曲霉N1—14‘胞质酶活性与产L—苹果酸能力的关系

Ｌ－苹果酸（ＬＭＡ）高产突变株曲霉Ｎ１－１４’在高产酸状态下,其胞质中催化ＣＯ２固定反应的酶有四种：丙酮酸羧化酶（ＰＣ）、磷酸烯醇丙酮羧化酶（ＰＥＰＣ）、磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶（ＰＣＫ）和苹果酸酶（ＭＥ）;除ＭＥ之外,三种羧化酶的活性与ＬＭＡ产生速率呈较好的线性正相关关系;苹果酸脱氢酶（ＭＤＨ）活性比ＰＣ等酶高２￣３个数量级;琥珀酸脱氢酶（ＳＤＨ）活力则明显低,几种酶只有ＳＤＨ与发酵醪中ＬＭＡ含量     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的多生理功能

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(简称PEPC)(正磷酸:草酰乙酸羧化酶,EC4.1.1.31)进行下列催化反,这一反应首先在C_3植物菠菜叶片中发现。后来的研究证明PEPC广泛存在于高等植物的所有组织、藻类及细菌中,但在动物组织中未测出此酶。一般认为,PEPC是一个胞质酶。但也有证据指出PEPC可能与叶绿体有联系。C_3植物组织的PEPC活性是C_4植物叶片的2～5％。从不同来源的植物以及组织中得到的纯化PEPC来     

TCA循环中间产物对酿酒酵母胞内代谢关键酶活性的影响

对酿酒酵母在添加苹果酸、柠檬酸和琥珀酸的混合培养基与其在YEPD培养基中胞内丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乙醇脱氢酶的酶活力差异进行了对比分析。结果表明:添加苹果酸使胞内丙酮酸激酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乙醇脱氢酶的酶活分别下降34.82%、57.23%、39.15%、12.10%;添加柠檬酸使胞内丙酮酸激酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶的酶活分别下降50.17%、42.20%、48.40%;添加琥珀酸使胞内丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乙醇脱氢酶的酶活分别下降34.16%、34.16%、50.87%、50.87%、12.37%。丙酮酸激酶、异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶对3种有机酸的耐受性较差,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乙醇脱氢酶对3种有机酸的耐受具有选择性。     

毛竹快速生长期茎秆不同节间光合色素和光合酶活性的差异

为揭示毛竹(Phyllostachysedulis)快速生长期茎秆中的光合碳同化特征及其在不同节间的变化规律,以毛竹笋竹茎秆为材料,测定不同节间光合色素含量、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)、NADP-苹果酸酶(NADP-ME)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)以及丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)活性。结果显示,茎秆中叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素含量随节间升高均呈下降趋势,叶绿素a/b比值呈逐渐上升趋势;随着节间的升高,茎秆中Rubisco、PEPC和PPDK活性在第1–10节间显著下降,之后酶活性降幅逐渐减缓;NADP-ME活性在第1–13节间呈显著下降趋势,之后酶活性趋于平稳;NADP-MDH活性在第1–25节间显著下降。PEPC/Rubisco活性比值随节间升高而不断增加,其范围介于18.37–65.09之间,明显大于典型C3植物中的活性比值。上述结果表明,茎秆不同节间的光合碳同化能力存在明显差异,中、下部节间生长相对较快;茎秆中存在多种C4酶且活性较高,这为此时期茎秆中存在C4光合途径提供了有力证据。     

苏打盐碱胁迫对甜高粱植株有机酸含量的影响

为确定以Na2CO3和Na HCO3为主要成分的苏打盐碱胁迫对甜高粱植株有机酸含量的影响,研究了盐碱胁迫下甜高粱品种314B和M-81E地上部和根部有机酸含量变化及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性。结果表明:盐碱胁迫后,甜高粱地上部和根部均检测到草酸、酒石酸、甲酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸及柠檬酸等8种有机酸,琥珀酸仅在根中被检出;在苏打盐碱胁迫后,除极少数有机酸含量略微增加外,其余各酸含量降低,且随胁迫浓度增加含量下降程度增大;低浓度胁迫时PEPC酶活性升高,而高浓度时则降低;有机酸含量与PEPC酶活性不存在相关性,但PEPC酶活性升高,有机酸含量下降幅度小,反之,有机酸含量大幅下降;从有机酸含量及PEPC酶活性可以看出,耐性强品种M-81E受苏打盐碱胁迫的伤害小于耐性弱品种314B。     

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的敲除对于谷氨酸棒杆菌V1生理代谢的影响

【目的】L-缬氨酸生物合成的前体物质是丙酮酸。为了增加磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的代谢流向,优化L-缬氨酸前体物质的供应,以一株积累L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌V1(Corynebacterium glutamicum V1)为对象,构建磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因敲除的重组菌株C.glutamicum V1-Δpepc,并研究pepc敲除后菌株生理特性的改变。【方法】运用交叉PCR方法得到pepc基因内部缺失的同源片段Δpepc,并构建敲除质粒pK18mobsacB-Δpepc。利用同源重组技术获得pepc基因缺陷突变株C.glutamicum V1-Δpepc。采用摇瓶发酵对C.glutamicum V1-Δpepc进行发酵特性的研究。对谷氨酸棒杆菌模式菌株C.glutamicum ATCC 13032、出发菌株C.glutamicum V1和敲除菌株C.glu-tamicum V1-Δpepc的丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)、丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydro-genase,PDH)、丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase,PC)分别进行测定和分析。【结果】PCR验证以及PEPC酶活测定都表明筛选到pepc缺陷的突变菌株C.glutamicum V1-Δpepc,摇瓶发酵结果表明,突变菌株C.glutamicum V1-Δpepc不再积累L-缬氨酸而是积累L-精氨酸达到7.48 g/L。酶活测定结果表明出发菌株的PDH和PC酶活均低于模式菌株C.glu-tamicum ATCC13032和重组菌株C.glutamicum V1-Δpepc,出发菌株的PK与PEPC酶活与模式菌株没有较大的差异。【结论】研究表明,通过切断PEPC参与的三羧酸循环的回补途径,增加磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的流向使丙酮酸向TCA循环的流量增加,精氨酸的累积量提高。同时,以丙酮酸为前体的L-缬氨酸和丙氨酸的积累量降低。     

‘鸭梨’ב京白梨’杂交后代果实有机酸积累差异及相关酶活性的研究

该研究以‘鸭梨’ב京白梨’杂交后代高酸个体(GS-Y14)和低酸个体(DS-Y182)为试材,系统分析了果实发育过程中有机酸积累动态及相关酶活性的变化特征。结果表明:(1)GS-Y14属于苹果酸优势型果实,DS-Y182属于柠檬酸优势型果实,且成熟时两者在总酸含量上表现出的差异主要是由于苹果酸含量的差异所致。(2)苹果酸酶(NADP-ME)是苹果酸形成的关键酶,在梨果实发育过程中NADP-ME起分解作用,且该酶活性在两类个体果实发育后期差异显著,即NADP-ME是引起GS-Y14和DS-Y182中苹果酸含量不同的主要原因,进而导致成熟时两类个体果实酸积累的差异。(3)梨果实磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性的升高有利于其柠檬酸的合成,而柠檬酸合酶(CS)是影响其柠檬酸含量变化的关键酶;细胞质乌头酸酶(Cyt-ACO)和线粒体乌头酸酶(Mit-ACO)早期对果实柠檬酸的含量变化影响较小,后期异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)活性对柠檬酸在后代个体中的积累有一定影响。     

果梅果实发育过程中有机酸含量及相关代谢酶活性的变化特征

以优选荔波野生梅单株‘荔波-3’和‘荔波-11’为试验材料,采用高效液相色谱法(HPLC)测定了果梅果实在发育过程中有机酸含量及相关代谢酶活性变化特征。结果表明:(1)‘荔波-3’和‘荔波-11’果梅果实中柠檬酸和苹果酸主要在果实发育后期积累,花后140d两品种的柠檬酸积累量达到最大,且果实中总酸的积累量也相应的达到最大值。(2)柠檬酸积累量与柠檬酸合成酶(CS)活性呈极显著正相关关系,‘荔波-11’因CS活性高于‘荔波-3’,使得其果实成熟时的柠檬酸含量高于后者。(3)苹果酸积累量与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)活性呈极显著正相关关系,但与NADP-苹果酸酶(NADP-ME)活性呈负相关关系;在花后45~100d内,果梅果实中PEPC和NAD-MDH活性迅速升高,而NADP-ME活性相对较低,使苹果酸积累量迅速增加;在花后120~140d,‘荔波-3’果实中PEPC、NADP-MDH活性显著高于‘荔波-11’,而其NADP-ME活性低于‘荔波-11’,导致成熟时‘荔波-11’的苹果酸含量高于‘荔波-3’。可见,果梅果实的有机酸主要在果实发育后期积累,有机酸积累差异受多个酶协同调控;苹果酸的积累差异主要由NAD-MDH、PEPC和NADP-ME活性协同变化引起,柠檬酸积累差异主要受CS活性变化影响。     

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶介导的草酰乙酸回补途径对谷氨酸棒杆菌V1氨基酸代谢的影响

【目的】谷氨酸棒杆菌是工业生产氨基酸的主要菌株,以缬氨酸高产菌株谷氨酸棒杆菌V1为研究对象,探讨磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)介导的草酰乙酸回补途径对菌株生理特性以及主要氨基酸代谢流量的影响。【方法】通过基因工程手段,在谷氨酸棒杆菌V1中过表达pepc(编码PEPC)和pck(编码PCK),比较重组菌与出发菌关键酶活性、发酵特性以及主要氨基酸积累量变化。【结果】构建两株重组菌V1-pepc(强化草酰乙酸回补途径)和V1-pck(弱化草酰乙酸回补途径),重组菌生长均较出发菌延缓,总生物量、葡萄糖和硫酸铵消耗基本不变;过表达pck,PCK活性提高22.8%,丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸、精氨酸积累量分别提高了11.8%、17.2%、27.8%和19.5%;过表达pepc,PEPC活性提高27.5%,同时PC活性降低12.9%,天冬氨酸族和谷氨酸族氨基酸的整体流量变化不大,丙氨酸族氨基酸的整体流量降低了14.7%。【结论】丙氨酸族氨基酸受此回补途径影响较大,天冬氨酸族氨基酸受此影响较小。     

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PCK1)的研究进展

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)编码的胞质磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, PCK1)是调节糖异生过程中的限速酶,参与维持血糖水平。它广泛参与糖代谢、脂代谢、衰老、糖尿病以及肿瘤细胞增殖和凋亡等代谢和生物学进程。本文对PCK1在以上物质代谢和生物学进程中的研究进展作一综述,为进一步探究PCK1参与糖尿病、肿瘤及衰老等疾病的分子机制提供理论基础,也为PCK1作为新的判断肿瘤和糖尿病的分子标志物和治疗靶点提供理论依据。     

L-苹果酸产生菌筛选及高产突变株诱变选育

通过广泛收集和分离,获得根霉属(Rhizopus)、曲霉属(Aspergillus)及裂褶菌属(Schizophyllum)等属菌株897株。产酸指示平板上的变色圈测定结果表明,它们中间628株为产酸菌。通过纸层析对产酸菌发酵液酸谱的分析,获得129株L-苹果酸产生菌,经进一步测定发酵液中L-苹果酸的含量,筛选出以葡萄糖为原料,摇瓶发酵140小时,L-苹果酸产率48．37g／L,对糖转化率48．37×10^-2 的菌株LMO2。经初步鉴定,这一菌株为曲霉(Asper-gillus sp.)以LM02作为出发株,采用亚硝基胍、自然污染细菌、甲基磺酸乙酯及紫外线进行诱变处理,选育出葡萄糖为原料,L-苹果酸产率较高的突变抹N1-14、N1-14、NE1412、NU1416及NU1419。其中N1-14 的L-苹果酸产量最高,比出发株提高46．2×10^-2。N1-14 的菌丝生长速度快,产孢能力强,摇瓶发酵葡萄糖140小时,平均L-苹果酸产率为72．53g／L,对糖转化率53．74×10^-2。全发酵液经薄层层析测定,不含黄曲霉毒素。发酵产物分离提纯后,得到白色粉末状结晶,经纸层析、质谱及红外光谱测定,证明为L-苹果酸。     

温特曲霉转富马酸为L-苹果酸的初步研究

从大量霉菌中选育到一株具有较高富马酸酶活性的温特曲霉(Aspergilluswentii)A     

温特曲霉转富马酸为L-苹果酸的初步研究*

从大量霉菌中选育到一株具有较高富马酸酶活性的温特曲霉(Aspergillus wentii) A5-61。在摇瓶培养条件下,32℃ 96小时,产L-苹果酸达10.49g/100ml,对富马酸的转化率达90.80%。利用菌体细胞,进行酶转化试验,结果表明：1.6g湿菌体接入25ml含富马酸10.0%（用NaOH中和至pH7.0）的转化液中,35℃16～24小时,连续转化三次,分别产生L—苹果酸9.61g/100ml、9.73g/100ml、6.93g/100ml。对菌体整体细胞酶学性质的研究表明,其最适反应温度35℃,最适反应pH7.0,Cu2＋对该酶有明显的抑制作用,该酶的Km＝0.154mol/L,Vmax＝0.0571mol/L·h。     

发酵液中L-苹果酸批量定量测定研究

摸索出发酵液中L-苹果酸批量定量测定的简单快速方法。该方法为(1)采用微量注射器将发酵液定量点样,在展开剂中进行纸层析;(2)用显色剂喷雾显色;(3)剪下已显色的L-苹果酸斑,置5ml去离子水中洗脱3小时;(4)取出1ml过滤洗脱液,加入6ml 96×10^-2硫酸和0.1ml 1.0×10^-2α-萘酚摇匀;(5)置100℃水浴中加热60分钟;(6)冷却后在波长476nm处比色测定。     

黄曲霉发酵薯干粉水解液生产L－苹果酸

经选育和诱变得到一株产苹果酸的黄曲霉菌ＴＨ５００７,通过发酵条件的优化,以薯干粉的水解液为主要原料,发酵５ｄＬ－苹果酸可达到６％左右。在总酸中苹果酸含量平均达７２％以上,杂有机酸主要是柠檬酸,延胡索酸的含量在０．０２％以下。补糖发酵比分批发酵产酸性能更佳。