小鼠骨髓内皮细胞条件培养液复合FL及TPO对HPP—CFC及CFU—GM增殖的影响

通过传代培养小鼠骨髓内皮细胞,收集无血清条件培养液（ECM）,并经超滤得到大于10kD的浓缩液,分别观察ECM和大于10kD的浓缩液复合flt3ligand(FL)及thrombopoietin(TPO)对体外培养HPP-CFC、CFU-GM的影响,结果表明：ECM或大于10kD的浓缩液对HPP-CFC、CFU-GM的生长均有支持作用;FL或/和TPO与ECM或大于10kD的浓缩液合用能加强对HPP-CFC、CFU-GM生长的刺激作用;FL加TPO与ECM或大于10kD的浓缩液合用对HPP-CFC、CFU-GM生长的刺激作用更加明显;选择FL和TPO特异性的引物,用RT-PCR技术未能检测到小鼠骨髓内皮细胞有FL和TPOmRNA的表达。     

骨髓内皮细胞无血清条件培养液对骨髓内皮细胞增殖的促进作用

本文通过制备小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液(serum-free murine bone marrow endothelial cell conditioned medium, mBMEC-CM),经超滤分为分子量>10 kDa组分和<10 kDa组分,分别观察mBMEC-CM原液及其组分以及外源性细胞因子对小鼠骨髓内皮细胞集落生成的影响。用Wright’S Giemsa染色计数内皮细胞集落及检测骨髓内皮细胞的vWF,通过[3H]- TdR掺入量,观察mBMEC-CM原液及其组分以及外源性细胞因子对小鼠骨髓内皮细胞增殖的影响,并用分子杂交方法检测内皮细胞表达的细胞因子,从几个方面来研究mBMEC-CM对骨髓内皮细胞增殖的作用。结果显示,骨髓内皮细胞vWF 检测阳性。mBMEC-CM原液及其分子量>10 kDa组分能刺激骨髓内皮细胞集落增殖,且能明显增加骨髓内皮细胞[3H]-TdR 掺入量;分子量<10 kDa组分对骨髓内皮细胞集落增殖无明显刺激作用,也不能增加骨髓内皮细胞[3H]-TdR掺入量。外源加入IL-6、IL-11、SCF、GM-CSF、VEGF、bFGF 6种细胞因子能明显刺激骨髓内皮细胞集落增殖,SCF、VEGF、bFGF能明显增加骨髓内皮细胞[3H]-TdR掺入量。Atlas array膜杂交实验显示骨髓内皮细胞内源性表达GM-CSF、SCF、MSP-1、endothelin-2、thymosin β10、connective tissue GF、PDGF-A chain、MIP-2α、PlGF、neutrophil activating protein ENA-78、INF-γ、IL-1、IL-6、IL-13、IL-11、inhibin-α等细胞因子的mRNA。上述结果提示,骨髓内皮细胞无血清条件培养液对骨髓内皮细胞增殖具有促进作用。     

红景天苷对骨髓抑制贫血小鼠造血祖细胞增殖的影响

采用造血祖细胞培养技术,观察红景灭苷体内给药和细胞培养直接用药对骨髓抑制贫血小鼠造血祖细胞增殖和骨髓有核细胞数目的影响.结果显示,体内用药能显著增加BMC数目,促进BFU-E、CFU-E、CFU-GM和CFU-Meg集落形成(P<0.05);在一定浓度下,体外用药也能显著促进BFU-E、CFU-E、CFU-GM和CFU-Meg集落形成(P<0.05).结果提示,红景天苷可能通过间接或直接作用刺激骨髓抑制贫血小鼠造血祖细胞的增殖来促进造血功能的恢复.     

蛋白酶3对造血干/祖细胞增殖和分化的影响

蛋白酶3(proteinase 3, PRTN3)是一种中性丝氨酸蛋白酶,与病原体清除、组织损伤和细胞凋亡有关。近期研究发现, Prtn3在造血干/祖细胞中高表达,但其生物学功能及意义仍不清楚。围绕上述问题,该文采用单细胞转录组测序方法分析Prtn3基因在野生型小鼠(WT)血细胞中的表达情况;构建Prtn3基因敲除小鼠(Prtn3–/–),并采用流式细胞术和血常规分别分析Prtn3–/–小鼠骨髓中的LT-HSC、ST-HSC、MPP、CMP、GMP、MEP及分化成熟细胞的数目和比例;体外干/祖细胞单细胞和集落培养法分析LSK细胞的增殖和分化潜能;竞争移植实验分析Prtn3–/–小鼠LSK细胞的竞争能力以及外周血、脾脏和骨髓中各种血细胞的数目和比例;免疫荧光法分析Prtn3–/–小鼠脾脏和骨髓中的供体血细胞分布。结果显示, Prtn3在小鼠造血干/祖细胞,尤其是在髓系祖细胞(CMP和GMP)中持续高表达; Prtn3–/–小鼠骨髓中LSK和LK细胞所占比例显著高于WT小鼠骨髓中LSK和LK细胞的比例且表现为LT-HSC、ST-HSC、MPP、CMP及GMP在骨髓细胞中的比例均显著增加(P...     

小鼠LAK细胞对红系祖细胞及多向造血祖细胞增殖的影响

小鼠脾细胞经重组人白细胞介素-2(rhIL-2)激活后对YAC-1,LP-3和WEHI-164等肿瘤细胞均有很强的杀伤活性。在CFU-E和BFU-E培养体系中,不同浓度LAK细胞与BMC直接加入或预温育4h后再培养,均能加强CFU-E和BFU-E增殖。低浓度LAK细胞(LAK/BMC为0.5)与BMC直接加入或预温育后再加入CFU-mix培养体系中,均能增强CFU-mix增殖,而高浓度LAK细胞和BMC(LAK/BMC=8.0)直接加入培养体系则抑制CFU-mix增殖;若共温育后再培养则非常明显地抑制CFU-mix增殖,CFU-mix仅为对照的17.6％。小鼠LAK细胞对造血祖细胞体外增殖具有调节作用,这种调节可能包括分泌某些细胞因子以及细胞间直接相互作用两种方式。     

小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液及其超滤组分对粒巨噬系祖细胞生长的影响

本研究通过传代培养小鼠骨髓内皮细胞系细胞,收集无血清条件培养液(mBMECCM),将其作多级串联超滤,获得分子量大于10、3～10、1～3、05～1kD和小于05kD超滤组分。进行粒巨噬系造血祖细胞集落形成试验,检测了它们的作用。mBMECCM和3～10kD组分对粒巨噬系祖细胞(CFUGM)生长未见明显影响,而分子量大于10kD和05～1kD组分促进CFUGM的增殖,分子量1～3kD和小于05kD组分则抑制CFUGM的增殖。这4种超滤组分对CFUGM生长的效应均有剂量依赖性。这些结果提示,在体外培养条件下,小鼠骨髓内皮细胞分泌若干种活性成分,分别对CFUGM的生长起促进或抑制作用     

RunX3对小鼠骨髓造血干细胞功能的影响

目的研究RunX3基因对造血干细胞自我更新和分化能力的影响。方法流式细胞术测定小鼠骨髓干细胞和外周血单个核细胞的比例;通过竞争性骨髓移植实验检测RunX3转基因小鼠骨髓干细胞的功能。结果移植后来源于RunX3-/-小鼠骨髓干细胞供体的外周血细胞占总外周血细胞的比例与野生对照鼠相比无明显差异,移植后来源于RunX3-/-小鼠骨髓干细胞供体的外周血中髓系细胞占总外周血髓系细胞的比例较野生型对照鼠高。结论RunX3基因缺失对骨髓造血干细胞的自我更新没有影响,但其可能参与了骨髓造血干细胞的分化过程。     

Cramp过表达对小鼠骨髓造血干细胞功能的影响

目的研究Cramp蛋白过表达对小鼠骨髓造血干细胞自我更新和分化能力的影响。方法应用流式细胞仪分析Cramp过表达转基因小鼠及同龄野生型小鼠的骨髓、脾脏、胸腺等组织器官中各种细胞的比例;分选骨髓造血干细胞,体外培养,观察其克隆形成能力。结果与野生型小鼠相比,Cramp过表达转基因小鼠的骨髓、脾脏、胸腺等组织器官中各种细胞的比例、骨髓造血干细胞的克隆形成能力等均无明显变化。结论本研究中,Cramp过表达转基因小鼠骨髓造血干细胞的分化能力、克隆形成能力无明显变化。     

小鼠LAK细胞对粒-单系祖细胞增殖的影响

在小鼠粒单系祖细胞(CFU-GM)集落培养体系中加入LAK细胞能显著增强CFU-GM增殖,LAK∶BMC为8时,CFU-GM数比对照增加194.4%。LAK细胞条件液也有类似co-CSF的活性,单独LAK细胞条件液不能刺激CFU-GM增殖。LAK细胞和BMC共孵育4小时后再进行CFU-GM培养,低浓度LAK细胞仍能增强CFU-GM增殖,而高浓度LAK细胞则显著抑制CFU-GM增殖,LAK∶BMC为8时,CFU-GM仅为对照的27.6%。作者认为小鼠LAK细胞能通过分泌某些co-CSF增强CSF的活力,而LAK细胞对CFU-GM又有接触杀伤的活性。     

柴胡多糖对照射小鼠骨髓血管机能及造血的影响

本文研究了柴胡多糖对γ线全身照射小鼠骨髓血管机能及GM-CFU-C增殖的影响。结果表明,照前1小时腹腔注射柴胡多糖能减轻照后骨體血管通透性增高的程度,并可加速照射小鼠移植骨髓后股骨内GM-CFU-C的增殖。     

人骨髓基质细胞体外分离及定向培养内皮细胞

用Ficoll(比重1.077 g/ml)从正常成人骨髓中分离骨髓基质细胞(BMSCs),DMEM-HG 培养基内含20?S、GM-CSF(100 u/ml)、VEGF(10 ng/ml)、FGF(5 ng/ml)、L-谷氨酰胺(2mmol/ L)、肝素(90 u/ml),以及抗生素液进行定向培养和扩增其中的内皮细胞(ECs),Ⅷ因子相关抗原的免疫组化法和透射电镜观察(TEM)鉴定其细胞的性质。结果5.0×105个BMSCs在体外经定向ECs 培养和扩增8代后,获得了6.0×109个ECs,扩增了约1.2×104倍。70%-80%的细胞对Ⅷ因子相关抗原免疫组化呈阳性反应;光镜下细胞呈典型的“鹅卵石”样;TEM下可观察到胞浆内有Weible- palade小体,证实为内皮细胞。实验表明,BMSCs在体外分离和定向培养的ECs,经扩增后可能是心血管组织工程所需种子细胞的又一个重要来源。     

Methotrexate chemotherapy–induced damages in bone marrow sinusoids: An in vivo and in vitro study

Chemotherapeutic agents are very well evident extrinsic stimuli for causing damage to endothelial cells. Methotrexate is an antimetabolite commonly used to treat solid tumours and paediatric cancers. However, studies on the effect(s) of methotrexate on bone marrow microvascular system are inadequate. In the current study, we observed a significant bone marrow microvascular dilation following methotrexate therapy in rats, accompanied by apoptosis induction in bone marrow sinusoidal endothelial cells, and followed by recovery of bone marrow sinusoids associated with increased proliferation of remaining bone marrow sinusoidal endothelial cells. Our in vitro studies revealed that methotrexate is cytotoxic for cultured sinusoidal endothelial cells and can also induce apoptosis which is associated with upregulation of expression ratio of Bax and Bcl-2 genes and Bax/Bcl-2 expression ratio. Furthermore, it was shown that methotrexate can negatively affect proliferation of cultured sinusoidal endothelial cells and also inhibit their abilities of migration and formation of microvessel like tubes. The data from this study indicates that methotrexate can cause significant bone marrow sinusoidal endothelium damage in vivo and induce apoptosis and inhibit proliferation, migration and tube-forming abilities of sinusoidal endothelial cells in vitro.     

Frequent harvesting from perfused bone marrow cultures results in increased overall cell and progenitor expansion

The establishment of prolific long-term human bone marrow cultures has led to the development of hematopoietic bioreactor systems. A single batch expansion of bone marrow mononuclear cell populations leads to a 10- to 30-fold increase in total cell number and in the number of colony forming units-granulocyte/macrophage (CFU-GMs), and a four- to tenfold increase in the number of long-term culture initiating cells (LTC-ICs). In principle, unlimited expansion of cells should be attainable from a pool of stem cells if all the necessary requirements leading to stem cell maintenance and division are met. In this article, we take the first step toward the identification of factors that limit single batch expansion of ex vivo bone marrow cells in perfusion-based bioreactor systems. One possible constraint is the size of the growth surface area required. This constraint can be overcome by harvesting half the cell population periodically. We found that harvesting cells every 3 to 4 days, beginning on day 11 of culture, led to an extended growth period. Overall calculated cell expansion exceeded 100-fold and the CFU-GM expansion exceeded 30-fold over a 27-day period. These calculated values are based on growth that could be obtained from the harvested cell population. Growth of the adherent cell layer was stable, whereas the nonadherent cell population diminished with increasing number of passages. These results show that the bioreactor protocols published to date are suboptimal for long-term cultivation, and that further definition and refinement is likely to lead to even greater expansion of hematopoietic cell populations obtained from bone marrow. More importantly, these results show that the LTC-IC measured during the single pass expansion do have further expansion potential that can be realized by frequent harvesting. Finally, the present culture conditions provide a basis for an assay system for the identifications provide a basis for an assay system for the identification of the factors that determine the long-term maintenance and replication of human stem cells ex vivo. (c) 1994 John Wiley & Sons, Inc.     

载脂蛋白A损伤小鼠骨髓源性EPCs血管发生能力及其机制

改善血流、促进血管新生是缺血性外周血管疾病的重要治疗措施．由于载脂蛋白A(ApoA)与纤溶酶原(plasminogen,Plg)具有75%～98%的结构同源性,因此,ApoA也可能通过类似Plg的方式抑制内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)增殖、黏附及迁移而影响血管发生的能力．本文研究ApoA对EPCs 血管发生的影响及机制．为了编码人ApoA全长cDNA序列的pSG-5表达载体,转染COS-7细胞株后进行培养,收集培养液,免疫亲和层析法分离纯化ApoA蛋白;从转ApoA基因小鼠、野生型对照鼠及正常对照鼠骨髓分离培养EPCs,经ApoA处理后移植下肢缺血实验小鼠,于移植后第3、7、14天后观察ApoA对EPCs黏附、迁移及血管发生能力的影响．研究发现,ApoA能显著降低 EPCs的黏附、迁移能力,Matrigel胶上,EPCs血管腔样结构严重破坏,体内实验揭示,EPCs归巢至ApoA转基因小鼠缺血组织血管周围的数量及毛细血管数量显著减少．结果表明,ApoA能损伤EPCs的黏附、迁移及归巢,最终损伤EPCs的血管发生能力．     

脐带血清在骨髓造血祖细胞培养中的效应

目的：探讨人脐带清（ＣＢＳ）在骨髓造血祖细胞培养中的效应。方法：用人骨髓细胞进行ＣＦＵ、ＧＭ、ＶＦＵ－Ｅ、ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－ＧＥＭＭ培养。结果：ＣＢＳ能直接刺激骨髓细胞ＣＥＵ－ＧＭ的形成。与血型相同害无关。四人份以上的混合ＣＢＳ（ＭＣＢＳ）,刺激活性高且稳定。１０％ＭＣＢＳ相当于６５．６μｇ／Ｌ ＧＭ－ＣＳＦ、０．２３、０．３、０。．４６ｋＵ／Ｌ ＥｐＯ对ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｅ、ＢＦＵ－Ｅ、Ｃ     

骨髓间充质干细胞无血清培养

为建立一种化学成分明确的、能用于体外扩增骨髓间充质干细胞的无血清培养基, 且骨髓间充质干细胞经无血清培养扩增后仍能保持其多向分化的潜能。采用密度梯度离心结合贴壁法从1月龄新西兰大白兔股骨中分离骨髓间充质干细胞, 比较在含10%胎牛血清的培养基(SCM)和自制的化学成分明确的无血清培养基(CDSFM)中骨髓间充质干细胞的形态、增殖能力, 以及扩增后的骨髓间充质干细胞的细胞周期、集落形成能力和成骨、成脂肪分化能力。经过10 d的培养, 骨髓间充质干细胞在自制的无血清培养基中扩增了50倍, 在含10%胎牛血清的培养基中扩增了40倍。在无血清和有血清培养基中扩增后的细胞中G0/G1期比例分别为(80.31%±0.6%)和(75.24%±4.0%), 两者无显著差异(P>0.05)。无血清培养扩增后的骨髓间充质干细胞集落形成率(12.7%±4.0%)低于有血清培养组(28.7%±4.2%), 两者比较差异显著(P<0.01)。经过无血清培养扩增的骨髓间充质干细胞在成骨、成脂肪诱导分化培养基中能够分化成成骨和脂肪细胞。自制的化学成分明确的无血清培养基能够在体外培养扩增骨髓间充质干细胞, 并且维持其干细胞特性, 可以用于细胞治疗以及生物医学研究。