9的表达水平;采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统,对TBX2和PAX9的表达进行定量分析,并用SPSS13.0软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q)检验。结果 TBX2和PAX9在膀胱尿路上皮癌中均高表达,与癌旁组织相比,差异有显著性;经Spearman等级相关分析显示,TBX2和PAX9表达呈正相关。结论 TBX2和PAX9对膀胱尿路上皮癌诊断提供参考价值。     

草菇不同菌株木聚糖酶xyn基因的表达及其酶活性分析

木聚糖酶是半纤维素酶系的重要组成部分,能够分解水稻、小麦等农作物秸秆中的半纤维素。研究探讨木聚糖酶相关基因及其功能,为进一步探讨木聚糖酶与草菇生物转化率之间的关系提供理论依据。首先通过生物信息学手段构建了草菇2个木聚糖酶基因xyn1和xynII编码氨基酸序列的系统进化树,然后从生物转化率不同的草菇菌株分别提取各自的RNA,反转录为cDNA后,采用实时荧光定量PCR技术分析了xyn1和xynII基因的转录表达情况;最后应用DNS法对这些菌株中的木聚糖酶活性进行了测定。研究结果表明,xyn1编码的氨基酸序列与草腐菌相似性较高,而xynII编码的氨基酸序列与木腐菌遗传差异较小。在木聚糖酶活性测定和实时荧光定量PCR结果中,不同菌株的木聚糖酶活性趋势与xynII的转录表达趋势相似,均呈现依次递减。草菇的木聚糖酶活性与其生物转化率之间存在正相关性,推测草菇不同菌株木聚糖酶活性差异可能表现在转录水平上的差异。     

MADS-box转录因子编码基因Vvrin1在草菇不同发育时期的表达分析

草菇是我国土特产出口的主要种类之一,而采后易开伞问题限制了草菇的贮藏及运输。MADS-box转录因子对植物的成熟衰老和真菌的子实体发育起到重要的调控作用。目前尚未见草菇MADS-box转录因子的相关报道。本研究通过生物信息方法及分子生物学的手段对草菇的基因组、转录组数据进行分析,获得了草菇MADS-box转录因子基因Vvrin1。该基因全长1 392bp,含2个内含子,编码419个氨基酸残基。该转录因子含有一个MADS-box结构域,序列与双孢蘑菇Agaricus bisporus、斑玉蕈Hypsizygus marmoreus和灰盖鬼伞Coprinopsis cinerea的MADS-box转录因子相似性分别为71%、67%和61%。通过表达谱数据及荧光定量PCR分析表明Vvrin1基因在草菇子实体伸长期菌柄的表达量出现高峰,具有极显著性差异（P<0.01）,推测该转录因子参与调控草菇菌柄的伸长,菌盖的开伞。这些结果为草菇成熟衰老（特别是开伞）的调控研究提供数据支持。     

西方蜜蜂采集蜂上颚腺中高表达基因的筛选与表达分析

【目的】本研究旨在筛选西方蜜蜂Apis mellifera采集蜂上颚腺中高表达基因,为进一步筛选和研究蜜蜂采集行为相关基因提供依据。【方法】基于前期测序的西方蜜蜂5种不同职能工蜂(3日龄工蜂、10日龄哺育蜂、10日龄采集蜂、21日龄哺育蜂和21日龄采集蜂)上颚腺转录组数据,筛选采集蜂上颚腺的差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),并对这些DEGs进行GO和KEGG分析;qRT-PCR检测随机选取的8个DEGs在10日龄哺育蜂和10日龄采集蜂上颚腺以及两个关键DEGs(Δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因Amp5cs和细胞色素P450 9e2基因CYP9Q3)在工蜂不同发育时期和采集蜂各组织中的表达量。【结果】筛选到22个DEGs在21日龄采集蜂上颚腺中的表达量显著高于在3日龄工蜂、10日龄哺育蜂和21日龄哺育蜂上颚腺中的表达量,同时在10日龄采集蜂上颚腺中的表达量也显著高于在10日龄哺育蜂上颚腺中的表达量。GO和KEGG富集分析显示这些DEGs主要富集在胆固醇代谢、半乳糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、细胞凋亡-果蝇、氨基酸生物合成等方面。qRT-PCR结果表明,8个DEGs(LOC100576395, LOC411983, LOC410235, LOC725581, LOC410527, LOC406131, LOC408453和LOC410253)的表达模式与转录组数据的表达模式一致;2个关键DEGs Amp5cs和CYP9Q3在工蜂各发育阶段均有表达,且在采集蜂中表达量最高;Amp5cs在采集蜂腹、胸、上颚腺和触角中高量表达,P450 9e2在采集蜂触角 和足中表达量显著高于在其他组织中的。【结论】本研究在减小日龄因素干扰下筛选了西方蜜蜂采集蜂上颚腺中22个高表达的DEGs,这些DEGs可能主要参与采集蜂上颚腺生理发育以及能量供应、外源性物质解毒、花蜜转化等代谢通路,进而影响蜜蜂的采集行为。这些结果为西方蜜蜂上颚腺的功能研究提供理论参考,同时也为采集力强的新品种培育奠定了基础。     

草菇低温诱导基因的分离

应用ｍＲＮＡ差别筛选法,对低温处理草菇（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌａｖｏｌｖａｃｅａ）及正常草菇基因表达进行筛选、分析,结合ＲＮＡ斑点杂交技术加以验证,分离得到草菇低温诱导基因。研究表明草菇菌丝体在低温胁迫下,存在着基因表达的变化。     

草菇低温诱导基因的分离

应用ｍＲＮＡ差别筛选法,对低温处理草菇及正常草菇基因表达进行筛选,分析,结合斑要交技术加以验证,分离得到草菇低温诱导基因,研究表明草菇菌丝体在低温腔胁迫下,存在着基因表达的变化。     

MOB2基因在真核细胞中的表达研究

通过RT-PCR从培养的HUVECs中扩增MOB2基因片段,将该片段克隆在真核表达载体pEGFP-C1中,转染NIH3T3细胞,经G418筛选,构建稳定表达细胞系,并用荧光显微镜和Western blot对其进行鉴定。经RT-PCR扩增出734 bp基因片段,经测序分析并与GenBank的DNA序列比对分析后,在NIH3T3细胞中表达。G418筛选后,细胞荧光信号较强,Western blot检测,细胞中的融合蛋白能够与抗MOB2的多抗结合。成功地扩增了HUVECs中的MOB2基因全长cDNA并进行真核表达与鉴定。