bFGF诱导MEF生成的条件培养基对人胚胎干细胞生长的影响

为了探讨低浓度bFGF诱导小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）生成的条件培养基对人胚胎干细胞（hESC）生长分化的影响,以系列浓度的bFGF作用于MEF上,收集条件培养基（bFGF—MCM）,用于hES2细胞的无滋养层培养。以不添加bFGF而收集的MEF条件培养基（MCM）为阴性对照．同样浓度的bFGF添加于SR培养基（bFGF—SR）为空白对照。通过形态学特征和碱性磷酸酶染色法对hES2的生长分化状态进行评估。结果发现．培养一周内,未分化hES2克隆的比率,阴性对照为23％：空白对照组为13％-31％。当bFGF浓度为0．1,0．3,1,4ng／ml时,bFGF—MCM组未分化克隆的比率分别为44％,74％,77％和78％,与阴性和空白对照组相比,未分化克隆的比率均有不同程度提高．差异有统计学意义（P〈0．01）。该结果揭示了经bFGF诱导的MEF细胞所产生的条件培养基具备了维持hES细胞正常生长而不分化的能力。对bFGF—MCM的深入分析．有望更好地了解hESC的生长与分化机制。     

单细胞因子支持人胚胎干细胞生长的培养体系

[目的]为2株中国人胚胎干细胞系建立培养液中仅添加1种细胞因子的培养体系。[方法]两株人胚胎干细胞h ES-846XX和h ES-18 46XY分别使用含有成纤维细胞生长因子(b FGF)160ng/ml、转化生长因子(TGFβ1)20ng/ml和noggin 200ng/ml的培养液进行无饲养层培养,观察细胞的生长情况并对所得细胞进行鉴定。[结果]培养液中添加b FGF 160ng/ml可以有效地支持人胚胎干细胞的长期增殖,传代8次的细胞仍然保持胚胎干细胞的特性。添加TGFβ1或noggin的培养基无法维持人胚胎干细胞的长期增殖,3代以后细胞完全分化。[结论]证明培养液单独添加高浓度b FGF 160ng/ml支持2株中国人胚胎干细胞长期保持未分化状态增殖,实际未分化率为68.2±1.08%。     

一种新的人胚胎干细胞无饲养层培养方法的建立

目的:以转染碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的人胎肝基质细胞株(FLSC)培养人胚胎干细胞(hESC),寻找更加安全、有效的体外培养扩增方法。方法:通过ELISA方法定量检测转基因的人FLSC条件培养基中bFGF的分泌量;以商业化的mTeSR1无血清无饲养层培养基、常规小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)条件培养基,以及转染bFGF的人FLSC条件培养基(bFGF/FLSC-CM)分别培养扩增H9细胞。通过观察hESC形态、免疫荧光染色、流式细胞检测及RT-PCR,检测hESC全能性标志物的表达。结果:ELISA方法检测bFGF/FLSC-CM中bFGF因子的分泌量为(770.09±17.28)pg/mL,而MEF-CM中bFGF因子的分泌量为(55.59±0.61)pg/mL,两者存在显著差异(P0.01);在3种培养体系下,免疫荧光检测hESC全能性标志Oct-4、Tra-1-81抗体的表达均呈阳性,流式检测细胞表面阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)抗体阳性细胞的比例均在99%左右;RT-PCR检测到hESC特异的转录因子Oct-4、Nanog、Sox-2的表达。结论:以转染bFGF的人FLSC条件培养基可以有效扩增hESC,可为临床应用提供一种安全、高效、低成本的无饲养层培养方法。     

人胚胎干细胞建株与维持培养条件的优化

人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESCs)是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞,它具有无限增殖、自我更新和全能分化的特性。无论在体内还是体外环境,人胚胎干细胞都能分化为机体几乎所有类型的细胞。基于其全能分化性,胚胎干细胞成为治疗各种退行性疾病的理想细胞来源。然而,在目前培养条件下所建立的胚胎干细胞株,仍然存在动物源性物质潜在污染的问题。因此,更优化的建株及培养条件十分重要。     

高效建立129/ter、C57BL/6J小鼠胚胎干细胞系的方法学探讨

小鼠胚胎干细胞 (ＥＳ细胞 )是从小鼠囊胚内细胞团(ＩＣＭ)分离出来的、在体外培养过程中可维持未分化状态、正常二倍体核型及无限增殖能力 ,具有多能性或全能性的细胞系[1～ 3 ] 。ＥＳ细胞广泛应用于克隆动物制作、转基因动物生产、动物医学模型建立、真核细胞基因表达与调控的研究、细胞分化机制的探索、人及哺乳动物基因功能的研究以及细胞、组织、和器官的修复与移植研究。胚胎干细胞的研究和应用已成为生命科学研究的热点和前沿领域之一[4～ 8] 。自第一株 12 9小鼠ＥＳ细胞系建立以来 ,人们在生物学和医学等多个领域进行了广泛深入的…     

大鼠骨髓间充质干细胞分离与培养条件的优化研究

目的:建立和优化大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的分离培养条件,以获得群体均一、未分化状态保持良好的MSCs.方法:收集不同周龄大鼠骨髓细胞;以不同浓度Percoll密度梯度离心分离骨髓单个核细胞;以60%低糖DMEM40%MCDB201为基础培养基,培养24h去悬浮细胞;以不同接种密度传代培养;碱性磷酸酶染色和油红O染色考察MSCs向骨和脂肪组织分化的潜能.结果:采用57%Percoll液的分离效果优于70%Percoll液.6周龄(体重约180g)大鼠能在细胞分离的质和量上达到最佳效果.24h进行悬浮细胞去除、5×103/cm2接种密度传代培养,光镜和电镜显示MSCs增殖能力强,功能状态活跃,成脂成骨实验显示多向分化潜能保持良好.结论:优化大鼠周龄、分离液的密度、细胞培养条件及改进培养方法有助于获得多向分化潜能保持良好的均一的MSCs.     

bFGF和BMP-2联合应用对体外培养兔骨髓间充质干细胞增殖与骨向分化的影响

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和骨形成蛋白-2(BMP-2)联合应用对体外培养兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖与骨向分化的影响.方法:体外培养兔骨髓间充质干细胞,在第2代细胞培养液中加入不同浓度的bFGF和BMP-2,依据加入bFGF和BMP-2浓度的不同分为5个实验组(组1:80 ng/ml bFGF;组2:80 ng/ml BMP-2;组3:30 ng/ml bFGF 30 ng/ml BMP-2;组4:50ng/ml bFGF 50ng/ml BMP-2;组5:80ng/ml bFGF 80ng/ml BMP-2)和对照组(不加任何生长因子),采用绘制生长曲线,四唑盐比色法(MTT),碱性磷酸酶(ALP)活性检测法和碱性磷酸酶(ALP)免疫组化染色法比较各组间差异,观察不同浓度的bFGF和BMP-2联合应用对兔骨髓间充质干细胞增殖与骨向分化的影响.结果:与对照组相比,单独应用80 ng/ml bFGF可显著促进BMSCs的增殖,但对BMSCs的骨向分化显著抑制;单独应用80 ng/ml BMP-2对BMSCs的增殖和骨向分化均有促进作用;30ng/ml bFGF 30 ng/ml BMP-2、50 ng/ml bFGF 50 ng/ml BMP-2和80 ng/ml bFGF 80 ng/ml BMP-2可显著地促进BMSCs增殖和促进BMSCs的骨向分化,且呈正性剂量-效应关系,联合应用两种生长因子较二者单独应用促细胞增殖及骨向分化的效果更为显著.结论:一定浓度范围内,bFGF和BMP-2的联合应用促进BMSCs增殖的同时也促进其骨向分化,两者对BMSCs有明显的协同增强的生物学效应.     

早孕小鼠子宫内膜mTOR基因表达增高

利用实时荧光定量PCR、原位杂交法、免疫组化(SP法)和Western印迹法分别检测未孕、假孕及孕d3、d4、d5、d6、d7小鼠子宫内膜哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian tar get of rapamycin,mTOR)mRNA和蛋白质的表达,研究mTOR基因在早孕小鼠子宫内膜的表达规律.结果显示妊娠子宫内膜组织mTOR的表达较未妊娠的子宫内膜组织显著增加(P＜0.05);着床窗期表达最高(d4,d5),且与其他妊娠各期比较差异有统计学意义(P＜0.05);原位杂交和免疫组化分析显示mTOR mRNA和蛋白质表达主要在子宫内膜基质细胞,与上皮细胞各组比较差异有统计学意义(P＜0.05).研究表明mTOR在子宫内膜基质细胞的规律性表达所调控的细胞生长、增殖和分化可能是胚胎正常着床的分子机制之一.