人血清白蛋白和人干扰素α2b的融合蛋白在毕赤酵母中的表达

为了延长IFNα2b在血浆中的半衰期,构建了编码HSA和hIFNα2b的融合基因并在毕赤酵母中获得高效表达,工程菌经5L发酵罐培养后获得的含融合蛋白的培养液经超滤浓缩、蓝色葡聚糖凝胶层析、疏水柱层析以及阴离子柱层析,融合蛋白的纯度达到95%以上。该融合蛋白能与干扰素抗体和人血清白蛋白抗体结合,并表现出与重组干扰素α2b相似的抗病毒活性。以猕猴为动物模型,分别从静脉和皮下单剂量给药,给药浓度为90μg/kg时,在336h后血浆中仍可检测到融合蛋白。其静脉注射的血浆半衰期为101h,皮下注射的半衰期为68.2h。皮下注射的生物利用度为67.9%。IFNα2b与HSA融合后,明显的延长了血浆半衰期,显现了其良好的临床应用前景。     

人b干扰素与人血清白蛋白融合蛋白的表达及纯化

为开展人β干扰素-人血清白蛋白融合蛋白(IFNβ-HAS)的临床前研究,本研究采用免疫学方法对毕赤酵母转化子进行筛选,得到高产菌株8株。在5L发酵罐上对高产菌株进行诱导表达,产量达500mg/L。发酵液经超滤浓缩、染料亲和层析、镍离子螯合亲和层析和DEAE离子交换层析纯化后,融合蛋白纯度达到96%。Westernblotting杂交表明融合蛋白具有人血清白蛋白和人β干扰素的抗原性,细胞病变抑制法测定IFNβ-HSA比活性为1.96×107IU/mg。建立了融合蛋白的生产工艺,为IFNβ-HSA的临床前研究奠定了基础。     

层析法去除重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白的内毒素

用柱层析方法在生产重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白过程中去除产品中的内毒素.所用柱层析组合为Blue-sepharose亲和柱层析、SOURCE 15 ISO疏水柱层析、Q Sepharose F.F.离子交换柱层析、Sephadex G25 Coarse凝胶过滤柱.采用鲎试剂法检测柱层析各阶段得到蛋白中的内毒素含量;并用RP-HPLC方法测定柱层析各阶段得到蛋白的纯度与浓度,求出每毫克蛋白的内毒素含量.结果为每步柱层析过程式均有去除内毒素的作用,最终所得蛋白的内毒素含量降为1 EU/mg,去除率达到99.9%.因而生产重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白所用分离纯化柱层析技术在纯化蛋白的同时能有效的去除产品中内毒素,所得产品内毒素的含量远低于药典对注射剂的内毒素含量要求.     

干扰素α缓释微球的制备及体外释放研究

目的:开发一种有效地长效缓释干扰素α微球制剂。方法:利用S/O/W乳剂-挥发法制备了包裹干扰素α多糖颗粒的PLAG微球,对其外观形态进行了考察,并用ELISA方法考察了微球体外释放效果。结果:制备的干扰素α微球圆整光滑,粒径均匀;经24天体外释放,累计释放率达到80%以上。结论:通过包封包裹干扰素α的多糖颗粒进PLGA微球,有效地保护了干扰素α在微球中的活性,实现了长效缓释,是一种可行的缓释方案。     

层析法去除重组人血清白蛋白干扰素a2b融合蛋白的内毒素

用柱层析方法在生产重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白过程中去除产品中的内毒素。所用柱层析组合为Blue-sepharose亲和柱层析、SOURCE 15 ISO疏水柱层析、Q Sepharose F.F.离子交换柱层析、Sephadex G25 Coarse凝胶过滤柱。采用鲎试剂法检测柱层析各阶段得到蛋白中的内毒素含量; 并用RP-HPLC方法测定柱层析各阶段得到蛋白的纯度与浓度, 求出每毫克蛋白的内毒素含量。结果为每步柱层析过程式均有去除内毒素的作用, 最终所得蛋白的内毒素含量降为1 EU/mg, 去除率达到99.9%。因而生产重组人血清白蛋白干扰素a2b融合蛋白所用分离纯化柱层析技术在纯化蛋白的同时能有效的去除产品中内毒素, 所得产品内毒素的含量远低于药典对注射剂的内毒素含量要求。     

层析法去除重组人血清白蛋白干扰素a2b融合蛋白的内毒素

用柱层析方法在生产重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白过程中去除产品中的内毒素。所用柱层析组合为Blue-sepharose亲和柱层析、SOURCE 15 ISO疏水柱层析、Q Sepharose F.F.离子交换柱层析、Sephadex G25 Coarse凝胶过滤柱。采用鲎试剂法检测柱层析各阶段得到蛋白中的内毒素含量; 并用RP-HPLC方法测定柱层析各阶段得到蛋白的纯度与浓度, 求出每毫克蛋白的内毒素含量。结果为每步柱层析过程式均有去除内毒素的作用, 最终所得蛋白的内毒素含量降为1 EU/mg, 去除率达到99.9%。因而生产重组人血清白蛋白干扰素a2b融合蛋白所用分离纯化柱层析技术在纯化蛋白的同时能有效的去除产品中内毒素, 所得产品内毒素的含量远低于药典对注射剂的内毒素含量要求。     

人血清白蛋白融合技术在药物长效化改造中的应用

人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)融合技术是蛋白质药物长效化改造的一种通用技术,也是目前国内外生物制药研究的热点。在HSA融合技术的研究中,不同融合方式的融合蛋白活性的差异,提高HSA融合蛋白的表达产量以及HSA融合蛋白在表达过程中所出现的降解问题成为制约该技术发展的关键。现就人血清白蛋白融合技术在药物长效化改造应用中所涉及的融合方式以及融合蛋白的高效表达和降解问题进行了综述,希望为HSA融合技术的广泛应用提供一定的技术参考。     

新型人血清白蛋白特异结合肽ML的筛选及鉴定

利用噬菌体展示技术筛选和鉴定新型人血清白蛋白(HSA)特异结合7肽,分析与垂体腺苷酸环化酶激活肽27(PACAP27)构成的融合多肽ML-PACAP27与HSA的亲和结合力,以确定筛选的7肽(ML1和ML2)在与其他药物多肽或蛋白融合状态下仍具有较高的HSA结合活力。利用噬菌体展示7肽库,经四轮筛选、筛选克隆的DNA测序、酶联免疫吸附技术分析(ELISA)初步鉴定筛选克隆与HSA的亲和作用,并利用等离子共振技术(SPR)定量测定合成的ML-PACAP27融合多肽与人血清白蛋白的亲和力常数。实验结果表明:经筛选获得2个与人血清白蛋白特异性结合的7肽序列,其氨基酸序列分别为:ML1:LKSCKPL和ML2:SLKSHAL;ELISA分析结果显示,含有ML1和ML2的噬菌体均可亲和结合HSA,而且ML2的亲和结合作用高于ML1;SPR分析结果显示,ML1-PACAP27和ML2-PACAP27与HSA的解离常数(KD)分别为:8.1×10-6mol/L和3.7×10-6mol/L,ML1-PACAP27与HSA的结合力高于ML1-PACAP27。筛选和鉴定了两个可与HSA特异性结合的7肽序列,该7肽序列可用于特异偶联HSA的长效分子药物的重组融合表达或设计,可为延长分子药物的半衰期及新型药物研发提供新工具。     

人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在CHO细胞中的表达

干扰素α2b(interferonα2b,IFNα2b)是一种用于病毒性疾病和肿瘤性疾病治疗的多功能细胞因子,因其在体内的半衰期短限制了其在临床上的应用。将IFNα2b连接到人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的C端,构建融合蛋白HSA-IFNα2b。构建含融合蛋白的真核表达质粒p MH3/HSA-IFNa2b,经电转的方法转入中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞中。经G418抗性压力筛选和目的蛋白的表达量筛选,最终获得一株高表达的稳定细胞株(CHO/p MH3/HSA-IFNa2b)。表达的目的蛋白经Western blot验证显示,产物具有IFNα2b和HSA的双抗原性。经悬浮驯化稳定后,通过批次筛选得到一株稳定的高克隆表达株,产量约为65mg/L,进一步选取高表达克隆株在悬浮驯化中不同代数进行批次培养,不同代数之间蛋白质的表达量和生长情况没有明显的差异,获得一株稳定遗传表达的单克隆细胞株,3L摇瓶的流加培养结果显示,最佳发酵时间为15天,蛋白质表达量为121mg/L。经离心获得的发酵液,经两步纯化后获得蛋白质纯度高达96.8%的目的蛋白,总回收率为22.3%。参照《中国药典》2015版对IFNα2b的检测方法,结果显示,CHO表达的HSA-IFNα2b比活性为4.16×106IU/mg。首次将HSA-IFNα2b在哺乳动物细胞CHO中构建表达,表达获得高活性的HSA-IFNα2b融合蛋白。     

人LL-37与干扰素α2a密码子的优化及其在毕赤酵母中的融合表达

通过密码子优化,在毕赤酵母中高效表达人LL-37与IFN-α2a融合蛋白。先按P.pastoris密码子偏好性对LL-37与IFN-α2a的原始密码子进行了改造,并在二者之间加上Gly Gly Gly Gly Ser的柔性连接接头,人工合成设计的新序列,最后通过p PIC9K载体将其整合入P.pastoris GS115的基因组,构建出重组菌株GS115LI。利用遗传霉素浓度梯度筛选出两株高拷贝的GS115LI1和GS115LI2菌株。对这两株菌经发酵诱导后的发酵液进行SDS-PAGE检测、抗病毒活性检测和抗菌活性检测,证明重组株既能够成功表达出LL-37与IFN-α2a的融合蛋白,而且该融合蛋白成功保留了抗菌肽与干扰素的功能活性。诱导发酵后,融合蛋白的产量可达到819.1 mg/L,经盐析、疏水层析和离子交换层析分离,可得到纯度达97%的融合蛋白产物,回收率可达到46.2%,纯化后产品的效价可达2.6×108 IU/mg。经过密码子优化后,成功实现在毕赤酵母中高效表达出既有LL-37抗菌活性又具有干扰素α2a活性的融合蛋白。     

人血清白蛋白在蛋白多肽类药物长效化中的应用 *

重组蛋白/多肽类药物在人体血清内半衰期较短, 很大程度上限制了其临床应用。人血清白蛋白(HSA)具有半衰期长、生物相容性好、低免疫原性等优点,是理想的药物载体。各种基于HSA的蛋白质药物长效化技术得到了广泛的应用和发展,目前主要包括构建HSA融合蛋白,通过共价化学键与HSA偶联,通过非共价键与HSA可逆性结合。总结了近年来基于白蛋白药物长效化技术的发展,各项技术的优缺点及药物开发现状。     

长效人促卵泡激素CHO细胞株的构建及其体内活性

促卵泡激素(FSH)是具有促进卵泡与睾丸发育作用的一种垂体糖蛋白激素。因其体内半衰期较短,临床上需要连续10 d以上每天注射,病人使用非常不方便。本文旨在通过提高糖基化程度,研制一种长效FSH。通过一段含有两个N-糖基化位点的连接序列,将人FSHα链与β链cDNA融合,并插入pcDNA3.1(+)表达载体。表达载体转染CHO-K1细胞后,通过G418筛选得到阳性单克隆细胞,并经PCR和Western blotting证实。该重组FSH为单链蛋白,分子量约为49 kDa。经无血清培养,工程细胞株培养上清液中重组FSH的表达量可达3 mg/L。单次注射该重组FSH能够促进大鼠卵巢发育与卵泡成熟,且药效与连续8次注射Folltropin-V的相近。实验结果显示,本研究已成功获得一种长效重组FSH。     

重组胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白的纯化及活性研究

利用构建的重组菌株Pichia pastoris GS115/GLP-1/HSA,在10L发酵罐中表达了胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白(GLP-1/HSA),表达量为63.6mg/L。发酵液经中空纤维柱浓缩、疏水层析、阴离子交换层析和凝胶过滤分离纯化,获得了较高纯度的GLP-1/HSA,经HPLC分析纯度达95.8%。进一步的体内活性分析结果表明,GLP-1/HSA不仅具有天然GLP-1的生物活性,而且在给药后4h仍能发挥显著性降血糖作用。以上结果表明,利用Pichia pastoris分泌型表达系统和建立的分离纯化方法,能获得大量较高纯度的GLP-1/HSA,为进一步研究和开发能够用于糖尿病临床治疗的长效GLP-1类似物奠定了基础。     

疏水相互作用层析分离重组人干扰素α2b

目的采用疏水相互作用层析分离重组人干扰素α2b,去除干扰素样品中的二聚体,得到高纯度的干扰素用于进一步的研究。方法首先采用阳离子交换层析纯化复性重组人干扰素α2b,去除了大部分的杂蛋白,然后采用疏水相互作用层析纯化重组人干扰素α2b,去除复性过程中产生的错误折叠体和二聚体,并考察盐浓度、pH值、流速和洗脱液中尿素对疏水相互作用层析纯化效果的影响。结果硫酸铵初始浓度1.2 mol/L、缓冲液pH值6.0、流速2.5 mL/min、洗脱液中添加尿素浓度为2 mol/L时疏水相互作用层析纯化效果最佳。最终得到的重组人干扰素α2b非还原型SDS-PAGE电泳均呈单一条带。结论确定了疏水层析纯化重组人干扰素α2b的最优条件,成功提取到具有高活性、高纯度的重组人干扰素α2b纯品。     

重组人血清白蛋白在Pichia pastoris中分泌表达影响因素的研究

为获得高产稳产重组人血清白蛋白的Pichia pastoris细胞株用于高密度发酵,构建了多种分泌表达载体,在Pichia pastoris中作表达,研究表达载体构建等因素对表达量的影响。发现采用酿酒酵母α性成熟因子前导肽比人血清白蛋白天然前导肽作为分泌信号肽的表达量要高10%左右。而载体整合方式、整合拷贝数、5’非翻译区的改造和甲醇利用表型等对表达量无规律性影响。筛选到的高表达株经高密度发酵,细胞湿重达460 g/L,发酵液上清的人血清白蛋白含量为1.0 g/L。     

双抗体夹心ELISA定量检测IFNβ-HSA融合蛋白方法的建立

为了建立β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白(IFNβ-HSA)的酶联免疫定量分析方法,以抗IFNβ单克隆抗体为包被抗体,IFNβ-HSA融合蛋白为夹心抗原,辣根过氧化酶(HRP)标记抗HSA单克隆抗体为检测抗体,建立了一种定量测定IFNβ-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法.并进行了检测限、精密度、准确度和稳定性等方法学考核.结果表明,包被抗体和检测抗体的最佳工作浓度均为2μg/ml,抗原浓度在51.88-3320 ng/ml范围内呈良好线性关系,相关系数R2>0.99.检测限为10ng/m1.经方法学考核,批内、批间变异系数分别为4.86%和8.08%,回收率为91.9%～110.4%,与IFN-B、IFN-α、HSA、IFNα2b-HSA基本无交叉反应.健全性分析表明发酵液稀释倍数对该方法无影响,8 d连续检测标准曲线表明稳定性良好.这种定量检测IFNβ-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法,灵敏度高,重复性好,为当前融合蛋白发酵优化、分离纯化研究提供了定量检测的方法,并为后期药代动力学、临床研究提供了思路和备选方法.     

应用双质粒共表达体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母GS115中的表达量

为实现人胰高血糖素样肽-1-人血清白蛋白融合蛋白 ((GLP-1A2G)2-HSA,简称GGH) 的规模化制备,通过pPICZαB与pPIC9K双质粒共表达体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母中的表达量。首先运用PCR技术扩增出融合蛋白GGH的基因片段,构建了表达质粒pPICZαB-ggh,并电转至经载体pPIC9K-ggh异位整合的GGH分泌型菌株——毕赤酵母GS115/F2;然后采用免疫学方法并结合高浓度抗生素筛选获得高产菌GS115/F3,在30 ℃,3％甲醇诱导80 h后GGH的表达量达到了491 m     

胸腺素α1与复合α干扰素融合蛋白的表达及其生物学活性

实验旨在获得具有双重生物学活性的重组胸腺素α1(Thymosin alphal,TM-α1)与复合α干扰素(IFNα-con)融合蛋白.选择大肠杆菌偏爱的密码子.将合成的TM-α1与IFNα-con编码序列构成的融和基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-22b( )、在宿主茵BL21(DE3)-Codon plus-RP-X中成功表达了可溶性融合蛋白(TM-α1.IFN-con).表达量占总蛋白的20%以上.通过硫酸铵沉淀、疏水层析,阴离子交换层析、阳离子交换层析,分子筛层析后,产品纯度达到96%以上.采用细胞病变抑制法测定融合蛋白的抗病毒活性,采用细胞增殖实验检测融合蛋白对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响.结果表明.融合蛋白的抗病毒活性优于市售的IFNα1b和IFNα2a.对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响与市售的合成胸腺素α1相同.已有研究证实.该融合蛋白具有良好的体外抗HBV作用.其体外抗HBV活性比联合应用TM-α1和干扰素α强,且细胞毒性明显低于联合应用TM-α1和干扰素α,以上结果表明,通过大肠杆菌表达的可溶性融合蛋白(TM-α1.IFN-con).既具有良好的干扰素α抗病毒作用.也具有胸腺素α1促淋巴细胞增殖作用.     

重组人α2a干扰素的高效表达与纯化

构建了人α2a型干扰素的表达载体,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量平均为10~ IU/L菌液。还对其表达产物进行了纯化。经盐酸胍裂解菌体、硫酸铵沉淀、酸化处理,再经阴、阳离子交换层析和单克隆抗体亲和层析,使表达产物纯化了1072倍,比活性达1.2×IO~ IU/mg蛋白,达到序列纯,回收率达54％。表达产物N端21个氨基酸序列分析结果与IFN-α2a cDNA推导的序列相符合。     

FCLA-PPIX光触发式静态化学发光体系检测人血清白蛋白

本文对基于FCLA-PPIX触发式化学发光的人血清白蛋白检测体系进行了研究。该触发式化学发光体系利用光敏剂和活性氧探针FCLA组成了一个基本的光触发式化学发光检测体系,将待检测样品和体系充分混合后,通过脉冲光触发和延迟发光检测技术测定人血清白蛋白含量。脉冲触发式静态检测体系克服了其他化学发光体系操作复杂、试剂和样品消耗量大以及信号不稳定的缺点,灵敏度高,检测稳定。本文考察了该体系激发光强度、试剂浓度及温度等对人血清白蛋白检测结果的影响。在优化的实验条件下,测定人血清白蛋白的线性范围为2.5×10-9~6.4×10-7mol/L;方法的检出限为1.6×10-10mol/L;本法对5×10-8mol/L的标准样品平行重复测定11次相对标准偏差为4%。