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本文应用常规淋巴细胞杂交瘤技术制备了4株能稳定分泌抗人重组红细胞生成素(rHuEPO)单克隆抗体(McAb)的小鼠杂交瘤细胞系:BⅡ1B5、DⅡ6B9、MⅡ1H4、GⅠ3E7,用鼠单克隆抗体分型试剂盒鉴定,其分泌的McAb的类型分别是:IgM、IgM、IgG1和IgG2a。间接ELISA法测定细胞上清的效价为1×10~(-2)~1.25×10~(-1),腹水效价为1×10~(?)~1×10~(?)。培养上清经ELISA鉴定,与IL-2、GM-CSF、IFN-α等细胞因子均无交叉反应。只与rHuEPO特异性结合。 相似文献
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用无血清培养基在生物反应器中培养CHO-EPO C2细胞株,培养上清中重组人红细胞生成素表达水平达10~21 mg/L.培养上清经过三步纯化后纯度可达到98%以上,比活性约为1.5×105 U/mg.纯化第一步使用反相柱层析,可将样品体积浓缩约30倍.取其收集液进行DEAE-离子交换柱层析,最后进行分子筛层析,全过程回收率为40%左右.SDS-PAGE表明,所制备终产品分子质量为35~40 ku,等电聚焦方法测其等电点在3.75~4.15之间,均属文献报道范围;ELISA和蛋白质印迹实验结果证明其具有天然红细胞生成素抗原性;采用溴化氰裂解方法做肽谱电泳,结果与理论推测相符.该纯化路线简单、迅速、高效,重复性好,可用于规模化生产临床使用重组人红细胞生成素. 相似文献
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重组人促红细胞生成素纯化工艺的优化 总被引:3,自引:0,他引:3
采用堆积床生物反应器,用无血清培养基培养分泌重组人促红细胞生成素(rhEPO)的工程细胞株ZK9703.所收集的上清,采用阴离子交换层析-反相层析-分子筛层析三步纯化工艺路线,分别用Q-Sepharose XL-C4-S-200(方法Ⅰ)和DEAE Sepharose FF-Source-S-200(方法Ⅱ)纯化3批产品,所得EPO纯度达98%以上,体外比活性大于1.3^10^5IU/mg。方法Ⅰ、方法Ⅱ纯化过程的EPO体外活性回收率分别为23.56%和28.57%。本纯化方法Ⅱ工艺纯化日程短,分离效果好,EPO体内、体外活性回收率较高,更适合于大规模生产重组人促红细胞生成素。 相似文献
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采用堆积床生物反应器,用无血清培养基培养分泌rhEPO的工程细胞株XP9501。所收集的上清液,经过快速离子交换层析—反相—分子筛层析纯化后,所得EPO纯度达99%以上,比活性为1-5×105IU/mg。整个纯化全过程的EPO体内活性回收率为46%。所纯化的EPO分子量为36kd,等电点为3-5。免疫印迹证明其有天然EPO的免疫原性,N端15个氨基酸序列分析与文献报道一致。本纯化工艺路线简单,时程短,重复性好,适合于大规模生产重组人促红细胞生成素。 相似文献
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目的:通过对贴壁培养CHO细胞筛选驯化,得到高表达的细胞后进行悬浮培养生产重组人促红细胞生成素(rHuEPO)。方法:利用96孔板和24孔板对CHO细胞进行筛选,得到高表达细胞株后进行驯化,使其适合悬浮培养,经过摇瓶扩增后接种到生物反应器中无血清培养,每天监测葡萄糖含量,测rHuEPO表达量。结果:悬浮培养CHO细胞生产rHuEPO,生产周期短,表达量比贴壁培养高出很多,操作方便,减少污染,易于放大,并建立了适合悬浮培养的CHO细胞株,为工业化悬浮培养CHO细胞生产rHuEPO提供了技术基础。结论:经过工艺优化后利用无血清悬浮培养生产促红细胞生成素平均表达量较贴壁培养高,生产周期短,有利于降低生产成本。 相似文献
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重组人红细胞生成素二聚体不同真核表达载体的构建及表达 总被引:1,自引:0,他引:1
为构建重组人红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)二聚体真核表达载体,应用PCR方法扩增EPO cDNA,PCR产物克隆入T载体后,经酶切、连接、转化等过程分别构建了3个EPO二聚体的真核表达载体pBT-1c、pBT-2s及pBT-3c,经测序序列完全正确。然后将3个真核表达载体分别转染于CCS-7细胞及CHO-dhfr-细胞中,用ELISA方法检测,它们在COS-7的瞬时表达量分别为4IU/ml、11.5IU/ml和7.2IU/ml。其中EPO二聚体真核表达载体pBTsv稳定转染CHO-dhfr-细胞后,用氨甲喋呤(MTX)逐渐加压的方法筛选到阳性克隆,表达量可达到4000IU/106cells/72h。 相似文献
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聚乙二醇对PEG化重组人促红细胞生成素热稳定性和生物学活性的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
为了研究聚乙二醇对PEG化rhEPO热稳定性和生物学活性的影响,用酶学方法切除rhEPO和PEGrhEPO分子中的N连接糖基,研究酶切产物在37℃时287nm和350nm吸光度随时间的变化;用MTT比色法,网织红细胞法和HCT法比较体内和体外生物学活性的改变。结果显示聚乙二醇修饰能显著减少无N连接糖基的rhEPO分子间的聚集,降低rhEPO体外生物学活性,但增高体内生物学活性;无N连接糖基的PEG化rhEPO具有与rhEPO相当的体内生物学活性。因此聚乙二醇能提高rhEPO热稳定性;聚乙二醇可替代糖基,维持rhEPO的体内生物学活性。用PEG修饰原核细胞表达的rhEPO是开发rhEPO制品的新思路。 相似文献
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目的:用填充床生物反应器培养表达重组人红细胞生成素的工程细胞株C2W,使其达到高密度高表达。方法:将工程细胞株用含5%小牛血清的DF培养基复苏放大培养,当细胞达到10^9时,接种到5L生物反应器中,先用含血清培养基生长培养,再换为无血清培养基表达培养;在整个培养过程中,采用流加方式连续培养,每日采样测定培养上清中葡萄糖浓度,隔日测定细胞的表达水平。结果:接种量约为10^9细胞;细胞罐培养57d,包括含血清生长培养6d,无血清表达培养51d:重组人红细胞生成素平均表达水平为5636U/mL,最高时达7880U/mL;收集无血清培养上清476L,平均每日灌流量8.3L,最高时达12L/日。结论:在适当的条件下,利用填充床生物反应器可使工程细胞株的培养达到长时间、高表达。 相似文献
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促红素能促进人前体红细胞的增殖和分化,从而使人体内红细胞数量增加。临床上主要用于贫血、组织断离以及癌症患者透析后的恢复。促红细胞生成素自1971年在羊的尿液中被提取出后,近30年以来人们不断对其进行研究。促红素蛋白纯化工艺从Myake的七步法完善到现在的三步纯化法。本文综述了促红细胞生成素蛋白纯化的发展历史以及促红素未来的发展方向。 相似文献
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目的:研究重组人促红细胞生成素对血液透析患者营养状态和免疫功能的影响。方法:选取2015年8月至2016年4月在我院进行维持性血液透析的患者共139名,随机分为对照组和观察组。对照组患者接受常规铁剂、叶酸等辅助治疗;观察组患者在常规治疗的基础上加用重组人促红细胞生成素。比较两组患者治疗前后血红蛋白、红细胞压积、营养状况(前白蛋白和转铁蛋白)以及免疫功能(CD4~+细胞、CD8~+细胞、CD4~+/CD8~+细胞和免疫球蛋白)等指标。结果:两组患者治疗前血红蛋白、红细胞压积、营养状况指标和免疫功能指标比较均没有统计学差异(P0.05)。治疗12周后,两组患者治疗后的血红蛋白、红细胞压积、前白蛋白、转铁蛋白均较治疗前显著升高(P0.05),且观察组患者以上指标较对照组升高更为明显(P0.05)。对照组患者治疗后的CD4~+细胞比例较治疗前明显升高(P0.05),但CD8~+细胞和CD4~+/CD8~+细胞比例没有显著变化(P0.05),而观察组治疗后这三类细胞的比例均较治疗前明显升高(P0.05)。观察组治疗后IgA、IgM和IgG浓度均较治疗前显著提升(P0.05),而对照组只有IgA和IgM浓度在治疗后有明显提高(P0.05),但仍显著低于观察组(P0.05)。结论:重组人促红细胞生成素能有效纠正血液透析患者的贫血情况,改善其营养状况并提高其免疫功能。 相似文献
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人红细胞生成素(EPO)工程细胞建立及特性分析 总被引:5,自引:0,他引:5
构建了EPO真核表达质粒,成功地实现了其在CHO-dhfr^-细胞中的表达,所得到的EPO工程的细胞株的形态与CHO-dhfr^-细胞相似,细胞株小瓶静止培养时最高表达水平为2-3μg/10^6cells/24铺达稳定,连续传代三个月和反复冻存复苏三次,细胞表达水平无明显下降。经过对细胞的一系列特性分析表明,该细胞株无支原体、真菌及细菌污染、无致瘤性,形态正常,染色体畸变率与出发株相当。 相似文献
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目的:对比重组人促红细胞生成素在《欧洲药典》(第5版)和《中国药典》(2005年版)中标准的不同点,为国内研发机构对基因重组蛋白产品的研发及国内企业对该产品的进出口提供参考。方法:按2部药典要求,对进口产品或国产产品实样进行部分关键指标的对比分析。结果:2部药典对该产品的标准描述上存在具体内容的区别。结论:在现代药物的研发和生产中,对药品的国际及国内标准要进行综合分析而拟定。 相似文献
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人红细胞生成素单克隆抗体的制备、鉴定及应用研究 总被引:3,自引:0,他引:3
用rhEPo作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与x63Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞融合,再碱性PAGE方法进一步分离并纯化的rhEpo,包被Pvc板,对杂交瘤用ELlSA方法进行筛选,获得两株稳定分泌抗hEPO单抗的杂交瘤细胞株。经鉴定分别属于IgG1、IgG2b,轻链均为k链,Kd分别为5.53×10-10mol/L和1.34×1O-10mol/L.用western blot方法证明两者对hEPO具有高度韵专一性.能特异地识别rhEPO和尿源hEPO。所制备单抗可作为亲和层析的配体,用于再生障碍性贫血病人尿中EPO及哺乳类工程细胞所表达的hEPO的分离、纯化,并可用于hEPO的定量检测. 相似文献
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