高纯度α_1-抗胰蛋白酶的提取、抗血清的制备及其火箭免疫电泳测定

α_1-抗胰蛋白酶(α_1-AT)是肝细胞分泌的一种糖蛋白,是血浆蛋白电泳α_1球蛋白的主要成份。它能抑制多种蛋白酶,如胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、纤维蛋白溶酶等的活性。α_1-AT在血浆中含量较高,在组织中广泛存在,对维持机体正常生理功能,防止组织过度破坏起重要作用。本文报道经我们改良的高纯度α_1-AT提取方法、抗血清的制备及其火箭免疫电泳定量测量方法。一、材料与方法 1、α_1-AT、蛋白质测定方法α_1-AT按Eriksson法测定胰蛋白酶抑制容量(TIC)。结晶胰蛋白酶为Sigma产品,胰蛋白酶的特异性     

重要的疾病急性期反应物——C-反应蛋白

急性炎症时血液有特征性改变,这包括红细胞沉降速度的加快,C-反应蛋白、血清类粘蛋白、结合珠蛋白、α_1-胰蛋白酶、抗胰凝乳蛋白酶、铜兰蛋白、纤维蛋白原、氨基己糖、粘多糖、血清淀粉样物质A(serum amyloid A,SAA)等的出现或升高,运铁蛋白、α_1-脂蛋     

猪血浆α1-抗胰蛋白酶的分离纯化

α_1-抗胰蛋白酶(α_1-Antitrypsin,简称α_1-AT)是由肝细胞分泌的一种糖蛋白,是存在于动物血液中的一种重要的蛋白酶抑制剂,它能抑制多种丝氨酸类蛋白水解酶,占血浆胰蛋白酶抑制总活力的90％以上。α_1-AT通过调节蛋白水解酶的活性而参与机体的一系列生理活动,如血液凝固、纤维蛋白溶解、组织激肽释放、细胞融合、大分子装配和免疫反应等过程,对防止组织过度损伤有重要作用。目前国际上对人的α_1-AT研究较多,而对猪α_1-AT的研究甚少,仅见     

小鼠层粘连蛋白α5 LG3组件的表达及纯化

目的:用原核表达的方法获得带有6×His标记的小鼠层粘连蛋白α_5 LG3组件的重组蛋白。方法与结果:从小鼠心肌组织中提取总RNA,利用RT-PCR扩增出小鼠层粘连蛋白α_5 LG3组件的cDNA片段,并与pET-28a载体连接,构建重组表达质粒pET-LG3,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为小鼠层粘连蛋白α_5 LG3组件基因的成熟肽编码序列。用IPTG诱导,LG3蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了表达,并经Ni-NTA层析柱获得纯化。结论:层粘连蛋白α_5 LG3组件的重组蛋白得到表达和纯化,为后续相关研究奠定了基础。     

α_1抗糜蛋白酶

<正> 血浆中含有几十种蛋白质。其中含量最多的是清蛋白,其次为免疫球蛋白。居于第三位的是一组蛋白酶抑制物,关于它们的生物学意义,有些至今尚未明确。引起人们对这类血浆蛋白质的兴趣始于60年代初。当时有人报道α_1抗胰蛋白酶(α_1—AT)的缺乏与肺气肿的发生有关。该作者用琼脂电泳法检查了六例肺气肿思者的血清,发现在α_1区缺少一种成分,免疫电泳证实它是α_1—AT。直到1970年,西德的N.Heimberger采用了一种特别的生化分析方法,才首次比较系统地分离和鉴定了几种存在干血浆内的蛋白酶抑制物。这个方法把电泳和酶     

人血浆 α_2-巨球蛋白的分离纯化

α_2-巨球蛋白(α_2-Macroglobulin,简称α_2M)是一种高分子量的糖蛋白,含糖量为8-11％,分子量为725,000,等电点为5.5,已知每克分子α_2M含有4.8克原子锌,占血浆总锌含量的20％.α_2M是血浆中重要的蛋白酶抑制剂.含量约为2毫克/毫升,能抑制四种内肽酶的活性.α_2M使蛋白酶失活的机理尚未彻底弄清,文献报道α_2M与胰蛋白酶、凝血酶、纤溶酶及激肽释放酶反应时,可从α_2M分子上游离出一段多肽(MW:85000),这一裂解作用使α_2M分子     

缺氧大鼠心肌α1,β肾上腺素能受体的变化

为了探讨α_1、β肾上腺素能受体在大鼠缺氧性心脏肥大进程中的作用,本研究应用放射配基结合法观察了不同缺氧时间大鼠心室α_1、β肾上腺素能受体变化的动态过程,同时也观察了α_1、β受体阻断剂在预防缺氧性心肌肥大发生中的作用。缺氧10d后,测定右心室重量及组织学检查未见右心室肥大,但此时心室肌α_1受体数量从对照组的27.49±1.25增加到33.80±0.90fmol/mg蛋白(P<0.05);β受体从对照组的51.80±7.60下降到25.10±2.30fmol/mg蛋白(P<0.01)。缺氧20和30d后α_1受体进一步增加到40.70±1.43和32.30±1.96fmol/mg蛋白(P<0.05);β受体分别为27.90±2.30和42.80±1.70fmol/mg蛋白(P<0.05)。缺氧20和30d后右心室重量指数明显高于对照组,在整个缺氧过程中α_1、β受体的亲和性(K_d)未见明显变化,未见左心室肥大。缺氧同时应用α_1受体阻断剂(哌唑嗪4mg·kg~(-1)·d~(-1))30d,可明显预防缺氧所致的右心肥大;而β受体阻断剂(心得安10mg·kg~(-1)·d~(-1))没有此种作用。由此可见,在缺氧所致右心肥大之前,心肌α_1受体数量即明显升高,α_1受体阻断剂可以预防缺氧引起的右心肥大。     

脉络膜黑色素瘤中整合素α_vβ_3表达的研究

目的:整合素α_vβ_3为整合素家族成员之一,是一类跨膜粘附分子,其在多种肿瘤细胞及新生内皮血管细胞中高表达而在成熟血管内皮、上皮细胞及正常细胞中表达较低或无表达。基于这些特征,整合素α_vβ_3近年来成为分子影像研究的热点之一。鉴于整合素α_vβ_3在人眼脉络膜黑色素瘤中是否存在表达尚不可知,本课题拟研究整合素α_vβ_3在人脉络膜黑色素瘤中表达情况,为以整合素α_vβ_3为基础的分子显像提供理论基础。方法:培养人源脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1,使用蛋白免疫印迹方法检测整合素α_vβ_3在OCM-1中表达水平,并使用免疫组化方法检测人脉络膜黑色素瘤病理切片中整合素α_vβ_3表达分布。结果:蛋白免疫印迹实验表明在OCM-1细胞株中存在整合素α_vβ_3表达,其表达水平介于已知高表达整合素α_vβ_3的头颈鳞癌细胞株HEP-2和较低表达整合素α_vβ_3的头颈鳞癌细胞株CNE-1之间,免疫组化方法检测人脉络膜黑色素瘤病理切片中也存在整合素α_vβ_3表达。结论:人脉络膜黑色素瘤中具有整合素α_vβ_3表达,可以为后期研究基于整合素α_vβ_3的分子显像技术提供依据。     

人血浆α_2-巨球蛋白的研究概况

α_2-巨球蛋白(α_2-Macroglobulin,简称α_2-M)是人体中重要的血浆蛋白之一,能与多种蛋白水解酶反应,是血浆中含量最多的蛋白酶抑制剂。α_2-M通过对蛋白酶水解活性的调节而参与凝血、纤溶、激肽释放、炎症及免疫等一系列生理及病理过程。因此,α_2-M的研究对某些疾病发病机制的了解具有重要的意义。 1953年,Jacobsson首先报道了α_2-M。此后对其组成、结构、理化性质及生物活性等方面的研究都有较详细的报道和论述。国内这     

大鼠肝癌中α_2-巨球蛋白等几种分泌性蛋白基因表达的变化

用Northern blot方法对二乙基亚硝胺所诱发的大鼠肝癌中内源性蛋白酶抑制因子α_2-巨球蛋白(α_2-M)、非特异性免疫抑制剂α_1-酸性糖蛋白(α_1-AGP)及雄性激素正调控的α-2u球蛋白(α-2u)三种分泌性蛋白基因表达情况进行了分析。结果表明在大部分(14/16)肝癌样品中α_2-M RNA水平显著降低;而α_1-AGP RNA水平显著高于正常对照水平;α-2u RNA水平明显下降,但在某些雄性大鼠肝癌样品中该基因却有一定程度的表达。这些结果说明,一些肿瘤宿主血浆中α_2-M水平的显著下降及α_1-AGP水平的明显升高分别是由于基因表达活性的下降及升高所致。α-2u基因表达的异常提示,在癌变过程中机体的内分泌功能发生了某些变化。     

人血浆α_2巨球蛋白的研究概况

α_2-巨球蛋白(α_2-Macroglobulin,简称α_2-M)是人体中重要的血浆蛋白之一,能与多种蛋白水解酶反应,是血浆中含量最多的蛋白酶抑制剂。α_2-M通过对蛋白酶水解活性的调节而参与凝血、纤溶、激肽释放、炎症及免疫等一系列生理及病理过程。因此,α_2-M的研究对某些疾病发病机制的了解具有重要的意义. 1953年,Jacobsson首先报道了α_2-M.此后对其组成、结构、理化性质及生物活性等方面的研究都有较详细的报道和论述.国内这     

水稻种子萌发过程中α 淀粉酶与萌发速率关系的分析

用丙烯酰胺凝胶电泳技术和3,5_二硝基水杨酸（DNS）测定还原糖法,对不同萌发时间农垦58F、农垦58S和农垦58种子胚中α_淀粉酶同工酶及其酶活性变化进行研究。0～36小时萌发过程中,农垦58F和农垦58S α_淀粉酶活性高于农垦58。胚中检测出五条酶。A2、A4和A5为上述种子共有酶带。A3为农垦58F和农垦58S特异性酶带。A1为农垦58特异性酶带。据此认为α_淀粉酶对水稻种子萌发速度起重要调控作用。A1和A3可能是调控种子发芽快慢的重要酶分子。     

1α,25(OH)_2D_3对大鼠关节软骨细胞蛋白聚糖和蛋白聚糖酶代谢的调节作用

目的在细胞水平,探讨1α,25(OH)_2D_3对受到多种促炎症因子干预的大鼠关节软骨细胞蛋白聚糖合成和分解的调节作用。方法分别使用促炎症因子IL-1α、IL-1β及TNF-α对大鼠关节软骨细胞进行炎症诱导,使用不同剂量的1α,25(OH)_2D_3对正常及炎症状态下的软骨细胞进行干预,使用CCK8、流式细胞术分析、real time-PCR及western blot等方法分别检测软骨细胞的增殖活性和凋亡水平,以及软骨细胞中蛋白聚糖和蛋白聚糖酶-1/2即ADAMTS-4及ADAMTS-5的mRNA和蛋白表达水平变化,从而评估1α,25(OH)_2D_3对大鼠关节软骨细胞蛋白聚糖和蛋白聚糖酶代谢的调节作用。结果 IL-1α、IL-1β及TNF-α显著降低了软骨细胞的增殖活性并增加了软骨细胞的凋亡水平,以及降低细胞中蛋白聚糖的mRNA和蛋白表达水平,增加ADAMTS-4及ADAMTS-5的mRNA和蛋白表达水平。1α,25(OH)_2D_3的干预可以增加炎症状态下软骨细胞的增殖活性、降低软骨细胞的凋亡水平,以及增加炎症状态下软骨细胞内蛋白聚糖的mRNA和蛋白表达水平,降低ADAMTS-4及ADAMTS-5的mRNA和蛋白表达水平,并呈一定剂量依赖性。但是,1α,25(OH)_2D_3的干预并不影响正常软骨细胞的增殖、凋亡。结论维生素D能促进炎症状态下的软骨细胞蛋白聚糖的合成代谢并抑制蛋白聚糖酶活性,从而为关节软骨提供更全面的保护。     

短双歧杆菌α-D-半乳糖苷酶基因aga1在大肠杆菌中的高效表达

短双歧杆菌（Bifidobacterium breve 203）α_D_半乳糖苷酶基因(aga1)被克隆到大肠杆菌温度诱导表达质粒pBV220中,构建重组质粒pBVaga1,转入大肠杆菌进行温度诱导表达,得到的重组酶Aga1在大肠杆菌DH5α、DH10B和BL21中的比活分别为28.08、19.44和13.85U/mg, 均高于短双歧杆菌α_D_半乳糖苷酶的比活1.76U/mg。重组质粒pBVaga1在E. coli BL21中稳定性较好。重组酶Aga1蛋白亚基分子量约67kD,最适反应温度为45℃,酶在40℃以下稳定,60℃仅剩余约5%的酶活性,70℃时酶全部失活;最适反应pH为4.0～4.4,酶在pH 3.6～6.0范围内稳定;酶对p_硝基苯酚_α_半乳糖苷的Km＝1.43mmol/L,Vmax＝35.71μmol/(L·min),对蜜二糖的Km＝261mmol/L,Vmax＝63.69μmol/(L·min);酶在蜜二糖、棉子糖水解体系中不显示转糖基活性。结果说明Aga1与已经报道的一种短双歧杆菌的α_D_半乳糖苷酶不同,是新发现的一种短双歧杆菌的α_D_半乳糖苷酶。     

α_1,α_2受体的突触前后定位和亚亚型划分

突触前和突触后都有α_1和α_2受体。对突触前α_1受体的功能有不同看法,可能与突触前α_2受体类似;突触后α_2受体的功能亦与突触后α_1受体类似,但有差别。α_1受体可再划分出高亲和力α_1受体与低亲和力α_1受体:α_(1a)、α_(1b)受体;还有人提出α_(1(?))受体,依赖和不依赖细胞外钙的α_1受体的概念。α_2受体可再划分为低亲和力α_2受体(α_(2L))和高亲和力α_2受体(α_(2H))。     

梯棱羊肚菌AA1_2家族多铜氧化酶基因的异源表达与生化鉴定

典型的漆酶通常属于辅助活性酶第一家族第一亚族（auxiliary activity family 1 subfamily 1,简称AA1_1家族）,而AA1_2家族的多铜氧化酶通常拥有将二价铁氧化成三价铁的活性,部分AA1_2家族酶蛋白兼具漆酶活性。梯棱羊肚菌全基因组只有一个AA1_2家族酶基因,该基因编码的酶蛋白是否拥有漆酶功能尚未清楚。本研究主要从酶生化特性的角度,结合酶基因的表达规律,对该基因的功能进行初探。对该AA1_2家族基因在梯棱羊肚菌生长发育不同阶段的表达水平进行实时定量PCR检测;将该基因编码序列克隆到表达载体中在大肠杆菌中异源表达,层析获得纯化的酶蛋白,对酶蛋白的生化特性进行了鉴定。发现该AA1_2多铜氧化酶基因在外源营养袋和土壤中的营养菌丝里低表达,在菇原基和子实体中表达较活跃。异源表达获得纯化的酶蛋白分子量约64kDa,表现出亚铁氧化酶（EC 1.16.3.1）与漆酶（EC 1.10.3.2）双重活性。其亚铁氧化酶活性在pH 4最高,漆酶活性在pH 6最高。亚铁氧化酶活性与漆酶活性的最适温度均为30℃左右,在30℃温育16h后仍保留70%以上活性。亚铁氧化酶和漆酶活性受Mn ²⁺、Hg ²⁺和Pb ²⁺抑制。对蛋白质变性剂SDS、尿素的耐受性较强。本研究通过酶学证据证实了梯棱羊肚菌AA1_2家族多铜氧化酶基因编码的酶蛋白具有亚铁氧化酶-漆酶双重活性,系在子囊菌大型真菌中首次发现,为进一步研究铁元素代谢与漆酶活性在羊肚菌子实体形成与发育过程中的作用提供了启示。     

一种具有抑制糜蛋白酶活性的血清DNA结合蛋白质的纯化和理化特性

 本文采用离子交换层析,DNA亲和层析和硫酸铵盐析三步从人血清中分离纯化了一种肿瘤相关DNA结合蛋白质(64DP)。本方法较简便,产率提高。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫电泳鉴定纯度符合要求。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量为64,000。等电聚焦电泳测得等电点在4.2左右。醋酸纤维膜电泳和转移电泳表明其为一种α_1球蛋白。过碘酸西夫氏糖蛋白染色呈阳性反应。氨基酸分析和酶抑制试验证实64DP与α_1抗縻蛋白酶很相似。     

芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆、表达和酶学性质分析

在仔猪结肠内容物中分离出一株能利用淀粉的芽孢杆菌Bacillussp.WS06,构建了全基因组DNA文库,从中筛选出α_淀粉酶基因amyF,分析测定了其核苷酸序列并进行了表达;其中amyF编码的蛋白有526个氨基酸、分子量为58.6kD;它与已报道的Bacillusmegaterium的α_淀粉酶序列有93%的同源性。经过氨基酸序列比较分析还发现,AmyF含有淀粉酶家族中4个高度保守的酶催化活性区。经多步纯化,重组酶的比活共提高了22.2倍,获得凝胶电泳均一的蛋白样品;经SDS_PAGE检测,AmyF酶分子量为57kD。该酶的最适反应温度为55℃～60℃,酶的最适反应pH为7.0,在温度不超过55℃时,酶活较稳定;AmyF能迅速降解淀粉生成麦芽寡糖,属于内切糖苷酶。     

乙肝病毒X蛋白通过上调NOX4的表达活化肝星状细胞

目的:探讨乙肝病毒X蛋白(HBx)对肝星状细胞(HSC)活化的影响及其可能的分子机制。方法:构建稳定转染HBx基因的L0_2肝细胞(L0_2-HBx),Western Blot鉴定细胞株中HBx蛋白的稳定表达。以L0_2-HBx、转染空质粒(L0_2-pcDNA3.1)和未转染肝细胞(L0_2)的条件培养基,分别孵育肝星状细胞株LX-2,即LX-2/L0_2-HBx、LX-2/L0_2-pcDNA3.1、LX-2/L0_2,Western Blot检测上述各组细胞α-SMA (肝星状细胞活化标志)和NOX4的蛋白表达。以L0_2-HBx的条件培养基孵育LX-2细胞,分为转染si-NOX4(LX-2/L0_2-HBx+si-NOX4)、无关干扰片段(LX-2/L0_2-HBx+snc-RNA)、未转染(LX-2/L0_2-HBx)3组,Western Blot检测各组LX-2细胞的α-SMA蛋白表达。结果:L0_2-HBx中稳定表达HBx蛋白;LX-2/L0_2-HBx细胞中α-SMA和NOX4的蛋白表达显著高于LX-2/L0_2-pcDNA3.1、LX-2/L0_2细胞(P0.01);LX-2/L0_2-HBx细胞敲减NOX4后(LX-2/L0_2-HBx+si-NOX4),α-SMA的蛋白表达显著低于LX-2/L0_2-HBx+snc-RNA和LX-2/L0_2-HBx细胞(P0.05)。结论:肝细胞中表达的HBx蛋白可以通过HSC中NOX4上调α-SMA的表达,促进HSC的活化。     

植物花粉管中类整联蛋白的免疫荧光定位研究

利用免疫荧光技术,分别用整联蛋白β_3、α_y亚基胞质域抗血清及整联蛋白VnR(Vitronectin的受体)的抗血清在百合花粉管中检测出荧光标记,且在花粉管尖端逐渐增强,而用FnR(纤粘连蛋白的受体)、LnR(层粘连蛋白的受体)的抗血清及非免疫血清对照实验在百合花粉管中则没有或仅有很弱的荧光。在萌发的碧桃花粉管中,用β_1、β_3亚基胞质域抗血清也能检测出荧光标记,初步结果显示花粉管在生长过程中,质膜上有可能存在类整联蛋白,并且在百合花粉管中这种类整联蛋白可能是由α_v和β_3两种亚基组成的Vn样蛋白的受体。