褐藻胶裂解酶在枯草芽胞杆菌中的重组表达及催化特性研究

为拓展褐藻胶裂解酶在高效、安全的枯草芽胞杆菌体系中的表达,成功构建一株海洋来源的贝特氏菌（Cobetia sp.）WG-007褐藻胶裂解酶枯草芽胞杆菌工程菌Bacillus subtilis WB600/pMA5-aly-cob,对主要发酵条件进行优化,并对重组酶Aly-Cob的酶学性质进行表征。结果表明,优化后的工程菌培养温度和初始pH分别为30 ℃和7.0,发酵培养基为添加15 g/L甘油和30 g/L酵母浸膏的TB培养基。在此条件下,摇瓶发酵48 h褐藻胶裂解酶Aly-Cob酶活为58.62 U/mL,是优化前的2.7倍。重组酶Aly-Cob最适反应温度和pH分别为40 ℃和7.0,Mg²⁺、Ca²⁺、Na⁺和K⁺对酶活有促进作用,该酶可特异性地降解褐藻胶及其片段。研究拓展了褐藻胶裂解酶基因在枯草芽胞杆菌中的表达,为褐藻胶裂解酶的应用提供补充和参考。     

重组枯草芽孢杆菌发酵廉价原料生产普鲁兰酶

[目的]构建长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体枯草芽孢杆菌工程菌株,优化发酵条件,筛选廉价的培养基原料生产普鲁兰酶。[方法]利用分子生物学手段,将基因pul324和表达载体p WB980连接,构建表达质粒p WB-pul324并转化Bacillus subtilis WB600;对表达产物进行SDS-PAGE分析和初始酶活的测定。进一步优化发酵条件,对不同碳源和氮源进行发酵培养基的筛选,同时研究不同金属离子的添加和培养基初始p H、接种量对发酵产酶的影响。[结果]获得基因工程菌B.subtilis WB600/p WB-pul324,SDS-PAGE电泳结果显示在89 k Da处有特异性条带,发酵初始酶活为12.34 U/ml;筛选得到玉米淀粉水解液和玉米浆干粉为培养基最适碳源和氮源,其最适浓度分别为50 g/L和30 g/L。Mn~(2+)、Fe~(3+)、Fe~(2+)和Tween-80的添加能提高发酵产酶活力。在最适初始p H 6.5,以最适5%接种量接种于优化后的培养基中,摇瓶发酵80 h普鲁兰酶的酶活达到414.48 U/ml。[结论]实现了普鲁兰酶突变体在枯草芽孢杆菌中的高效表达,筛选获得的培养基主要原料经济低廉,经过发酵条件优化后,重组菌酶活达到414.48 U/ml,是之前研究结果(20.16U/ml)的20倍。     

Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909麦芽寡糖基海藻糖合成酶在Bacillus subtilis中的重组表达和发酵优化

为实现Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)基因tre Y在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中的重组表达,以质粒p ET-24a(+)-tre Y为模板PCR扩增得到目的基因,并与表达载体pHY300PLK连接,转入表达宿主Bacillus subtilis CCTCC M 2016536中,重组菌在TB培养基中培养48 h后MTSase酶活达到17.5 U/m L;在此基础上对重组菌发酵条件进行优化,通过单因素实验(氮源种类、氮源复配、氮源浓度、碳源种类、葡萄糖浓度、初始pH、诱导温度)和正交实验(氮源浓度、葡萄糖浓度、初始pH、诱导温度)确定其摇瓶发酵产酶的最适培养基和培养条件为:氮源(工业蛋白胨∶棉籽粉=3∶1)48.0 g/L、葡萄糖为10.0 g/L、培养基初始pH为7.0,最适培养温度为30℃;在此条件下,MTSase的酶活可达41.5 U/m L,是优化前的2.4倍。     

枯草芽胞杆菌甘露聚糖酶发酵条件优化

旨在以枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis J为生产菌株,发酵生产β-甘露聚糖酶,通过优化产酶条件,以达到提高β-甘露聚糖酶产量的目的。利用DNS比色法检测β-甘露聚糖酶活力,采用单因素试验,研究碳氮源种类及碳氮源浓度、温度、pH、接种量和装液量对菌株Bacillus subtilis J发酵产β-甘露聚糖酶的影响,结合响应面试验设计确定菌株Bacillus subtilis J发酵产甘露聚糖酶的最优发酵培养条件。单因素试验和响应面试验得到最优的发酵条件为魔芋粉28 g/L,胰蛋白胨21 g/L,K₂HPO₄ 6 g/L,MgSO₄·7H₂O 1 g/L,温度31℃,pH值8.5,接种量1%(体积分数),装液量50 mL/250 mL,发酵周期24 h。利用优化后的培养基生产β-甘露聚糖酶,其酶活力达到84.38 U/mL,是初始发酵培养基产酶活力的3.36倍。通过对发酵条件的优化,大幅度提高了β-甘露聚糖酶的产量,为其工业生产提供参考。     

粘质沙雷氏菌产几丁质酶发酵条件的研究

目的：通过对粘质沙雷氏菌发酵条件的优化,提高其产几丁质酶的能力。方法：以实验室保存菌种粘质沙雷氏菌S418为对象,通过单因素试验和三因素三水平正交试验筛选出了菌株S418产几丁质酶的最佳培养基配方及培养条件。结果：该菌种产酶的最佳发酵条件：0.2%（w/v）胶体几丁质,1%蛋白胨,0.05%KH2PO4,在28℃、pH7.0、接种量6%,培养72h,酶活达到5.49U/mL。结论：优化后菌株S418产几丁质酶的条件。     

响应面法优化枯草芽孢杆菌产脂肪酶的合成培养基

对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CICC20034利用合成培养基液体发酵产脂肪酶的条件进行了优化。首先采用单因子实验筛选出最适诱导剂为三丁酸甘油酯,氮源为尿素,碳源为葡萄糖,无机盐为MgSO4。在此基础上,利用Plackett-Burman设计对影响产酶因素的效应进行评价,筛选出具有显著效应的三丁酸甘油酯、尿素、KH2PO4和培养基起始pH值4个最显著的因素。用最陡爬坡路径逼近最大产酶区域后,利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化,获得最适合成培养基组分为:葡萄糖8g/L,尿素8.57g/L,三丁酸甘油酯2.62%,KH2PO42.59g/L,MgSO4.7H2O0.5g/L,TritonX-1000.5g/L,pH9.47。优化后的B.subtilis CICC 20034胞外脂肪酶活力达0.483U/ml,比初始酶活力0.072U/ml提高了6.7倍。     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A在枯草芽胞杆菌中的表达

枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis常被用于表达杀虫和抗菌蛋白.为了探讨苏云金芽胞杆菌B. thuringiensis营养期杀虫蛋白基因（vip3A）在枯草芽胞杆菌中的表达情况,促进杀虫防病工程菌构建,将枯草芽胞杆菌168菌株核糖体小亚基S4蛋白基因的启动子与苏云金芽胞杆菌WB7菌株vip3A基因的编码序列连接,插入大肠杆菌Escherichia coli与枯草芽胞杆菌穿梭载体pAD123,得到重组原核表达质粒pADpvip,将重组质粒转化枯草芽胞杆菌标准菌株168和分离自辣椒体内的生防内生枯草芽胞杆菌BS-2菌株中,获得工程菌株.SDS-PAGE分析表明在枯草芽胞杆菌168菌株的部分工程菌株中有约88 kDa大小的VIP条带,而BS-2的工程菌株中未见相应的条带,表明Vip3A蛋白仅在168菌株中表达.生物测定表明有5株168的工程菌株（168vip1-4,6）表现较高的杀虫活性,工程菌株发酵稀释液（约10⁷CFU/mL）处理的小白菜叶片饲喂斜纹夜蛾2龄幼虫72 h的杀虫效果可达87.64%~92.13%,但vip3A基因转入内生枯草芽胞杆菌BS-2中不表现杀虫作用.毒力测定表明168vip2菌株对斜纹夜蛾2龄幼虫72 h的LC₅₀为0.0194 mL/mL.这些结果为进一步研究基因在枯草芽胞杆菌中的表达构建杀虫防病工程菌打下了基础.     

重组枯草芽孢杆菌分泌表达缺陷假单胞菌磷酸三酯酶及其发酵优化

磷酸三酯酶(phosphotriesterase, PTE, EC3.1.8.1)能够水解有机磷化合物,但其应用一直受限于酶表达量低的问题.为了获得高效表达的有机磷水解酶,本文构建了PTE基因来源于缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta)的重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WB600),并采用单因素实验和正交实验对培养基进行优化,确定了重组菌产酶的最佳发酵条件,同时检测重组酶对有机磷类化合物的降解作用.结果表明,最优的培养基组成为蔗糖(40 g/L)、酵母膏(40 g/L)、蛋白胨(20 g/L)、磷酸氢二钾(2 g/L)、硫酸锰(1 g/L)、硫酸镁(6 g/L).经测定,该酶4 h内对(5 mg/mL的甲基对硫磷、乐果以及神经毒剂模拟剂甲基磷酸二甲酯(dimethyl methyl phosphonate, DMMP)的降解率分别达到98%, 92%, 73%,且DMMP在12 h内也完全降解.本文实现了PTE的胞外分泌表达,为研制有机磷化合物的酶基消毒剂提供了技术支持.     

液化沙雷氏菌磷脂酶A1的克隆表达及乳糖自诱导发酵

为了利用大肠杆菌高效生产重组磷脂酶,克隆了液化沙雷氏菌磷脂酶A1的编码基因pla,分别使用pET-28a(+)和pET-20b(+)载体,实现了磷脂酶A1在大肠杆菌BL21(DE3)中的功能表达.重组菌利用载体pET-28a(+)在原始信号肽的介导下胞外PLA1酶活达40.8 U/mL,占总酶活的91％.重组菌转接至优化后的发酵诱导培养基:蛋白胨10 g/L,酵母粉5g/L,葡萄糖0.8 g/L,乳糖5 g/L,25 mmol/L Na2HPO4,25 mmol/L KH2PO4和1 mmol/L MgSO4;菌体生长6h后,添加7.5 g/L的甘氨酸,37℃恒温发酵24 h,重组菌胞外PLA1酶活达到128.7 U/mL.     

产脂肪酶粘质沙雷氏菌发酵产酶条件的优化

目的：通过对产脂肪酶粘质沙雷氏菌发酵条件的优化,使其酶活力得到大幅度提高。方法：用响应面法对产脂肪酶粘质沙雷氏菌的发酵产酶培养条件进行了优化。首先通过逐因子实验考察了该菌株产酶所需的最适碳源和氮源,在此基础上通过Plackett-burman法设计实验,考察了几种因素对产酶影响的大小,然后用最陡爬坡实验逼近以上几种因子的最大响应区域后,采用Box-Behnken设计25组实验,并利用Design-Expert对实验结果进行二次回归分析。结果：对产酶具有显著效应的4个因素为：蛋白胨、CaCl2、吐温、大豆油。实验优化到最佳的产酶条件为：糊精1%,蛋白胨0.7%、CaCl20.3%、吐温-80 1.68%、大豆油1.81%、K2HPO40.05%、MgSO40.05%、FeSO40.1%。结论：优化后发酵液上清的脂肪酶活力可达97.52U/ml,比优化前提高了10倍。     

粘质沙雷氏菌产灵菌红素培养基的筛选

目的：确定菌株S418产生灵菌红素的最优培养基配方及其的分类地位。方法：以花生粉为基础培养基,通过单因素试验和四因素三水平正交试验筛选出了菌株S418产灵菌红素的最佳培养基配方;根据该菌株的16S rRNA基因序列系统发育树分析初步确定了菌株S418的分类地位。结果：培养基最优配方为：花生粉2%,花生油0.5%,L-脯氨酸1%,硫酸镁0.025%。在28℃、pH7.5、250r/min振荡培养24h,灵菌红素产量达67.92mg/L。菌株S418初步鉴定为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescensS418）。结论：花生粉培养基是一种适合粘质沙雷氏菌产灵菌红素的优良培养基。     

水产动物益生菌乳酸杆菌LH发酵工艺的研究

目的从生产实际出发,对1株高效乳酸杆菌（Lactobacillus spp）LH进行液体发酵培养基优化及发酵条件研究。方法通过碳源、氮源、无机盐、促生长素等单因子筛选及正交试验设计获得以下最佳培养基：糖蜜12 g/L,酵母膏5 g/L,蛋白胨1 g/L,葡萄糖4 g/L,玉米浆3 g/L,乙酸钠5 g/L,NaC l 5 g/L,K2HPO42.5 g/L,KH2PO42.5 g/L,MgSO40.5g/L,MnSO40.25 g/L。在此培养基上研究了该菌株最佳发酵条件。结果培养基初始pH 6.0,接种量2%（v/v,相对装液量）,500 m l三角瓶中装液量为500 m l,发酵温度为30～35℃,静置培养。在最佳培养条件下,LH活菌量达到1.74×10^9CFU/m l。结论通过活菌平板计数法测定了乳酸杆菌LH生长曲线,24 h为最佳种龄,生产收获时间是36 h。     

低温脂肪酶产生菌的筛选、产酶发酵及粗酶性质研究

利用含有Tween 80的琼脂平板和摇瓶发酵法,从若尔盖高原土壤中筛选产脂肪酶菌株.通过菌落形态和菌体特征观察初步对菌种进行鉴定,得到一株产低温脂肪酶的适冷菌Pseudomonassp.DL-B,并设计正交试验对该菌株的产酶发酵培养条件进行了优化.摇瓶实验表明,该菌株最适产酶发酵培养基为:蔗糖10 g/L,蛋白胨20 ...     

重组Bacillus subtilis产B.stearothermophilus环糊精葡萄糖基转移酶的发酵优化

利用本研究室已构建的重组菌Bacillus subtilis/pBSMuL3-α/β-CGTase对产B.stearothermophilus环糊精葡萄糖基转移酶的发酵产酶进行了优化,考察了培养基中重要成分:碳源、有机氮源、无机氮源、有机与无机氮源质量比、碳源与氮质量比、金属离子种类等单因素对该重组菌产α/β-CGTase的影响,并采用正交实验对发酵培养基进行优化,对优化结果分析可知,重组菌B.subtilis/pBSMuL3-α/β-CGTase发酵产α/β-CGTase的最优培养基成本为:葡萄糖5 g/L,氮源(鱼骨蛋白胨∶NH4Cl=3∶1)25 g/L,1 mmol/L Mg^2+。在最优条件下发酵培养,α/β-CGTase的酶活由原来TB发酵培养基的9.20 U/mL提高至20.32 U/mL,是优化前酶活的2.2倍,为α/β-环糊精葡萄糖基转移酶的工业应用提供了理论支持。     

鸟苷发酵条件的优化研究

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TA208为供试菌株,运用单因素实验方法进行了摇瓶条件下发酵培养基以及发酵条件的优化研究,在最优发酵条件下鸟苷产量达到19．79g／L,比基本培养条件提高32．37％。     

Serratia marcescens H30脂肪酶的重组可溶表达、固定化及其酶学性质

为了提高Serratia marcescens H30脂肪酶的可溶表达水平,分别将目的基因与p GEX-4T-1、p ET28a和p ET32a构建重组表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3),通过优化诱导过程,发现可溶性酶的最高活性可达25 000 U/L。再经Ni2+亲和柱纯化、LH-EP固定化后,固定化酶的比酶活为214 U/g(以1 g湿质量计),酶活回收率为51%。固定化后重组脂肪酶的最适温度由30℃提高到35℃,最适p H从7.0偏移至8.0左右,并且稳定性也有所增加。该固定化重组脂肪酶同样能够拆分消旋体反式-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯,光学选择性没有改变。反应14 h,转化率为48.5%,底物的e.e.值为99.2%,表明该固定化脂肪酶能有效拆分消旋体反式-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯,为工业生物催化制备地尔硫卓提供了可能。     

产低温脂肪酶菌株CZW001发酵培养基优化研究

【目的】研究产低温脂肪酶菌株CZW001发酵培养基。【方法】在单因素试验的基础上, 采用Plackett-Burman (P-B)设计, Box-Behnken (B-B)设计和响应面试验设计(RSM), 在20 °C、pH 8.0、160?r/min发酵2 d条件下, 对发酵培养基进行优化。【结果】该菌株最适产酶培养基为(g/L): 葡萄糖7.68, 橄榄油21.93, 硫酸铵2.0, 磷酸二氢钾1.0, 硫酸镁0.27, 氯化钙0.3, 氯化钠20.0, 吐温-80 1.0。其最高酶活为62.8 U/mL, 比优化前提高了3.14倍。【结论】通过对产低温脂肪酶菌株CZW001发酵培养基优化研究, 明显提高低温脂肪酶活力。     

一株新粘质沙雷氏菌发酵产红色素及其结构的研究

通过对从土壤中筛选得到的一株产红色素的新粘质沙雷氏菌Serratia marcescens subsp.H31发酵条件的研究,确定最优的碳源、氮源和无机盐分别为蔗糖、牛肉膏和CaCl2,最终发酵液中红色素的OD535和生物量分别达到142.638和15.29g/L,并由UV和TOFMS等方法确定该色素为灵菌红素(prodigiosins,简写PG)。