乳酸高产菌的代谢调控育种思路

简述了乳酸的结构、性质、用途和生产方法;讨论了乳酸的生物合成途径、代谢途径酶系的组成以及代谢调节机制;重点阐述了采用代谢调控手段如何选育乳酸高产菌的育种战略,概述了近年来乳酸高产菌新的育种技术。     

支链氨基酸合成调控机制及菌种选育策略研究进展

提高国内支链氨基酸产生菌的高产菌株选育水平有助于缩短与国外生产之间的差距,满足国内市场需求。根据支链氨基酸生物合成途径及代谢调节,重点阐述了合成过程中关键酶的代谢调控,介绍了诱变育种、代谢工程、基因组改组及全局转录机器工程四种育种策略的研究进展。在支链氨基酸选育方面,全局转录机器工程育种目前虽无成功实例,但具有很大的潜力,而其他育种策略在氨基酸的选育中均发挥重要作用,可供国内相关育种工作者参考使用。     

L-缬氨酸发酵生产的育种思路及发酵条件优化策略

L-缬氨酸在医药及饲料领域中有着广泛的用途,根据L缬氨酸的生物合成途径及其代谢调节机制,利用代谢调控理论,重点阐述了L缬氨酸生产菌的育种思路及培养条件的优化,为缬氨酸发酵生产提供理论指导。     

阿魏菇多糖高产菌的离子束和激光复合诱变育种

目的:诱变筛选阿魏菇多糖高产菌,探索食用菌的离子束和激光复合诱变育种方法。方法:尝试用阿魏菇菌丝单细胞为靶材,以离子束注入和激光辐照为复合诱变手段,采用营养缺陷型筛选办法定性初筛,摇瓶发酵定量复筛。结果:通过离子束注入诱变,获得了2株菌丝体多糖产量分别达到551.80mg/L和659.46mg/L、较1号出发菌株提高了46.5%和75.2%的多糖高产菌PFPH-1和PFPH-2;在此基础上,以激光辐照为复合诱变手段,获得了1株菌丝体多糖产量达到762.50 mg/L、较出发菌株PFPH-2提高了15.63%的多糖高产菌PFPH-3。结论:离子束和激光复合诱变育种方法在改良阿魏菇多糖高产性状方面诱变功效显著。     

鸟嘌呤核苷高产茵的育种策略

选育优良的鸟嘌呤核苷(鸟苷)产生菌是实现发酵法生产鸟苷的前提,在鸟苷发酵的建立和改进中起着非常重要的作用。本分析了鸟苷的生物合成途径及代谢调节机制,根据代谢控制发酵“进、通、节、堵、出”五字原理,提出鸟苷高产菌的育种策略：鸟苷高产菌株在遗传学上应具备Ade^-,red^-、NP^-、8-AG^r(或8-AX^r)、MSO^r,SG^r,AAR^r,Sm^r等遗传标记,并详述了其育种实例。     

高产琥珀酸菌株的通量筛选

以琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes F3—21为出发菌株,分别用吖啶黄、紫外线、紫外线．硫酸二乙酯和亚硝基胍进行诱变,产生突变菌库。用“96孔板培养－HPLC浓缩检测－厌氧瓶复筛”的模式筛选高产突变株。从1056株突变株中,筛选到一株高产菌株Ⅵ-10-C。连续传代10次,产酸水平不变。在5L发酵罐中补料分批发酵72h,Ⅵ－10－C产琥珀酸87．6g／L,生产强度1．22g/（L·h）,糖酸转化率0．66g／g;琥珀酸产量比出发菌提高了30％。代谢通量与关键酶活性分析表明：相比于F3-21,Ⅵ-10-C发酵过程中从磷酸烯醇式丙酮酸节点处流向草酰乙酸的代谢流量增加了28．9％,相对应的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（PEPCK）酶活提高了23．5％。结果表明用“96孔板培养-HPLC浓缩检测-厌氧瓶复筛”的模式能快速有效筛选高产琥珀酸菌株。     

YAG激光照射对高山被孢霉花生四烯酸产量的影响

花生四烯酸产生菌高山被孢霉的孢子在时间为8min,距离为10cm的YAG激光剂量照射下,其致死率为75％－80％,以该剂量反复进行照射及菌种筛选,得到其最高生物量28.6g/L,油脂11.04g/L,3.10g/L的突变株T105,比对照菌株的AA产量及油脂量分别提高了2．95倍和1．71倍。通过对突变株T105的形态,代谢情况以及继代稳定性进行分析,认为YAG激光诱变育种是获得茶花生四烯酸高产菌株的有效方法。     

数理统计在西索米星产生菌诱变育种中的应用

在西索米星产生菌橄榄星孢小单孢菌M－41诱变育种过程中,针对常规育种的随机特性,应用数理统计方法设计实验和整理分析实验数据。取得较好的效果,筛选到一株高产的优良菌株08－81。     

L—色氨酸的生产及其代谢控制育种

本综述了利用微生物生产Ｌ－色氨酸的各种方法和Ｌ－色氨酸的生物合成途径及其代谢调控机制,并介绍了利用重组ＤＮＡ技术选育Ｌ－色氨酸高产菌的研究现状。     

L-异亮氨酸分批发酵动力学模型的研究

对黄色短杆菌L－异亮氨酸高产菌XQ－4（AHV^rAEC^rSuc^gSG^rEth^rα－AB^rIleHx^r）分批发酵动力学模型进行了研究。建立了比较合理的L－异亮氨酸分批发酵动力学模型,为L－异亮氨酸补料分批发酵最优化的研究奠定基础。     

抗噬菌体谷氨酸高产菌株选育

从污染的谷氨酸发酵废液中分离纯化噬菌体,并以高滴定度侵染生产敏感菌,借助菌的自发突变筛选出抗噬突变株,再运用紫外线、亚硝基胍复合诱变手段经过初筛、复筛,最后选育出抗噬谷氨酸高产菌株。其过程简单、便利,可靠性高,是选育抗噬谷氨酸高产菌株的好方法,对发酵行业具有指导意义。曾选育到抗噬谷氨酸高产菌株,其摇瓶发酵产量比对照提高26.4%。     

L-valine production in Corynebacterium glutamicum based on systematic metabolic engineering: progress and prospects

L-valine is an essential branched-chain amino acid that cannot be synthesized by the human body and has a wide range of applications in food, medicine and feed. Market demand has stimulated people’s interest in the industrial production of L-valine. At present, the mutagenized or engineered Corynebacterium glutamicum is an effective microbial cell factory for producing L-valine. Because the biosynthetic pathway and metabolic network of L-valine are intricate and strictly regulated by a variety of key enzymes and genes, highly targeted metabolic engineering can no longer meet the demand for efficient biosynthesis of L-valine. In recent years, the development of omics technology has promoted the upgrading of traditional metabolic engineering to systematic metabolic engineering. This whole-cell-scale transformation strategy has become a productive method for developing L-valine producing strains. This review provides an overview of the biosynthesis and regulation mechanism of L-valine, and summarizes the current metabolic engineering techniques and strategies for constructing L-valine high-producing strains. Finally, the opinion of constructing a cell factory for efficiently biosynthesizing L-valine was proposed.

     

黄色短杆菌TK0303的L-亮氨酸生物合成途径分析

应用途径分析方法分析了在拟稳态时黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)TK0303由葡萄糖发酵生产L-亮氨酸的代谢途径,确定了L-亮氨酸合成的最佳途径和最大理论产率。通过比较途径分析所获得的反应模型,确定了丙酮酸和乙酰辅酶A是L-亮氨酸合成途径的关键节点。在此基础上改变外界环境因子,强化L-亮氨酸生物合成途径中丙酮酸和乙酰辅酶A两个关键节点的代谢流,以期进一步提高L-亮氨酸产率。结果表明,经过谷氨酸以及醋酸铵的调节,代谢途径流量发生显著变化,L-亮氨酸产量有明显提高。     

Variability in tissue cultures of Choisya ternata. Alkaloid accumulation in protoclones and aggregate clones obtained from established strains

Protoclones and aggregate clones have been prepared from 5 callus strains of C. ternata chosen for their dihydrofuroquinoline-accumulating capacities in a population of well-established strains. The results show that it is possible to obtain cell lines which accumulate higher alkaloid contents than the highest alkaloid-producing strain; the probability of obtaining a high-producing clone is greater if a high-producing strain is chosen as the parent strain for cloning. Compared to the alkaloid content of the whole plant, one alkaloid (platydesminium) could be obtained in greater amounts in some clones, but another alkaloid (balfourodinium) was always found in lesser quantities, even in the clones which accumulated most alkaloids. Aggregate clones were easier to obtain than protoclones and alkaloid production was rather unstable in all the clones. The protoplast-cloning procedure was not more efficient than the aggregate-cloning procedure for the selection of high-alkaloid producing lines.     

丙酮酸和乙酰-CoA协同促进L-亮氨酸的合成

【目的】通过理性改造柠檬酸合酶(citrate synthase,CS)、丙酮酸脱氢酶系E1p (pyruvate dehydrogenase complex,PDHC,编码基因aceE)和ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-Citrate lyase,ACL),有效供应胞内丙酮酸和乙酰-CoA,以提高L-亮氨酸产量。【方法】以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为底盘细胞,分析不同CS和PDHC酶活水平对L-亮氨酸合成的影响。随后,考查协同改造CS和PDHC或引入绿硫菌(Chlorobium tepidum)中ACL对L-亮氨酸合成的影响。【结果】低强度的CS酶活(即重组菌XL-3 P_(dapA-R2)gltA)有利于L-亮氨酸的合成,L-亮氨酸产量达到17.5±0.6 g/L。而改变PDHC酶活水平不利于L-亮氨酸的合成。此外,以启动子P_(dapA-R2)控制CS表达,而以启动子P_(gapA)控制PDHC表达时(即重组菌XL-4),可实现胞内丙酮酸和乙酰-CoA的有效供给,L-亮氨酸产量达到20.2±1.7 g/L,且显著降低副产物产量。若在重组菌XL-4中引入C.tepidum,ACL会显著抑制菌体生长而不利于L-亮氨酸合成,而引入到出发菌XL-3中因胞内丙酮酸和乙酰-CoA得到有效供给,目标重组菌XL-5L-亮氨酸产量达到18.5±1.2 g/L,比出发菌株XL-3增加了14.2%。【结论】重组菌XL-4中因协同控制CS和PDHC酶活,从而实现胞内丙酮酸和乙酰-CoA有效供给,促进L-亮氨酸的合成。该研究结果对后续利用代谢工程技术强化微生物合成L-亮氨酸等支链氨基酸具有重要的参考价值。     

谷氨酸棒杆菌生产异亮氨酸辅因子策略及其基因组整合研究进展

L?异亮氨酸属于三大支链氨基酸,是人体8种必需氨基酸之一,广泛应用于食品、药品、保健品、化妆品等领域。目前,微生物发酵法是工业生产L?异亮氨酸的主要方法,其中谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是发酵生产L?异亮氨酸的优势菌株,然而随机诱变会使产量的提高能力达到饱和,难以得到更加高产的菌株,因此针对诱变菌株进行理性改造已成为进一步提高产量的主要方式;且随着遗传操作技术在谷氨酸棒杆菌中的应用与优化,代谢工程育种已逐渐取代传统的诱变育种。综述了谷氨酸棒杆菌中L?异亮氨酸的生物合成途径、代谢调控机制和理性改造L?异亮氨酸生产菌株的策略,并对辅助因子工程应用于理性改造及对谷氨酸棒杆菌基因组整合策略进行了系统阐述,以期为工业水平稳定生产L?异亮氨酸高产菌株的基因组整合策略提供参考依据。     

酵母超氧物歧化酶高产菌的选育

采用常规筛选方法从300多株不同种属的酵母菌中筛选到两株细胞生物量和超氧物歧化酶(SOD)含量都较高的菌株(酿酒酵母,编号为Y-8和Y一111)作为实验出发菌.经单倍体分离、N-甲基-N-亚硝基-N’-硝基胍(MNNG)诱变和群体杂交等手段,从中选育出一株细胞生物量略高于实验出发菌、超氧物歧化酶高达1350U/g湿菌体的SOD高产菌株(编号为ZDF-48),它的SOD产量分别为实验出发菌株Y-8和Y-111的2.2 倍和2.4倍.经分离纯化后蛋白含量及超氧物歧化酶活性测定等研究,证明我们选育出的ZDF-48是一株生产超氧物歧化酶的优良品系.     

L-谷氨酸温度敏感突变株的选育

采用黄色短杆菌TJ1为出发菌株,根据代谢控制发酵原理,利用紫外线、硫酸二乙酯进行诱变,定向选育出具有寡霉素抗性、谷氨酸氧肟酸盐抗性的温度敏感突变株TMGO106。然后,以温度敏感突变株TMGO106和产酸率高（10.5%以上）的天津短杆菌TG961为新株,通过原生质体融合技术,成功地选育出了产酸率高的融合子CN1021（13．6g/dl,糖酸转化率达60％）,在6m^3发酵罐上中试其L－谷氨酸产量达14．6％,糖酸转化率达62．8％,并且该菌株系温度敏感型菌株,可用于谷氨酸强度发酵。     

灵芝麦角硫因高通量检测方法研究

麦角硫因(ergothioneine,EGT)基于其强抗氧化及体内消耗率低的特点,在人体内拥有多种重要的生理功能。但是在高产EGT微生物筛选和新菌株的选育研究中,现有的EGT检测方法因其步骤繁琐、使用的试剂和设备昂贵而亟待改进。本研究基于EGT的理化性质,建立了EGT-硫氰酸铁高通量快速检测体系,同时选用不同EGT产量的灵芝菌株以及灵芝融合新菌株对该检测体系的准确性进行验证。结果表明该方法可以快速准确地比较出样本间EGT产量高低,使原本需3~4天的工作缩短至2~3 h,HPLC验证结果显示,EGT-硫氰酸铁高通量快速检测体系效果良好,体系稳定。本研究结果将为高产EGT微生物的高通量筛选及高产EGT新菌株的选育提供新的方法和思路。     

Electron-cytochemical demonstration of polyphosphates and the appropriate phosphatases in the glycocalyx ofStreptomyces aureofaciens

Electron-cytochemical stainings based on Gomori type lead precipitation techniques showed that both polyphosphates (by energy dispersive analysis of X-rays) and appropriate phosphatases were present in the capsular fibrils covering the mycelium ofStreptomyces aureofaciens, producing low quantities of chlortetracycline. In light of the known differences in polyphosphate contents and glycocalyx secretion in low- and high-producing strains, our results point to new aspects of compartmentation of actinomycetal cells with respect to secondary metabolism and to the role of microbial glycocalyx in the process.