弗劳地枸椽酸盐杆菌复合群基因种的生化鉴定

用Ｂｒｅｎｎｅｒ等的方法对从小儿腹泻大便中分离的４０株弗劳地枸椽酸盐杆菌进行基因种的鉴定和分析。７５％的细菌可被准确鉴定,共鉴定出４个基因种。弗劳地枸椽酸盐杆菌（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉ）居首位（５６．７％）,依次为布拉基枸椽酸盐杆菌（Ｃ．ｂｒａａｋｉ）（２０．０％）,杨格枸椽酸盐杆菌（Ｃ．ｙｏｕｎｇａｅ）（１３．３）和沃克马尼枸椽酸盐杆菌（Ｃ．ｗｅｒｋｍａｎｉ）（１０．０％）     

弗劳地枸橼酸盐杆菌基因种与小儿腹泻关系、耐药性的研究

从１４５７例腹泻患儿大便中分离出１６４株弗劳地枸橼酸盐杆菌复合群的菌株,而对照组中分离率仅４．２６％,具统计学差异。为探讨其致病性,采用不耐热性肠毒素,耐热性肠毒素基因探针,菌液直接ＬＴ－ＰＣＲ,家兔肠袢结扎和刚果红结合试验检测细胞的腹泻毒力因子,证实４７．１％的菌株产生ＬＴ,系腹泻重要毒力因子,不具侵袭性因子。     

一株弗劳地枸橼酸杆菌中检出新ampC基因

目的探讨1株耐亚胺培南弗劳地枸橼酸杆菌的耐药机制。方法采用浓度梯度法（Etest）检测对抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）。通过金属酶初筛试验（协同法）检测金属酶;改良Hoged试验检测碳青霉烯酶;头孢西丁三维试验检测AmpC酶;聚合酶链反应（PCR）检测耐药基因;DNA测序决定基因型;接合试验检测耐药基因的转移性。结果弗劳地枸橼酸杆菌临床分离株NC118对亚胺培南的MIC为〉16μg/ml,金属酶初筛试验阴性,Hoged表型确证试验碳青霉烯酶阳性,AmpC酶阳性,PCR扩增及测序显示含有blaKPC-2、blaAmpC基因,该菌株所产AmpC酶基因与CMY-45型AmpC酶（GenBank：ACU00152.1）比较有5个氨基酸发生了改变,该blaCMY-2-like基因为一个新型的AmpC酶基因。结论在弗劳地枸橼酸杆菌中发现一种新的ampC基因（blaCMY-49）。     

CMY-39型AmpC酶新基因亚型的序列分析与原核表达

目的对弗劳地枸橼酸杆菌所产CMY-39型AmpC酶新基因亚型进行基因克隆和重组表达。方法以产CMY-39型AmpC酶新基因亚型的弗劳地枸橼酸杆菌总基因组DNA为模板,PCR扩增CMY-39,将其克隆入pGEM-T载体后测定该核苷酸序列,再将CMY-39基因克隆到pET-32 a（＋）系统进行重组,重组菌在大肠埃希菌BL21中表达,SDS-PAGE电泳鉴定酶蛋白的表达。结果 PCR扩增出大小为1 146 bp的基因片段,与GenBank上CMY-39的基因序列同源性为99%。大肠埃希菌BL21转化pET-32 a（＋）/CMY-39重组质粒后,AmpC酶三维试验为阳性。此基因能在大肠埃希菌中大量表达,SDS-PAGE电泳显示,蛋白分子质量大约为60 kD。结论此基因为CMY-39新基因亚型,登陆号为HM565135;成功表达重组的CMY-39型酶,为进一步做酶动力学及酶的其他分子生物学特性研究奠定了基础。     

临床标本中的枸橼酸杆菌及其鉴定

枸橼酸杆菌(Citrobacter)属于肠菌科。1980年国际上公布了枸橼酸杆菌属包含三个菌种:弗劳地枸橼酸杆菌(C.freundii),异型枸橼酸杆菌(C.diversus)和柯氏枸橼酸杆菌(C.koseri)。为正确鉴定这类细菌,便于临床感染的治疗和病原学分析,我们对近两年从临床标本中分离到的枸橼酸杆菌的生化特性进行了分析研究,筛选出几项鉴别该菌的主要试验,作为这类细菌常规鉴定的方法。     

弗劳地枸橼酸杆菌的临床分布及耐药特性分析

目的了解弗劳地枸橼酸杆菌临床分离株的分布特点,探讨其耐药规律,为临床防治其感染提供帮助。方法常规方法进行菌株分离,VITEK-32型或VITEK-2全自动微生物分析仪进行菌株鉴定,K-B法进行药物敏感性试验,采用WHONET 5.5软件分析数据。结果 2007年6月至2009年12月从各种感染性标本中共分离到47株弗劳地枸橼酸杆菌,呼吸道标本占绝大多数,达51.1%(24/47),其次为脓液和尿液,分别为23.4%(11/47)和12.8%(6/47)。该菌种对氨苄西林和头孢唑啉的耐药性最严重,耐药率分别为92.6%和91.9%,其次是氨苄西林/舒巴坦、头孢西丁、头孢噻肟、左氧氟沙星及复方磺胺甲口恶唑,耐药率均45%,耐药率较低的有亚胺培南和阿米卡星,耐药率分别为8.3%和8.6%。结论弗劳地枸橼酸杆菌可引起患者多部位感染,下呼吸道是其主要感染部位,该菌种耐药性较严重,亚胺培南和阿米卡星对其有较强的抗菌活性。     

食品污染克罗诺杆菌(阪崎肠杆菌)的分离及鉴定

[目的]对300份奶粉样品和50份非奶粉类食品中克罗诺杆菌的污染情况做定量检测,并对分离得到的克罗诺杆菌进行鉴定.[方法]通过分子方法和9管法对奶粉和其他食品中克罗诺杆菌的污染情况做定量检测;通过吲哚产生、丙二酸盐利用、卫矛醇、肌醇、松三糖和松二糖发酵产酸等六种生化试验对分离株进行鉴定;同时对分离株的16S rRNA基因序列进行同源性分析,通过N-J(Neighbour-Joining)法构建系统发育树.[结果]定量检测结果表明,350份样品中有23份样品分离出克罗诺杆菌,共分离到24株克罗诺杆菌,检出率为6.6％;23份受污染样品中有4个样品的克罗诺杆菌大于100 MPN/100g;24株克罗诺杆菌被鉴定到种或亚种,其中19株为阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii);2株为丙二酸盐克罗诺杆菌(C.malonaticus);2株为都柏林克罗诺杆菌奶粉亚种(C.dublinensis subsp.lactaridi);1株为莫金斯克罗诺杆菌(C.muytjensii).[结论]分子方法和9管法联用适合污染率低而定量检测要求高的克罗诺杆菌的奶粉调查;采用生化和分子生物学方法将24株分离株鉴定到种或亚种,其中阪崎克罗诺杆菌为优势种;奶粉中克罗诺杆菌的污染问题对婴幼儿安全存在隐患,应引起消费者和有关部门的重视.     

食甲基杆菌J1-1吡咯喹啉醌生物合成突变株的筛选和鉴定

目的:通过Tn5转座诱变筛选食甲基杆菌J1-1吡咯喹啉醌(PQQ)生物合成相关基因。方法:构建食甲基杆菌J1-1 Tn5转座突变体库,筛选PQQ合成水平差异明显的突变株,利用质粒拯救法鉴定突变基因,通过基因敲除、回补及过表达进一步研究该基因与PQQ合成的关系。结果:构建了J1-1的Tn5转座突变体库,筛选得到一株PQQ合成水平显著下降的突变株,经鉴定Tn5插入位点为mpq0056基因,该突变株在以甲醇为惟一碳源的培养基中生长速度略慢;敲除J1-1中mpq0056基因后,PQQ的合成水平下降,与Tn5诱变结果一致;回补该基因后,PQQ产量恢复到野生菌水平。结论:mpq0056基因参与了PQQ的生物合成,该基因可能编码分支酸盐裂合酶,并在PQQ生物合成中起重要作用。     

阪崎克罗诺杆菌的ITS序列分析

摘 要：以分离自不同来源（不同地区乳制品及某一企业婴儿配方乳粉加工生产环境）、经API20E鉴定为阪崎克罗诺杆菌的37株分离株为研究对象,采用ITS序列对其进行鉴定分析。结果表明,ITS序列分析在阪崎克罗诺杆菌鉴定中具有一定的优越性,且研究发现,ITS序列中含有两种功能基因tRNAgul和tRNAile+ala,这为今后阪崎克罗诺杆菌的鉴定及ITS基因的进一步分析提供了可供参考的理论依据。     

阪崎克罗诺杆菌的16S rDNA鉴定分型

阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）是一种重要的食源性条件致病菌,易引发新生儿、早产儿、低体重新生儿和免疫力低下的婴幼儿产生严重的脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎。本研究以分离自不同来源、通过生化鉴定的37株阪崎克罗诺杆菌作为研究对象,利用16S rDNA基因测序的方法对阪崎克罗诺杆菌进行鉴定和分型。结果表明：ES4并非为阪崎克罗诺杆菌,说明采用16S rDNA基因测序进行阪崎克罗诺杆菌的鉴定更为可靠;通过构建系统发育树分析,分离菌株位于同一系统发育分支;根据序列同源性比对,可将这一分支下的所有菌株分成7个子群,这表明16S rDNA基因测序可以对阪崎克罗诺杆菌进行分型,进一步揭示其系统发育关系。     

应用特异PCR快速鉴定微生物肥料中4种乳酸菌

【目的】植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和德氏乳杆菌(L.delbrueckii)是微生物肥料生产中常用的乳酸菌,它们表型特征相似,若采用传统方法鉴定则费时费力,为准确、快速地鉴定这些种,建立种特异PCR方法。【方法】利用NCBI中Primer-BLAST(引物设计和特异性检验工具),以GenBank数据库中上述菌种的recA和gyrB为靶基因,设计和筛选种特异性引物从而建立相应特异PCR鉴定方法。【结果】经过乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、片球菌属(Pediococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)7个属24个种共40株标准菌株的实验验证,4个目标种分别扩增出唯一的目的产物,而其他种均无目的扩增产物。采用建立的4种特异PCR方法对产品中分离的16株乳杆菌进行鉴定,结果与16S rDNA序列分析、Biolog鉴定结果一致。【结论】建立的特异PCR鉴定方法均具有较高的种内通用性和种间特异性,可快速、准确的用于微生物制剂中植物乳杆菌、德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌的检测和鉴定,具有较好的应用前景。     

上海地区散发布氏杆菌感染的细菌学及分子鉴定

目的 本研究对我院的1例散发布氏杆菌病患者进行细菌学及分子生物学的分析,并在国内首次尝试了用数目可变串联重复单元(VNTR)分子指纹分析法对其进行了基因分型并和国际流行株进行了分子流行病学比较分析。方法 对临床疑似布氏杆菌病病例作血液细菌培养与生化鉴定,进一步作布氏杆菌特异性基因片段的序列分析鉴定以及利用布氏杆菌基因组中的8个位点构建VNTR指纹图谱,参照国际布氏杆菌VNTR数据库,构建布氏杆菌基因系统树。结果 用细菌学方法确定散发疑似布氏杆菌病病例体内分离到的为布氏杆菌,通过基因序列分析进一步得到证实,但不能鉴定到生物种和生物型。对分离株作VNTR指纹分析提示该散发布氏杆菌病为猪2型布氏杆菌感染所致。结论 通过传统细菌培养方法与布氏杆菌VNTR指纹分析可用于我国布氏杆菌病分子流行病学的系统调查。     

干酪乳杆菌的近缘种及亚种部分看家基因的系统发育分析

【背景】16S rRNA基因序列分析已广泛应用于细菌的分类鉴定,但是存在一定局限性,而使用看家基因作为分子标记在近缘种及亚种间的系统发育分析中具有其独特的优势。【目的】研究16S rRNA、uvr C (核酸外切酶ABC,C亚基)和mur E (UDP-N-乙酰胞壁酰三肽合酶)基因序列对干酪乳杆菌的近缘种及亚种的区分能力。【方法】采用分离自传统发酵乳中的6株干酪乳杆菌为研究对象,选取uvr C和mur E基因片段,通过PCR扩增、测序,结合已公布的干酪乳杆菌的近缘种或亚种的相应序列计算遗传距离、构建系统发育树,并与16S rRNA基因序列分析技术进行比较。【结果】研究发现Lactobacilluscasei及相近种间的uvr C、mur E和联合基因(uvr C-mur E)构建的系统发育树拓扑结构与16S rRNA基因结果基本一致,区别在于相似性的不同,其分别为79.00%-99.16%、89.08%-99.20%、76.56%-99.69%和99.58%-100%。基于16S rRNA基因不能区分干酪乳杆菌的近缘种及亚种,而看家基因uvr C和mur E基因序列能够很好地区分干酪乳杆菌的近缘种及亚种,并且将uvr C和mur E基因串联使用后,试验菌株与参考菌株的分类关系更加清晰。【结论】联合基因(uvr C-mur E)可作为16SrRNA基因的辅助工具用于干酪乳杆菌的近缘种及亚种的快速准确鉴定。     

牛源多杀性巴氏杆菌的分离与初步鉴定

【目的】本研究旨在对引起犊牛呼吸道综合征的多杀性巴氏杆菌进行分离鉴定,分析其亲缘关系和毒力基因的分布情况。【方法】收集2017年8月至2018年4月疑似患有犊牛呼吸道综合征的病牛鼻拭子进行细菌分离培养,对菌落形态和染色疑似巴氏杆菌的菌株进行16S rRNA测序和血清型鉴定,选择巴氏杆菌7类23种毒力基因,筛查临床分离株的毒力基因的分布。【结果】从8个省份的237份病料中分离出31株多杀性巴氏杆菌,分离率为13.1%。16S rRNA测序分析表明31株A型多杀性巴氏杆菌属于同一亚群,其序列同源性与中国分离株HB01以及国外分离株USDA-ARS-USMARC-60712、USDA-ARS-USMARC-60214、ATCC 43137以及36950亲缘关系较近。对分离出的31株A型多杀性巴氏杆菌的7类共23种毒力基因鉴定,结果显示31株多杀性巴氏杆菌所携带的毒力因子大多分布在17–19个,且集中度较高。【结论】A型多杀性巴氏杆菌为犊牛呼吸道综合症的主要流行血清型,通过对多杀性巴氏杆菌的临床分离株进化树和毒力基因分析,内蒙古、黑龙江、新疆、山西以及河北的7株分离株进化来源于同一分支,且均缺失毒力基因tadD和hgbA及携带毒力基因hsf-1,提示着其亲缘关系可能与其携带的特定毒力基因存在一定相关性。该研究为犊牛呼吸道综合征的病原学调查和多杀性巴氏杆菌流行病学调查提供了参考数据。     

几种微生物杀虫蛋白基因研究进展

在过去几年中,已经鉴定并克隆出一些新的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因和其他类型的微生物杀虫蛋白基因。其中来自嗜虫沙雷氏菌,双酶梭状芽孢杆菌,球形芽孢杆菌,嗜线虫致病杆菌,发光杆菌和金龟子绿僵菌的新型杀虫蛋白基因在抗虫遗传工程中具有良好的应用前景     

海产品中副溶血性弧菌的分离、鉴定及与临床分离株的生化性状比较

利用TCBS和科玛嘉两种选择性培养基从60份海产品中初筛得到27株疑似副溶血性弧菌, 经生化鉴定, 27株均为副溶血性弧菌, 其中22株是从鲜活海产品中分离得到, 5株从冷冻海产品中分离得到。进一步与临床上得到的32株副溶血性弧菌进行了四个特殊生化试验的比较, 结果发现副溶血性弧菌临床分离株与海产品分离株在溶血、脲酶及枸橼酸盐利用3个生化试验上存在差异, 而阿拉伯糖利用试验无差异, 这为根据生化性状研究不同来源副溶血性弧菌提供基础。     

粪便乳杆菌新种在中国的再发现

目的分离鉴定白鹭粪便中的乳杆菌。方法使用乳杆菌PCR快速检出技术检出白鹭粪便样品中的乳杆菌。将乳杆菌的保守基因16S r DNA、rpo A和rec A克隆测序,并进行序列分析。使用细菌微量生化管和常规生化试验测定乳杆菌糖发酵产酸等生化特征。结果从白鹭粪便样品得到1株乳杆菌菌株FZB1,其16S r DNA基因和粪便乳杆菌AFL13-2的16S r DNA基因最相似,相似性为99.2%。Rpo A的氨基酸残基序列比对结果表明:该菌株和姬鼠乳杆菌、动物乳杆菌、鼠乳杆菌的亲缘关系最近,其相似性分别达到了97.1%、97.1%和96.7%。该菌株的Rec A氨基酸残基序列和粪便乳杆菌完全相同,和姬鼠乳杆菌、动物乳杆菌、鼠乳杆菌的Rec A氨基酸残基序列有较高的相似性,分别为91.9%、91.5%和91.5%。生化鉴定结果表明:该菌株符合乳杆菌属和粪便乳杆菌的生化特征。结论我们从中国的白鹭粪便中分离鉴定到了一株粪便乳杆菌,这是2013年在南非发现的新种。粪便乳杆菌在中国的再次发现充实了乳杆菌种质资源库,证明了粪便乳杆菌的广泛分布。     

多重耐药鲍曼不动杆菌耐药性及β-内酰胺酶耐药基因的研究

研究多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药性及β-内酰胺酶耐药基因的携带情况。采用VIKET Compact 2 全自动细菌鉴定系统进行细菌鉴定,采用纸片扩散法（K-B法）测定鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药性,应用聚合酶链反应（PCR）法检测β-内酰胺酶耐药基因。32株多重耐药鲍曼不动杆菌对13种常用抗菌药物的耐药率均>80%,对亚胺培南和美罗培南耐药率分别高达78.1%和71.9%,头孢哌酮/舒巴坦耐药率31.3%,多粘菌素B抗菌活性最好,耐药率0%。检出超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和头孢菌素酶（AmpC）耐药基因,未检出金属β-内酰胺酶（MBLs）耐药基因。32株多重耐药鲍曼不动杆菌TEM基因均阳性,17株检出PER基因,29株检出ADC基因。有16株菌同时携带TEM、PER、ADC基因。结果表明,同时携带TEM、PER、ADC基因是安徽医科大学解放军174临床学院鲍曼不动杆菌产生多重耐药性的原因之一。     

食品用乳酸杆菌和双歧杆菌泛基因组多态性及菌株间功能基因差异分析

益生菌是一类有益于人体健康的微生物,主要包括细菌和真菌.益生菌的鉴定一直是学界亟需解决的技术问题,传统的分类学方法只能做种属水平的鉴定,而基于基因组学分析可鉴定到种或株水平.本研究对公共数据库中记载的我国《可用于食品的菌种名单》中的16种乳酸杆菌和5种双歧杆菌的基因组数据进行了全基因组比对分析,并应用核心基因平均核苷酸相似性(core genes average nucleotide identity, cANI)进行了物种的重新分类和鉴定方法探索.结果显示,乳酸杆菌和双歧杆菌的cANI值具有种属特异性,其中乳酸杆菌的cANI值在93.6%～99.6%之间,双歧杆菌的c ANI值在94.9%～98.1%之间,同时发现25株乳酸杆菌和1株两歧双歧杆菌有分类学错误.对247株乳酸杆菌和113株双歧杆菌基因组完成图的比对分析结果显示,乳酸杆菌和双歧杆菌菌株间的差异基因数目最多可达436个,菌株间的cANI相似值最小可达1个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP).针对乳酸杆菌和双歧杆菌的毒力基因和耐药基因分析显示,在目前用于食品生产的菌株中均未...     

美洲大蠊肠道内生微杆菌的分离鉴定及其抑菌活性研究

对美洲大蠊肠道内生微杆菌进行形态学和分子生物学鉴定,对其抑菌活性进行初步研究,并从基因水平分析微杆菌产生卤化次级代谢产物的潜力。利用平板划线法对美洲大蠊肠道内生微杆菌进行分离和纯化,革兰氏染色后进行光学显微镜观察,并利用16S rDNA PCR、BLAST同源性比对和构建系统发育树等方法对分离菌株进行分子生物学鉴定以及部分抗生素合成关键酶基因的筛选。在此基础上,以8株常见致病菌为指示菌,利用牛津杯法对分离菌株的抑菌活性进行初步研究。分离得到的8株微杆菌其菌落颜色呈淡黄色或白色;16S rDNA基因测序和BLAST比对结果表明,该8株微杆菌与已知微杆菌同源性均达到98%以上,系统发育树结果表明8株微杆菌与土壤、海洋来源的微杆菌同源性较高。部分抗生素合成关键酶基因筛选结果表明8株微杆菌中有6株至少对FADH2-依赖性卤化酶、非核糖体多肽合成酶(NRPS)及Ⅰ型聚酮合酶(PKSI)3种基因中的2种呈阳性表达。抑菌实验显示,8株微杆菌中有6株微杆菌对受试真菌和细菌的生长表现出了不同程度的选择性抑制作用,表明美洲大蠊肠道存在具有抑菌活性的内生微杆菌。