基因工程TNF菌种稳定性观察

对重组的ｐＲＬ－ｈＴＮＦ／Ｊｍ１０３工程菌菌种按规程进行了５０代传代，并进行了一系列检测，结果表明：我们目前所用的工程菌经５０代传代后，用还原型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳其表达量占菌体蛋白的７．８～８％，生物学活性为７．８×１０５－１．７×１０６ＩＵ／ｍｌ，与原代菌种基本一致。一般生物学性状如革兰氏染色及质粒内切酶图谱与原始菌种无变异。电镜检查经传代的工程菌与原始菌种形态一致，菌体内部结构相同，无支原体、病毒样颗粒及其它微生物污染。     

HEV ORF2重组菌菌种的稳定性及融合蛋白的应用

对HEVORF2 (HumanHepatitisEopenreadingframe)重组菌菌种进行稳定性研究并将其表达的融合蛋白用于酶标试剂。将重组菌种传 10 0代次 ,每隔 10代取样检测蛋白表达、质粒性状、遗传稳定性、染色特性、菌落形态及电镜检查。将其表达的融合蛋白经层析纯化用于酶标试剂中。经传代的各代菌体与菌种多项指标差异不显著 ,酶标试剂有敏感度及特异性 ,此菌种可作为表达融合蛋白ORF2 组装酶标试剂而长期使用。     

重组质粒pUDKH工程菌库的制备及检定

目的:pUDKH是由本实验室构建的携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的真核表达质粒,具有治疗肢体动脉闭塞病的应用潜能。为了生产制备重组质粒pUDKH,须建立菌种库并对其进行质量检定。方法:将质粒pUDKH转化大肠杆菌DH5α,经筛选后制备成初始菌种库和工作菌种库,对菌种进行革兰染色、电镜、抗生素抗性、遗传稳定性、质粒拷贝数、生化反应等检定。结果与结论:菌种生产pUDKH的产量较高,无支原体及其他微生物污染,40代次内菌种性状、遗传稳定性、质粒拷贝数均稳定,可作为工艺生产用菌种。     

表达人胰高血糖素样肽前药工程菌遗传稳定性

通过传代培养的方法,研究高表达重组人胰高血糖素样肽前药(Pro-rhGLPs)的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET41a(+)-hGLPs的遗传稳定性,观察菌体和菌落形态,比较在有无选择压力下的质粒稳定性,酶切和测序鉴定重组基因片断的正确性,SDS-PAGE电泳证实重组蛋白质的表达量的稳定性,在C57BL/6小鼠上进行葡萄糖耐量实验检测重组蛋白生物学活性。结果显示:此工程菌连续传代过程中,保持大肠杆菌的典型特征,各代质粒的酶切鉴定和测序正确,重组蛋白表达水平及生物活性也无显著差异。因此,工程菌E.coliBL21(DE3)/pET41a(+)-hGLPs具有良好的遗传稳定性。     

重组大肠杆菌pET-28(a)/LF/BL21的传代稳定性

目的通过菌株传代方法观察携带致死因子(lf)基因的重组大肠杆菌pET-28(a)/LF/BL21的传代稳定性。方法将重组菌株pET-28(a)/LF/BL21在含有卡那霉素的LB培养基中连续传代至100代,比较第1、10、20、50、100代菌株的菌落形态、细菌形态、生化特性、质粒保有率、生长速度等的差异;取各代次菌株提取质粒DNA且分别进行双酶切及PCR鉴定、DNA测序;诱导表达各代次菌株,比较各代次菌株的重组rLF蛋白的表达水平及免疫反应性。结果各代次菌株菌落形态、生化特性、生长速度等方面与原始种子库无明显差异;在传至100代时的质粒保有率为76%;各代次菌株重组质粒电泳图谱、酶切图谱、PCR图谱未改变,未见lf基因变异;各代次菌株的总蛋白电泳图谱r、LF蛋白表达量r、LF蛋白的免疫反应性与原始种子库无明显差异。结论重组大肠杆菌pET-28(a)/LF/BL21具有较好的传代稳定性。     

重组别藻蓝蛋白β亚基（His-β~（APC））表达菌株遗传稳定性的研究

工程菌株的遗传稳定性在目的产物的生产应用中至关重要。为了确定工程菌株的遗传稳定性,通过对重组别藻蓝蛋白β亚基（His-βAPC）生产菌株E.coliJM109（DE23）/pET28α-βAPC进行了菌体生长量的测定,平板划线,质粒酶切,产物鉴定等研究,检验了该工程菌质粒的稳定性。通过实验得到如下结果：该工程菌株在没有抗生素选择压力下传代,质粒丢失率为5代6%,10代8%,15代9%,20代15%;该菌株经固体平板连续划线传代20次后,菌落大小和形态基本不变;质粒经BamHⅠ和HindⅢ酶切后进行琼脂糖凝胶电泳结果显示该菌株携带的重组质粒目的片段在传代前后没有发生变化;经诱导培养后,His-βAPC在原代和第5、10、15和20代宿主菌中都可以表达,表达量没有明显差别,且表达产物在SDS-PAGE中的带型基本一致。以上结果表明,该工程菌质粒具有结构稳定性和分裂不稳定性。     

鸡γ-干扰素基因重组质粒在工程菌株中的稳定性研究

本文通过传代的方法研究了鸡γ-干扰素基因的重组质粒pET-ChIFN-γ在工程菌CH1中的遗传稳定性.结果表明重纽质粒在没有筛选压力下存在质粒不稳定性,100代时质粒稳定性只有69%.适当的筛选压力可以显著降低质粒的遗传不稳定性,100代时稳定性提高到95%.各代重组菌株在生长性能、质粒酶切图谱、蛋白表达等方面均保持一致,未见明显差异.生物活性检测原代和100代均达到1.0×105 IU/mL以上.以上结果表明重组质粒pET-ChIFN-γ在工程菌株CH1中具有良好的遗传稳定性,其质粒遗传不稳定性可由适当的筛选压力来控制.     

解淀粉芽胞杆菌SSY1菌株的稳定性研究

目的测定产纤维素酶解淀粉芽胞杆菌SSY1株的稳定性。方法在适宜生长条件下连续传代30代。分别取第2、10、15、20、25和30代细菌,对其进行染色镜检、生化试验、药敏试验、产纤维素酶特性及动物安全性试验观察。结果传至第30代,细菌的形态、生化特性、产纤维素酶特性及药敏特性均未发生明显变化。结论产纤维素酶解淀粉芽胞杆菌SSY1株稳定性良好,有望成为中药发酵菌种。     

酸马奶中乳酸菌的鉴定及生物学特性的研究

[目的]对从酸马奶中分离出来的10株乳酸菌进行鉴定和生理生化特性研究,为工业生产筛选特性优良的菌种.[方法]通过形态学观察、生理生化特性、分子生物学特性及其对致病菌抑制作用的研究对其进行鉴定,并筛选特性优良菌株.[结果]10株乳酸菌分别为2株Lactobacillus plantarum、2株Enterococcus villorum、2株Enterococcus dispar、3株Enterococcus durans和1株Enterococcus raffinosus;其对Staphylococcus aureus、Escherichia coli和Enteritidis bacillus有不同程度的抑制作用.[结论]菌株HZ24、HZ25具有良好的生物学特性和益生功能,可以应用到食品发酵工业生产中.     

特异性杀虫基因Bt cry3A在桑粒肩天牛幼虫两种肠道常驻内生菌中的转化和表达

[目的]将特异性杀虫毒蛋白基因Bt cry3A转入桑粒肩天牛(Apriona germari Hope,Ag)幼虫肠道常驻内生菌中,构建能在天牛幼虫肠道中定殖并表达特异性杀虫基因Bt cry3A的工程菌.[方法]以传统方法和16S rDNA分子生物学分析等方法分离、鉴定Ag幼虫肠道优势的常驻内生菌,从中筛选出适合转化的候选菌株.利用电转化技术将含有对鞘翅目昆虫具专一性毒力Bt cry3A基因的Escherichia coli-Bacillus thuringiensis穿梭表达质粒pHT305a和pHT7911分别转入Ag幼虫肠道常驻内生菌短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis Ag12,Ag12)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Ag13,Ag13)中.[结果]从Ag幼虫肠道共分离获得18个不同种的可培养细菌菌株,并从中选取菌株Ag12和Ag13作为出发菌株转入Bt cry3A基因.经质粒稳定性试验、转化子生长特性测试、伴胞晶体电镜检测、毒蛋白SDS-PAGE分析、工程菌定殖性分析以及生物毒力测试,结果显示cry3A基因已经成功转入Ag幼虫的常驻内生菌短短芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌中,并且工程菌Ag12-305a、Ag13-305a、Ag 12-7911和Ag13-7911都能在天牛幼虫肠道内稳定生长、繁殖并表达分子量约65kDa的伴孢晶体杀虫蛋白Cry3A.[结论]Bt cry3A基因已成功转入桑粒肩天牛幼虫肠道优势常驻内生菌中,获得了四株能在桑粒肩天牛幼虫肠道内定殖,并能表达目的杀虫基因Btcry3A的转基因工程菌.     

E.coli木糖异构酶基因的克隆及表达条件的优化

采用PCR技术以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板扩增得到木糖异构酶基因xylA,连接到载体pET-22b( ),得到重组质粒pET-22b( )-xylA。将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,重组菌株经IPTG诱导后,通过半胱氨酸-咔唑法测得木糖异构酶活力。每mL发酵液中重组菌株显示出酶活力约为0.84 U。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的5×104(相对分子质量)特异性蛋白质条带。     

Synthesis of GDP-mannose using coupling fermentation of recombinant Escherichia coli

Glucokinase (glk), phosphomannomutase (manB), and mannose-1-phosphate guanylytransferase (manC) are needed for the biosynthesis of GDP-mannose. A recombinant E. coli strain over-expressing these three genes was constructed to produce guanosine 5'-diphosphate (GDP)-mannose, the donor of GDP-fucose, an essential substrate for synthesis of fucosyloligosaccharides. In addition, the glk, manB, and manC genes were individually cloned into the expression vector pET-22b (+) to construct three recombinant E. coli strains pET-glk, pET-manB and pET-manC, respectively. Fermentation of the recombinant strain BL21/pET-glk-manB-manC had a conversion rate of 23% from mannose to GDP-mannose under IPTG induction, while coupling fermentation of the three recombinant strains BL21/pET-glk, BL21/pET-manB, BL21/pET-manC resulted in a conversion rate of 33% under the same induction conditions.     

西藏株小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

【背景】小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病,严重威胁我国养羊业的发展。【目的】原核表达PPRVH蛋白,并制备其多克隆抗体。【方法】根据GenBank中PPRV西藏株h基因序列,对其进行密码子大肠杆菌偏爱性优化,采用两步PCR法全化学合成全长h基因。将测序验证正确的h基因克隆至原核表达载体pET-28a、pET-30a、pET-32a,转化E. coli BL21(DE3)并利用IPTG诱导H蛋白表达。以经SDS-PAGE割胶纯化的重组H蛋白免疫新西兰大白兔制备抗PPRV H蛋白多克隆抗体。【结果】重组E. coli [pET-28a(-30a,-32a)-H]表达的重组H蛋白相对分子质量分别约为70、68和86 kD;诱导7 h时PRRV H蛋白表达量最高,而且主要以包涵体形式表达;重组E.coli(pET-30a-H)表达的H蛋白经SDS-PAGE割胶纯化后免疫新西兰大白兔制备的多抗血清能与表达的重组H蛋白发生特异性反应;ELISA法检测抗体效价在1:6400-1:25600之间。【结论】原核表达了PPRVH蛋白,并制备了高效价的抗H蛋白多克隆抗体,为进一步研究PPRV H蛋白的功能及H蛋白的线性B细胞表位作图奠定了基础。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

用E．coli表达Canstatin—N及其表达条件优化

以重组质粒DET—CN为模板设计引物CASN1N和CASN2,PCR方法扩增约267bp的人血管能抑素N端1～89氨基酸基因片段,用EcoRI和Sal I双酶切将其克隆进pET-22b（＋）载体获得重组表达质粒pET-22b（＋）一CN,转化E．coliBL21（DE3）,用IPTG诱导表达Canstatin-N,产物以包涵体形式存在。本文在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导培养时间对目标蛋白表达的影响,结果表明IPTG的最佳诱导浓度为0．1mmol／L;37℃下诱导培养2h时产物表达量最高。纯化获得的融合hiS6的重组Canstatin—N具有免疫和抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管生成活性。     

Novel method for expression and purification of human pigment epithelium-derived factor with biological activities in Escherichia coli

We developed a novel method for the expression and purification of recombinant human PEDF in Escherchia coli, and proved it to be simple, convenient, and cheap to obtain this protein with biological activity intact. Human PEDF gene, amplified by PCR from human retinal cNDA library, was cloned into the prokaryotic expression vector pET-22b(+). The recombinant pET-22b(+)/PEDF was expressed in E. coli strain BL21(DE3). The recombinant protein showed a molecular weight of about 50 kDa and was mainly in the form of inclusion bodies according to SDS-PAGE and Western blot analysis. The insoluble rPEDF was solublized from inclusion bodies by denaturation using 6 M urea, purified by His-tag affinity chromatography, and renatured to natural structure by dialysis in the presence of DTT. The rPEDF could cell-type-specifically inhibit HRCEC proliferation in a dose-dependent manner and induce HRCEC apoptosis.     

蜡样芽胞杆菌M22铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆及表达

采用PCR技术 ,从蜡样芽胞杆菌M2 2基因组DNA扩增到长 132 0bp的基因片段 .该片段含编码 179个氨基酸残基的开放阅读框 ,推定蛋白序列与报道的BacillusanthracisCu ,Zn SOD序列有96 %同源性 ,其中N端 16个氨基酸残基推定为信号肽序列 .将Cu ,Zn SOD编码区插入载体pET 2 2b(+ )构建表达载体pET 2 2b sodC ,转化E .coliBL2 1(DE3) ,IPTG诱导融合蛋白表达 .SDS PAGE显示 ,融合蛋白表观分子质量约 2 4kD ,占菌体裂解液中总蛋白的 2 1 3% .将此表达载体转入SOD缺陷型大肠杆菌PN132 ,赋予了该菌株对paraquat的抗性 .NBT光抑制法测定SOD活性显示 ,与PN132无SOD活性相比 ,重组子在IPTG诱导前SOD活性极低 (1 79U/mg) ,诱导后活性高达 6 9 76U/mg .非变性电泳结果显示 ,该酶活性不同程度地受到 5mmol LH2 O2 和 5mmol LKCN的抑制     

嗜碱性芽孢杆菌PB92碱性蛋白酶分别在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达

从Bacillus alcalophillus PB92中扩增出碱性蛋白酶基因Mapr,Mapr分别插入到大肠杆菌载体pET-22b( )和枯草芽孢杆菌载体pWB980中构建成重组分泌型表达载体pET22b( )-Mapr、pWB980-Mapr。碱性蛋白酶基因分别在大肠杆菌宿主BL21和枯草芽孢杆菌DB104中得到表达。SDS-PAGE分析,重组蛋白酶的分子量为28kD。在大肠杆菌,所得酶活为231U/ml,而在枯草芽孢杆菌,其酶活为1563U/ml。大概是由于碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌折叠成熟机制与大肠杆菌的不同造成的。     

肺炎球菌表面蛋白的克隆表达与免疫原性研究

从肺炎球菌YF05中扩增了肺炎球菌表面蛋白A（PspA）和肺炎球菌表面黏附素A（PsaA）基因,以pET27b(+)为载体构建了重组表达质粒的表达系统后,转化入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的75％,结果显示：表达的PspA蛋白和PsaA蛋白,分子量分别约为75kDa和37kDa。成功表达的重组蛋白具有较强的免疫活性和交叉免疫效果。