Vero细胞在微载体上的附着研究

本文着重考查了Vero细胞在几种不同微载体表面的附着情况。发现Vero细胞在Cytode x1微载体系列上附着快于在明胶微载体系列上的附着,试验力求寻得一种更加适合于Vero细胞附着,生长的微载体,实验证明化工自制Ⅰ号微载体与CytodeX1无明显差别,为国产化微载体打下了基础。     

细胞培养微载体及其在生物医药领域的应用

细胞培养微载体能为贴壁依赖性细胞提供超大的附着生长表面,是动物细胞大规模培养过程中的一种重要生物功能材料。由于不同应用领域对细胞微载体的要求略有差异,因此产品设计开发已成为细胞微载体培养技术成功应用的关键。该文从细胞微载体的开发设计与应用水平上进行了综述,以探讨细胞微载体培养技术的发展方向。     

微载体上依赖于整全蛋白α2亚基的细胞与细胞外基质的粘附

Vero细胞是肾上皮细胞,合成并分泌层粘连蛋白和IV型胶原,从而在细胞外形成对细胞生长、迁移等有重要影响的细胞外其质膜。已知影响细胞与细胞外基质相互作用的蛋白质分子是整合蛋白。微载体所提供的三维立体培养条件与细胞在体内的生长、迁移条件相似,为在体外研究体内类似过程提供了很好的模型。通过蛋白质印迹法可以检测到：正常培养条件下,在微载体上培养48小时,Vero细胞表达整合蛋白α2亚基（Fig.la);如果同时加入层粘蛋白,α亚基的表达量显著提高（Fig.1b)。正常培养条件下,培养10天,Vero细胞在微载体上形成密集的多层生长,α2亚基表达量明显高于培养初期（Fig.1c)。间接免疫荧光标记（Fig.2)和免疫电镜观察（Fig.3）证实：在层粘连蛋白作用下,α2亚基大量表达,并定位于细胞“附着班”位置的细胞膜上。此时,如果再用抗层粘蛋白抗体处理,可观察到原“附着斑”消失,α2亚基在细胞内呈散布状（Fig.4)。整合蛋白α2亚基的表达和与层粘连蛋白的“附着斑”提供了Vero细胞在微载体上附着和迁移的基础。可能,不同的细胞外基质可以通过不同的整合蛋白来调节细胞活动。     

微载体上依赖于整合蛋白α2亚基的细胞与细胞外基质的粘附(英文)

Ｖｅｒｏ细胞是肾上皮细胞,合成并分泌层粘连蛋白和ＩＶ型胶原,从而在细胞外形成对细胞生长、迁移等有重要影响的细胞外基质膜。已知影响细胞与细胞外基质相互作用的蛋白质分子是整合蛋白。微载体所提供的三维立体培养条件与细胞在体内的生长、迁移条件相似,为在体外研究体内类似过程提供了很好的模型。通过蛋白质印迹法可以检测到：正常培养条件下,在微载体上培养４８小时,Ｖｅｒｏ细胞表达整合蛋白α２亚基（Ｆｉｇ．１ａ）;如果同时加入层粘连蛋白,α２亚基的表达量显著提高（Ｆｉｇ．１ｂ）。正常培养条件下,培养１０天,Ｖｅｒｏ细胞在微载体上形成密集的多层生长,α２亚基表达量明显高于培养初期（Ｆｉｇ．１ｃ）。间接免疫荧光标记（Ｆｉｇ．２）和免疫电镜观察（Ｆｉｇ．３）证实：在层粘连蛋白作用下,α２亚基大量表达,并定位于细胞“附着斑”位置的细胞膜上。此时,如果再用抗层粘连蛋白抗体处理,可观察到原“附着斑”消失,α２亚基在细胞内呈散布状（Ｆｉｇ．４）。整合蛋白α２亚基的表达和与层粘连蛋白形成的“附着斑”提供了Ｖｅｒｏ细胞在微载体上附着和迁移的基础。可能,不同的细胞外基质可以通过不同的整合蛋白来调节细胞活动。     

用多孔微载体大规模培养rCHO细胞

多孔微载体是近年来发展起来的一种用于大规模高密度培养动物细胞的支持物,具有许多优点,如：容易固定细胞,适合于贴壁细胞和悬浮细胞的固定化连续灌流培养;细胞生长在载体内部,增加了细胞固定化的稳定性,可降低血清用量,适合长期培养;能保护细胞免受机械损伤,增加搅拌强度和通气量,强化反应器的传质;比表面积大,为细胞提供了充分的生长空间;细胞固定化过程简单无害,细胞能从长满细胞的微载体中自动转移到未长细胞的新载体中生长,接种方便,操作简单。特别适合于搅拌式、气升式、周定床和流化床等生物反应器的大规模培养〔1,2。尿激酶原(pro-UK)是一种重要的溶栓药物．与一般的生物医药制品相比,pro-UK给药量较大(约20mg／人～80mg／人),小规模生产不能满足市场需求。本文报道利用20L搅拌式反应器培养分泌pro-UK的重组CHO细胞的工艺条件,取得了初步结果。     

用低电荷微载体连续繁殖细胞

引言 微载体技术的发展,可经济地在一个单一容器内大量培养依赖附着细胞(Anchora ge-dependent cells)。已经证明,微载体培养的细胞能用来生产病毒疫苗和干扰素。然而,用蛋白质水解酶、螯合剂,或机械分散微载体上的细胞进行再培养,会增加细胞质量检定和操作程序。操作者明白,把新鲜微载体简单地加到正在培养的细胞培养物中做再培养是非常方便的方法。我们的同事Da     

MAR介导的非病毒附着体载体的研究进展

附着体载体可以使外源基因在宿主细胞中不整合到基因组上而是以附着体的形式存在,是一种新型的高效、安全、附着体表达载体。目前研究较多的是由S/MAR(Scaffold/Matrix Attachment Region,S/MAR)元件介导的质粒。虽然此类载体均能介导载体附着存在,但是转基因的表达量不同。最近研究发现,载体的启动子、骨架结构、CpG基序以及表达系统等方面能够影响转基因的表达,针对以上内容作一综述,希望据此进一步优化载体,为临床研究提供基础依据。     

微载体浓度与细胞接种密度对ST细胞生长的影响

选择合适的微载体浓度、细胞接种密度以提高微载体利用率,优化微载体培养体系猪睾丸细胞(Swine testicle cells)的贴附生长与维持。使用DMEM补加10%血清、LSM(Low serum medium)两种培养基考察微载体浓度、细胞接种密度对细胞生长维持的影响,进而比较ST细胞在不同条件下对Cytodex1微载体的利用率。结果显示,使用LSM在T150方瓶中连续传代培养30d,平均比生长速率为0.626d~(0-1),是DMEM补加10%FBS培养基的1.15倍。选择10×10~5cells/mL细胞接种3g/LCytodex1搅拌瓶体系,最大细胞密度为38.3×10~5cells/mL,微载体利用率上升到58.8%。在灌注培养体系中培养ST细胞15d,最终细胞密度达到36.6×10~5cells/mL,扩增了13.6倍。微载体悬浮培养的使用一方面有利于ST细胞的贴附与生长,实现高密度生长,另一方面增加了微载体的使用成本,选择合适的微载体浓度、细胞接种密度,能够最大化利用微载体与培养基中的营养物质实现细胞的最优生长。     

用环境扫描电子显微镜研究Vero细胞在微载体上的生长

使用环境扫描电子显微镜(ESEM), 通过观察Vero细胞在Cytodex-3微载体表面上贴附铺展及增殖生长过程中的形态变化, 分析了细胞在微载体上的贴附与铺展的过程和行为; 考察了外源的层/纤粘连蛋白对细胞铺展形貌的影响, 发现细胞在微载体上的增殖生长以细胞群落延伸扩展的形式进行. 用ESEM图像计数法和结晶紫细胞核计数法获得细胞生长过程的细胞密度变化和生长曲线, 研究了接种密度对细胞生长过程的影响, 随着接种密度的增大, 细胞延迟期缩短, 表观生长速率增大, 细胞长满微载体表面所用的时间缩短. 在实验的血清浓度范围内(5%~10%), 血清浓度影响细胞的贴附, 随着血清浓度的增大, 细胞的贴附率增加, 从而影响整个生长过程.     

VerO细胞在气升式反应器中的微载体培养

哺乳动物细胞的大规模培养是生产许多医学上重要生物制品的一种主要方法之－⑴。很多有工业价值的动物细胞都是贴壁细胞,必须附着在一定的表面上才能生长,微载体培养是一种有效的体系⑵。用于微载体培养的反应器多为搅拌式反应器,近年来,流化床式反应器越来越引起生化工程学家的重视。有希望用于大规模动物细胞培养的主要是液升和气升式。液升式反应器的优点是培养液可以间接氧饱和,气泡和细胞不直接接触。在气升式流态反应器中,气泡与细胞直接接触,其优点是操作方便,设备筒单。本文报道通过气升流态化反应器实现高密度贴壁细胞培养工艺条件的研究。     

人VHL基因真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞生长的抑制

目的:构建人抑癌基因VHL的真核表达载体,并验证其对肿瘤细胞生长的影响。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增人VHL基因,将其克隆到p XJ-40-myc载体中,酶切和测序验证后转染人胚肾293T细胞,通过蛋白免疫印迹鉴定其表达;转染人乳腺癌ZR75-1细胞和肝癌Hep G2细胞,通过CCK8法测定细胞生长曲线。结果:从人乳腺文库中扩增得到约650 bp的DNA片段,并克隆至p XJ-40-myc载体上,且测序与目的序列完全一致;转染人胚肾293T细胞后,蛋白免疫印迹检测到相对分子质量为26×103的目的基因表达产物;细胞生长曲线显示,转染myc-VHL的乳腺癌、肝癌细胞较空载体细胞生长慢。结论:构建了myc-VHL真核表达载体,myc-VHL抑制癌细胞生长,为进一步研究VHL在肿瘤发生发展中的功能奠定了基础。     

CALR基因对细胞生长和凋亡的调控

本研究探讨了CALR基因对细胞生长和凋亡的影响,以MDS患者的肿瘤细胞为研究对象,构建CALR-RNAi慢病毒载体,观察其对SKM-1细胞生长和凋亡的影响。结果证实,MDS患者CALR基因表达较对照组明显降低(p0.05)。成功构建的3种CALR-RNAi慢病毒载体中,CALR-RNAi(3)慢病毒载体敲除效率最高,转染SKM-1后可促进细胞生长、抑制细胞凋亡(p0.05),同时CALR-RNAi(3)组的G0/G1期细胞减少,S期细胞增多。CALR基因在MDS的发病及发展中扮演着抑癌基因的角色,其突变及缺失是患者发病的主要原因,关于本基因序列的深入研究对于MDS的临床治疗有重大意义。     

人M2型丙酮酸激酶促进肾癌细胞生长

目的:构建带myc标签的人M2型丙酮酸激酶(PKM2)的真核表达载体,并瞬时转染肿瘤细胞,初步探讨PKM2的生物学功能。方法:以人乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增PKM2基因,将其插入p XJ-40-myc载体,双酶切和基因测序验证后转染人胚肾293T细胞,Western印迹验证表达;将重组基因和空载体分别转染人肾透明细胞癌Caki-1细胞,CCK8法测定并绘制细胞生长曲线。结果:从人乳腺文库中获得长约1500 bp的DNA片段,连接到p XJ-40-myc载体上,测序结果与目的序列完全一致;转染人胚肾293T细胞后获得表达;细胞生长曲线结果显示,转染myc-PKM2的Caki-1细胞生长较空载体细胞快。结论:构建了myc-PKM2真核表达载体,为进一步研究PKM2在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。     

人H-ras基因真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞生长的促进作用

目的:构建癌基因H-ras真核表达载体,并检测其对肿瘤细胞生长的作用。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增H-ras基因片段,将其插入p XJ-40-myc载体后转染人胚肾HEK293T细胞,用Western印迹检测该融合蛋白的表达;将重组质粒转染人肠癌HCT-116细胞和人肝癌Hep G2细胞,通过细胞生长曲线(CCK8法)对myc-H-ras影响肿瘤细胞生长的情况进行分析。结果:利用PCR技术,从乳腺文库中扩增出H-ras基因片段,并成功插入p XJ-40-myc载体;重组质粒转染HEK293T细胞,经Western印迹检测融合蛋白正确表达;细胞生长曲线结果显示,转染myc-H-ras的结肠癌HCT-116细胞和人肝癌Hep G2细胞比转染空载体的细胞生长快。结论:构建了人H-ras基因真核表达载体,为进一步研究ras基因在肿瘤细胞中的作用奠定了一定基础。     

杆状病毒载体的研究进展

重组杆状病毒目前代表了一种发展比较成熟的方法技术学。其中载体的发展,尤其是用于表达水平的调控方面已达到了一个相当的高度,但关于表达的其它方面,如多种蛋白产物在同一细胞中的产生,改进的蛋白产物的纯化方法以及充分的蛋白质翻译后加工方式,为新载体和宿主细胞的完善发展留下了广阔的空间和前景。     

人磷酸葡萄糖变位酶5对肝癌细胞生长和迁移的影响

目的:构建带有Flag标签的人磷酸葡萄糖变位酶5(PGM5)基因的真核表达载体,研究PGM5对肝癌细胞生长、迁移的影响。方法:以人乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增PGM5基因编码序列,酶切后插入pcDNA3.0-Flag载体;将空载体与重组质粒分别转染293T细胞,Western印迹检测PGM5的表达;CCK8生长曲线实验研究PGM5对肝癌细胞生长的影响,细胞划痕实验检测PGM5对肝癌细胞迁移的影响。结果:双酶切及测序结果显示pcDNA3.0-Flag-PGM5真核表达载体构建成功;Western印迹表明PGM5在293T细胞中获得表达;生长曲线和划痕实验显示PGM5可以显著抑制肝癌细胞的生长和迁移。结论:构建了pcDNA3.0-Flag-PGM5表达载体,并发现PGM5可以抑制肝癌细胞生长和迁移,为进一步研究PGM5在癌症发生发展中的作用奠定了基础。     

两种微载体培养鼠肝细胞对低温保存后的影响

为了研究细胞培养方式对低温保存后细胞功能的影响,将大鼠肝细胞接种至两种不同微载体(实体微载体Cytodex、多孔微载体Cytopore),微重力高密度培养后于–80°C冻存(冻存速率是1°C/min,5%DMSO+0.4 mol/L山梨糖醇)。2周后复温细胞与载体材料,用显微镜观察细胞生长形态,计算细胞活力情况,并通过细胞代谢功能指标葡萄糖、白蛋白、尿素等的测定,反映细胞在两种载体培养和低温保存后的生长和代谢情况。结果表明,在细胞培养期间,Cytopore的MTT值、代谢指标值是Cytodex的1~1.5倍,低温保存后,Cytopore的各项指标与低温保存前差异不显著,而Cytodex的代谢指标差异显著。因此,大鼠肝细胞在微载体Cytopore的高密度培养及低温保存比Cytodex更有利于细胞的生长和代谢。     

发根农杆菌附着植物细胞的离子效应

本文将光学显微镜、电镜技术和附着定量分析方法结合起来,研究了发根农杆菌各菌株附着烟草叶肉原生质体的离子效应。实验结果表明:发根农杆菌不同菌株对共培养基离子强度的敏感性有差异。菌株R1000附着植物细胞及其引起植物细胞的聚集对离子强度不敏感,而菌株A4和15834则非常敏感;农杆菌对植物细胞附着的多寡与其引起植物细胞的聚集程度有相关性;共培养基中Mg~(2 )、Mn~(2 )等二价刚离子(不包括Ca~(2 ))是农杆菌附着所必需的;植物凝集素ConA显著地促进了附着和植物细胞与细菌聚集团的形成。从菌株A4附着植物细胞的进程可以看出,附着至少是两步的过程:第一步主要是离子力的相互作用,是第二步附着发生的前提;第二步是位点专一的特异性附着,不可逆。发根农杆菌对植物细胞的附着机制不同于根癌农杆菌。     

组织工程中细胞与生物材料相互作用研究进展

种子细胞、生物材料和生长因子是组织工程三要素。生物材料模拟体内细胞外基质,为细胞提供良好的生长附着环境,维持细胞的活力和功能。材料表面的理化性质和表面改性分子直接影响细胞的粘附、增殖、迁移和分化等细胞行为,进而影响细胞功能和组织再生效果。材料表面修饰分子是细胞表面粘附和生长的直接接触位置,因此细胞与生物材料表面修饰分子的相互作用是组织工程的关键。文中重点介绍表面修饰分子对细胞表型及功能的影响,为组织工程关键问题的研究提供参考。     

流加微载体半连续培养分泌HBsAg的rCHO细胞过程研究

本文在固定浓度微载体半连续培养rCHO细胞动力学研究的基础上,通过逐步补加新的微载体以不断提高供细胞生长的表面,提高了细胞密度和产物的表达量。建立了流加微载体半连续培养rCHO肿细胞收获HBsAg的工艺,确定了此种培养方式的最大微载体浓度,为建立微载体连续培养rCH0细胞生产HBsAg技术,实现细胞高密度和产物高表达奠定了基础。