类似S-层蛋白的苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白基因的克隆

芽胞杆菌CTC菌株被鉴定为苏云金芽胞杆菌 ,鞭毛血清型H2 ,幕虫亚种 ;产生卵圆形伴胞晶体 ,伴胞晶体蛋白为 1 0 0kD ;测定了该蛋白的N 末端序列 ,该序列与炭疽芽胞杆菌的细胞表面S 层蛋白具 92 %～ 93%相似性 ;根据Southern杂交制作了该晶体蛋白基因ctc所在位置的限制性酶切图谱 ,分别克隆了该基因 5′和 3′端所在的 2 9kbXbaI片段和 3 1kbClaIDNA片段 ,彼此间具 0 6kb重叠 ,通过拼接获得含完整ctc基因的克隆。含该基因的大肠杆菌与表达S 层蛋白的大肠杆菌具相似生长特征。初步表明CTC菌株的伴胞晶体由细胞表面S 层蛋白组成。苏云金芽胞杆菌区别于蜡状芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌的唯一标准是能形成伴胞晶体 ,由于S 层是细胞表面的结构成分 ,本文对CTC菌株鉴定为苏云金芽胞杆菌以及伴胞晶体作为苏云金芽胞杆菌鉴别的唯一标准提出了质疑     

苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白可以形成伴胞晶体

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)CTC菌株产生卵圆形伴胞晶体,晶体蛋白分子量为100kD;透射电子显微镜观察结果表明该菌株有S—层结构,而且在母细胞内可以形成伴胞晶体和S—层的初体结构;其蛋白基因导入苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171后,扫描电子显微镜观察结果表明转化子能形成晶体,而其形状与CTC菌株的相同;转化子晶体蛋白的分子量大小也与CTC菌株的相同,为100kD。以上实验结果结合以前晶体蛋白N—末端测序和基因核苦酸序列,表明苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S—层蛋白可以形成伴胞晶体。     

苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白可以形成伴胞晶体

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)CTC菌株产生卵圆形伴胞晶体,晶体蛋白分子量为100kD;透射电子显微镜观察结果表明该菌株有S层结构,而且在母细胞内可以形成伴胞晶体和S层的初体结构;其蛋白基因导入苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171后,扫描电子显微镜观察结果表明转化子能形成晶体,而其形状与CTC菌株的相同;转化子晶体蛋白的分子量大小也与CTC菌株的相同,为100kD。以上实验结果结合以前晶体蛋白N末端测序和基因核苷酸序列,表明苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S层蛋白可以形成伴胞晶体。     

苏云金芽胞杆菌肠毒素基因的PCR检测

采用多重引物PCR进行了 45株苏云金芽胞杆菌、2株蜡状芽胞杆菌和 2株球形芽胞杆菌溶血素BL ,肠毒素T和entS基因的检测 ,结果表明 95 6%苏云金芽胞杆菌含溶血素hblA基因 ,91 1 %含bceT基因 ,93 3%含entS基因。用两种商业化肠毒素检测试剂盒TECRA和RPLA进行所有菌株肠毒素的体外免疫测定 ,大部分苏云金芽胞杆菌和阳性蜡状芽胞杆菌都能产生不同水平的肠毒素活性 ,同hblA基因PCR检测结果基本相符。尽管DBT0 0 7和T2 4 0 0 1含有hblA基因 ,但用TECRA却检测不到肠毒素 ;Dmu39菌株不含肠毒素基因 ,但用TECRA却检测出高的肠毒素活性。苏云金芽胞杆菌BDT2 4 8和球性芽孢杆菌不含肠毒素基因和肠毒素。结果表明昆虫病原菌苏云金芽胞杆菌的安全性有待进一步研究     

苏云金芽胞杆菌杀线虫伴胞晶体蛋白基因cry6Aa的克隆与表达

通过对晶体蛋白N-末端氨基酸测序,设计简并探针,从对根结线虫高毒力苏云金芽胞杆菌YBT-1518菌株中克隆到1个含有杀线虫晶体蛋白基因的片段。序列测定表明该序列含有两个ORF(orf1和orf2),其中orf1与基因cry6Aa1同源性为98%,已在GenBank上登录(Acc.NO.AF499736),并被命名为cry6Aa2。将克隆的该片段克隆到穿梭载体pHT304上,并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,重组菌株可形成米粒状伴胞晶体。生物测定表明,表达的毒素蛋白对北方根结线虫的LC50为9.47μg/mL,毒力与出发菌株(10.74μg/mL)相当。     

苏云金芽胞杆菌抗癌晶体蛋白的研究进展

抗癌晶体蛋白(parasporins,PS)是由没有杀虫活性的苏云金芽胞杆菌产生的一种晶体蛋白,在经过蛋白酶酶解后产生的活性多肽对来自人类不同组织的癌细胞具有特异性细胞毒性,而对正常细胞具有较低毒性或不具有毒性,是一种具有很大潜力的微生物抗癌蛋白。就最近几年苏云金芽胞杆菌中已发现的抗癌晶体蛋白的种类、结构特征、细胞活性谱和杀虫机制进行简要概述。     

利用ERIC-PCR对苏云金芽胞杆菌与蜡状芽胞杆菌进行鉴定的研究

为了探索ERIC-PCR技术在苏云金芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌的鉴定及分型中的应用价值,本研究采用PCR方法初步检测苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的组成,并对苏云金芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌的总DNA进行ERIC-PCR扩增,分析ERIC-PCR指纹图谱的特点并采用NTSYS2.10软件对其进行聚类。结果显示,各菌株的ERIC指纹图谱表现出不同程度的多态性,但图谱与菌株所含cry基因的类型存在一定的相关性。聚类分析结果显示,含有相同或相近cry基因类型的Bt菌株在进化树上趋向聚为一类,而不含cry基因的蜡状芽胞杆菌趋向于与不含cry基因的Bt菌株聚为一类或单独聚类。若在多种模式菌株的参考下,该方法可用于苏云金芽胞杆菌的初步鉴定和分型。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类

１９８９年Ｈｏｆｔｅ和Ｗｈｉｔｅｌｅｙ根据氨基到序列的同源性和杀虫谱双重标准将苏云金芽胸杆菌杀虫晶体蛋白基因划分为５类１４亚类。根据双重标准出现的问题和冲突,给分类带来了困扰,为此１９９５年,只根据氨基酸序列的同源性进行分类。现已将基因分为２１群,４４亚群,６４类,１１６个亚类。本文介绍了纳入新系统的条件、分类原则、命名方法、定名步骤和分类中值得注意的问题。     

苏云金芽胞杆菌S-层蛋白基因的异源表达及分离纯化

S-层(S-layer)普遍存在于古菌、G~+、G~-菌中,由S-层蛋白所构成细菌S-层结构的生物体中,其功能引起了科学家的广泛关注,但目前S-层的功能大都处于推测阶段。究其原因,是因为外源S-层基因可以造成宿主大肠杆菌的致死效应。本研究将一株苏云金芽胞杆菌的两个S-层蛋白基因(GenBank登录号为AJ012290和AY460125)的3’端序列在大肠杆菌BL21(DE3)中成功进行异源表达,在0.8mmol/LIPTG诱导培养6h时,菌体中包涵体表达量达到最高;并对表达蛋白进行了初步分离纯化,以期为后期利用该纯化蛋白进行抗血清制备,进而对该菌的S-层蛋白在宿主菌中的定位、功能分析打下基础。     

利用S-层蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面展示多聚组氨酸肽（简报）

S层(Slayer)是由单一的蛋白或糖蛋白组成的薄层晶状结构,它广泛存在于古细菌和真细菌细胞的最外表面,可包裹整个细胞。S层在结构化学、形态学、遗传学以及物理化学等方面具有独特的性质,使之在生物技术、分子纳米技术和仿生学等领域蕴藏着广泛的应用潜力。近年来,随着微生物表     

CLONING AND EXPRESSION OF CryIVD GENE OF INSECTICIDAL CRYSTAL PROTEIN OF BACILLUS THURINGIENSIS IN THE ACRYSTALLIFEROUS STRAIN

Abstract The plasmid pGEMl, carrying CryIV D, CytA and 20-kDa protein genes, was extracted and digested with Hind II /BamH I. A 5.4 kb fragment containing Cry IV D and 20-kDa protein gene was purified and ligated to an E. coli TG1. The recombinant plasmid was analyzed by restriction map and Southern blotting to determine the correct insert. Then the recombinant was transferred into Bacillus thuringiensis acrystalliferous mutant Bti. IPS. 78/11 by electroporation. The clones with strong expressiveness were obtained. The engineered strains express 72-kDa and 20-kDa proteins and form irregular hexagon paras-pore crystal. One strain bioassayed is very toxic to Culex fatigans larvae with LC₅₀ of 0. 53 μg/ml.     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白 CryⅣD基因在无晶体突变株中的克隆和表达

本文用HindⅢ/BamHⅠ对含Cry Ⅳ D基因的pGEMl质粒进行双酶切,获得了含CryⅣ和20-kDa蛋白质基因的5.4kb片段,将其与穿梭质粒pⅪ61连接,转化到感受态大肠杆菌TG1细胞,对克隆的重组质粒经质粒抽提,进行斑点杂交,Southern分析加以证实后,电转化到苏云金芽胞杆菌无晶体突变株Bti.IPS. 78/11细胞中,可形成不规则的六边形晶体。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳表明,工程菌表达72-kDa杀虫晶体蛋白和20-kDa的蛋白质,对致倦库蚊有很高的毒力,其LC_(50)值为0.53ug/ml。     

Bt杀虫基因与Bt转基因抗虫植物研究进展

苏云金杆菌是一类非常重要的昆虫病原体,它能产生特异性的杀虫结晶蛋白,对农业上和生物医学上的许多有害的昆虫有毒杀作用,这些害虫包括鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、螨类和线虫。近三十年来,以苏云金杆菌为基础的生物杀虫剂已在世界范围内商业化用于防治重要经济作物的害虫。近年来有关Ｂｔ基因的遗传、分子生物学和基因工程已取得显著进展。本文对苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类和杀虫机理及用该类基因构建的工程转基因植物研究状况作一简要综述,同时对Ｂｔ基因工程存在的潜在问题和解决途径作了简单的探讨。     

Bt毒素蛋白基因的PCR鉴定及定位

利用合成的cryI、cryIII和cryV基因专一性引物 ,检测了从土壤中分离到的 56株苏云金芽孢杆菌菌株所含的晶体毒素蛋白基因。含有cryI基因的有 7株 ,含有cryIII基因的有 2株 ,同时含有cryI和cryV基因的有 2 1株。斑点杂交及Southern杂交分析表明 ,cryV基因定位于 1 50MD的大质粒上。     

中国苏云金芽孢杆菌的分布与cry基因的多样性

采集全中国27个省、自治区及4个直辖市昆虫孳生地粉尘、土壤等样品1080份,在其中的406份中分离到苏云金芽孢杆菌965株.镜检可观察到大菱形、小菱形、方形、长方形、圆形、椭圆形、镶嵌形和不规则形等8种主要形态的伴孢晶体;采用cryⅠ、cryⅡ、cryⅢ、cryⅣ和cryⅤ基因的通用引物对221株Bt分离株进行的PCR检测结果表明各类基因的含量依次为cryⅠ＞cryⅡ＞cryⅤ＞cryⅢ基因,分别占被检菌株的75.6%、67.9%、58.4%和14.5%,没有检测到cryⅣ基因,共得到10种基因组合类型.对其中含有cryⅠ基因的菌株分别以cryIAc、cryIC和cryIE基因的特异性引物进行PCR检测,得到20株同时含有cryIAc、cryIC、cryⅡ和cryⅤ优良基因组合的Bt分离株,其中菌株Bt-15A3对棉铃虫、甜菜夜蛾及小菜蛾均表现出高毒力,具有生产开发潜力.     

苏云金芽胞杆菌YBT1520杀虫晶体蛋白基因的属性

通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交发现高毒力苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＴＢＴ－１５２０菌株含有两个杀虫晶体蛋白基因片段,其５’＝末端所在ＨｉｎｄⅢ片段分别为６．８ｋｂ和４．６ｋｂ,它们对应的基因分别命名为ｃｒｙ２１８和ｃｒｙ４．６。经ＰＣＲ鉴定,该菌含有ｃｒｙ１Ａａ、ｃｒｙ１Ａｂ和ｃｒｙ１Ａｃ基因,以及ｃｒｙ２基因,其中ｃｒｙ２１８属于ｃｒｙ１Ａｃ。分析了ｃｒｙ１Ａｃ基因     

八肋游仆虫酸性核糖体蛋白基因克隆与特征分析

原核和真核生物的核糖体大亚基上都存在着一类酸性核糖体蛋白,在大肠杆菌中,分别为L10和L7/L12蛋白,而在真核生物中是P0、P1和P2(简称P蛋白)。这些酸性核糖体蛋白共同组成五聚体复合物P0-(P1/P2)2,在大亚基上形成一个向外侧凸出的柄状结构(Ribosomalstalk)。酸性核糖体蛋白位于核糖体的活性部位,一方面     

苏云金杆菌超氧化物歧化酶的纯化和性质研究

苏云金杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）９１６５超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）,经硫酸铵分级沉淀、ＳｅｐｈａｄｅｘＦ－１００凝胶过滤及非变性凝胶电泳（ＰＡＧＥ）三步纯化,纯酶比活力为４３８８ｕ／ｍｇ,属Ｍｎ－ＳＯＤ,分子量为４７．９ｋｕ,由二个亚基组成,含１９种氨基酸。     

杀菌通透性增加蛋白基因的克隆及在CHO细胞中的表达

从一名健康中国人外周血白细胞中克隆出杀菌 通透性增加蛋白 (BPI)基因 ,全长1 45 2bp,编码 2 7个氨基酸的信号肽和 45 6个氨基酸成熟蛋白。序列比较发现 ,此序列与国外发表的序列有 6个核苷酸的差异 ,编码蛋白有 4个氨基酸的差异。构建真核表达质粒 ,在CHO细胞中实现BPI基因的稳定表达。对重组蛋白初步纯化后进行杀菌实验 ,结果表明重组蛋白具有与天然蛋白同样的生物活性。     

雨生红球藻质体球滴结构蛋白基因的克隆与原核表达

叶绿体或者有色体中的质体球滴结构(Plastoglobules)是多数植物的类胡萝卜素等次生代谢产物积累的场所,但在能大量积累虾青素的雨生红球藻中,这个结构一直没有得到确认。通过透射电子显微镜观察发现雨生红球藻的质体内确切存在plastoglobules结构;并通过RT-PCR结合RACE技术,从雨生红球藻cDNA文库中克隆到了与编码plastoglobules的结构蛋白(Plastoglobulin)具有高度同源性的基因序列全长,称做Hpgp基因;该基因的表达产物称之为雨生红球藻质体球滴蛋白(HPGP;Haematococcus plastoglobules pro-tein);并进一步利用原核表达系统将该编码基因进行原核诱导表达,用His-Tag蛋白分离纯化系统纯化到了目标蛋白,并用该His-Tag融合蛋白为抗原免疫实验兔,制备到了相应的一抗抗体,为下一步对该蛋白的功能阐明以及雨生红球藻的虾青素积累机制研究提供重要的基础。