基于双重芯片式数字PCR快速鉴定KPC型碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的方法

【背景】由于碳青霉烯类药物的泛用和滥用,致使肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株与日俱增,产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的主要原因。目前对肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株的检测方法存在费时费力、特异性差、灵敏度低等问题。【目的】建立一种能同时检测肺炎克雷伯菌和碳青霉烯酶基因bla_KPC的双重芯片式数字PCR方法。【方法】依据肺炎克雷伯菌的特有基因yhaI和碳青霉烯耐药基因bla_KPC保守序列设计特异性引物和探针,确定双重芯片式数字PCR同时对yhaI和bla_KPC两个基因核酸浓度绝对定量的检测范围、检出限和最佳实验体系,并进行方法特异性、灵敏度、重复性分析及临床菌株的检测。【结果】双重芯片式数字PCR检测灵敏度比双重实时荧光定量PCR提高了约1.5个数量级,在两基因同时检出的情况下,最低检出限分别为3.74 copies/μL (yhaI基因)和1.93 copies/μL (bla_KPC基因);优化后的双重芯片式数字PCR对参考菌株检测特异性的结果与双重实时荧光定量PCR结果一致;利用优化后的双重芯片式数字PCR方法共检测58株临床菌株,其中肺炎克雷伯菌43株,属肺炎克雷伯菌且含有bla_KPC基因的菌株13株,这与质谱及耐药谱检测结果一致。【结论】利用双重芯片式数字PCR技术建立了产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的绝对定量检测方法。该方法特异性强、灵敏度高、准确度好,可用于检测具有碳青霉烯酶基因bla_KPC的肺炎克雷伯菌的核酸检测和定量分析,也为产其他类型碳青霉烯酶的病原菌检测提供了新的技术参考。     

橡胶树暹罗炭疽菌Zn2Cys6型转录因子CsGcc1的生物学功能

【背景】暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）是一种重要的病原真菌,可以引起炭疽病,给全球橡胶产业带来巨大的经济损失。Zn₂Cys₆型转录因子是真菌特有的锌指类转录因子,通常参与调控真菌的生长发育过程。【目的】在暹罗炭疽菌中鉴定了一个与稻瘟病菌Gcc1同源的Zn₂Cys₆型转录因子CsGcc1,并研究其功能。【方法】根据同源重组原理构建CsGCC1的基因敲除突变体,并通过营养生长、H₂O₂敏感性、分生孢子产生及萌发、玻璃纸试验和致病性分析,明确CsGcc1的功能。【结果】CsGcc1编码一个含有646个氨基酸的蛋白,而且含有一个GAL4结构域。CsGCC1基因在培养36 h的菌丝及分生孢子中具有较高的表达量。CsGCC1基因敲除突变株营养生长速率降低且对H₂O₂更加敏感。相较于野生型菌株,突变株的分生孢子产量、萌发率及附着胞形成率均降低。此外,CsGCC1的敲除可以明显降低分生孢子的穿透能力,突变株对橡胶叶片的致病力减弱。【结论】Zn₂Cys₆型转录因子CsGcc1参与调控暹罗炭疽菌的营养生长、氧化应激、分生孢子发育及致病性等过程。     

两株不同宿主源化脓隐秘杆菌分离鉴定及其plo基因生物信息学分析

【背景】化脓隐秘杆菌是一种能够感染人类及多种动物的条件致病菌,常引起动物的各种非特异性化脓性感染。【目的】探究不同宿主疑似化脓隐秘杆菌感染的菌属种类和病原特性。【方法】对林麝皮下脓肿和鸭跗关节脓肿进行细菌分离,通过革兰氏染色、细菌16S rRNA基因分析等方法对病原菌进行鉴定,通过生长曲线测定、药敏试验和毒力基因检测分析2株病原菌的生物学特性,对溶血素plo基因进行序列分析和结构预测。【结果】分离鉴定到林麝源和鸭源化脓隐秘杆菌各1株,分别命名为FTP-1和DTP-1;生长曲线测定发现,2株病原菌的生长繁殖速度差异较大;药敏试验表明,2株病原菌对β-内酰胺类、磺胺类和利福霉素类抗生素耐药,对氨基糖苷类、喹诺酮类抗生素敏感;毒力基因检测显示,2株病原菌均携带plo、nanH、nanP、fimA和fimE基因,鸭源分离株还携带有fimC基因;生物信息学分析软件预测显示,2株病原菌溶血素plo基因核苷酸序列存在宿主特异性差异,但二者氨基酸序列相同,蛋白结构预测发现化脓隐秘杆菌溶血素(pyolysin, PLO)与胆固醇依赖性溶细胞素家族其他成员之间相似性较高。【结论】在云南宜良地区分离到林麝源和鸭源化脓隐秘杆菌各1株,二者plo基因亲缘关系较近,相关生物学特性分析可为推进该病原菌的研究和防控提供参考。     

云南地区鸭源沙门菌的分离鉴定及耐药性和毒力基因分析

【背景】沙门菌是一种重要的食源性人兽共患病原菌,可引起多种食源性疾病。【目的】了解云南地区鸭源沙门菌病的流行现状、耐药现象及毒力基因携带等基本情况。【方法】无菌采集云南各地区病死鸭肝脏样品169份进行沙门菌分离,对分离株进行血清分型鉴定、药敏及相关耐药基因、毒力基因筛查。【结果】分离到鸭源沙门菌48株,分离率为28.40%,鉴定出3种血清型,其中肠炎沙门菌为优势血清型。分离株对青霉素G、林可霉素、克林霉素和利福平的耐药率达100%,每株菌至少对3类6种及以上的抗生素耐药,单株最高可耐14种,产生了22种耐药谱型。共检出耐药基因5种,bla_TEM和tetB检出率分别为27.08%和22.92%,tetA、sul2和EBC的检出率较低。毒力基因共检出10种,其中,SPI-1(avrA)、SPI-3(mgtC)、SPI-4(siiD)、SPI-5(sopB)和bcfC检出率均高达100%,SPI-2(ssaQ)、spvB、spvC、pefA和stn的检出率均达60%以上,cdtB未检出。【结论】云南地区鸭源沙门菌主要流行血清型为肠炎沙门菌,耐药性及多重耐药情况严重,耐药机制复杂,耐药基因与耐药表型符合率低,毒力基因检出率较高。研究结果可为云南地区鸭群沙门菌病的防控和净化提供参考。     

野生鸟类分离的多重耐药肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)耐药基因分子进化特征研究

【目的】调查野生鸟类携带菌的耐药状况,探索其在细菌耐药性传播过程中的作用。【方法】从野生鸟类石鸡、绯胸鹦鹉、太阳锥尾鹦鹉和黑领椋鸟的新鲜粪便分离4株Klebsiella pneumoniae,采用微量肉汤稀释法评估其多重耐药表型,并利用全基因组测序技术和细菌全因组关联分析、比较基因组学方法对分离株进行分子溯源,系统解析其携带的多重耐药质粒或基因与其宿主、同源质粒间的关联。【结果】4株肺炎克雷伯菌的耐药谱各不相同,来自石鸡样本的分离株S90-2对9种药物耐受,绯胸鹦鹉样本分离株S141对3种药物耐受,太阳锥尾鹦鹉分离株M911-1仅耐受氨苄西林,黑领椋鸟的样本分离株S130-1对所使用的14种药物完全敏感。S90-2属于ST629型,携带bla_CTX-M-14、fosA6、aac(3)-Iid和bla_SHV-11为主的30个耐药基因和携带1个耐药性质粒pS90-2.3 (IncR型)。S141属于ST1662型,携带fosA5、bla_SHV-217等27个耐药基因,1个质粒pS141.1 [IncFIB(K)(pCAV1099-114)/repB型]仅携带耐药基因adeF。M911-1为新ST类型,携带bla_SHV-1、fosA6等共计27个耐药基因,其质粒pM911-1.1携带了3个耐药基因。S130-1属于ST3753型,携带bla_SHV-11、fosA6等27个耐药基因,pS130-1 [IncFIB(K)型]则仅携带一个耐药基因tet(A)。质粒比对表明,质粒pS90-2.3携带的耐药基因片段源自不同的肠杆菌科菌株染色体或质粒。pS90-2.3的同源质粒主要来自人类宿主菌,且主要在中国分布,这些质粒主要细菌宿主为K. pneumoniae和Escherichia coli,且ST11型K. pneumoniae分离株为重要宿主菌。【结论】本研究中来自野生鸟类的多重耐药K. pneumoniae,其耐药基因主要来自质粒,质粒耐药基因主要由转座子、插入序列、整合子和前噬菌体等可移动元件介导,这些多重耐药质粒与人类的宿主菌密切相关。     

基于CRISPR/Cas13a的金黄色葡萄球菌mecA耐药基因检测方法的建立

【目的】 针对目前耐药基因检测通常需要依赖专业检测设施和设备,仍缺乏耐药基因快速检测方法这一问题,旨在建立一种基于成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) mecA耐药基因快速检测方法。【方法】 首先在mecA基因序列的保守区中设计筛选出灵敏度较高的重组酶介导链替换核酸扩增(recombinase aided amplification, RAA)引物和CRISPR RNA (CRISPR RNA, crRNA),通过结合消线法核酸检测试纸技术(easy-readout and sensitive enhanced, ERASE)建立针对mecA基因的检测方法,最后利用模拟样本及临床分离样本对建立的新方法与传统方法进行比较。【结果】 成功筛选出了1组针对mecA耐药基因的高效扩增引物和crRNA,并建立了基于CRISPR-ERASE的mecA耐药基因高灵敏核酸检测方法,最低检出限为10 copies/μL,在32株临床分离的金黄色葡萄球菌中,该方法共检出24株mecA耐药基因阳性菌株,与药敏试验及荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)检测结果符合率为100%。【结论】 建立了一种基于CRISPR-ERASE核酸检测试纸技术的简单、高灵敏的mecA耐药基因检测方法。     

ycjX和ycjF基因在布鲁氏菌热应激中的作用

【背景】细菌应对环境压力的能力对其存活和增殖及引起感染具有重要意义。充分揭示布鲁氏菌应激机制,可为防控布鲁氏菌病提供理论依据。研究发现,ycjX基因在细菌热应激时高表达且可能受σ³²调节,ycjF基因在细菌败血症期间表达显著上升,二者在革兰阴性菌中可能构成操纵子。【目的】研究ycjX和ycjF基因在布鲁氏菌热应激中的作用。【方法】对布鲁氏菌(Brucella)及其ycjX和ycjF双基因缺失株(△ycjXF)和回补株(C△ycjXF)进行热应激试验,计算3株菌的存活率。利用RT-PCR和β-半乳糖苷酶活性检测试验鉴定ycjX和ycjF的操纵子模式和启动子区域活性。利用ChIP试验分析σ³²与ycjX和ycjF的靶向调节关系。表达并纯化pGEX-4T-1-σ³²重组蛋白,凝胶电泳迁移试验分析σ³²与ycjX和ycjF之间的结合关系。【结果】热刺激后△ycjXF存活显著低于Brucella suis S2和C△ycjXF。明确布鲁氏菌ycjX和ycjF为同一转录本,确定其启动子区域具有活性。ChIP试验表明,σ³²可靶向富集在ycjXF启动子区,凝胶电泳迁移试验确定σ³²可与ycjXF体外直接结合。【结论】在σ³²的调节下,ycjX和ycjF在布鲁氏菌热应激中发挥正向作用。     

温度与CO2浓度升高对集胞藻PCC 6803修复UV损伤的关键基因转录量的影响

通过Taqman探针绝对定量法研究了集胞藻PCC 6803在5种不同的环境条件下:(1)25℃+400μmol/mol CO₂,(2)29℃+400μmol/mol CO₂,(3)25℃+800μmol/mol CO₂,(4)29℃+800μmol/mol CO₂,(5)25℃+1200μmol/mol CO₂,其phrA/psbA1/psbA2/psbA3等UV修复基因和16S rRNA基因的转录本拷贝数的变化情况。结果表明:温度与CO₂浓度的升高可以导致集胞藻PCC 6803的psbA2/psbA3基因和16S rRNA转录本拷贝数的大幅减少,说明温室效应将有可能导致蓝藻的UV损伤修复能力与核糖体合成能力的下降;温度升高和CO₂浓度升高对psbA2/psbA3基因和16S rRNA转录本拷贝数的联合作用表现为互相抵消,说明温度升高与CO₂浓度升高的联合作用的机制较复杂,值得深入研究。     

基于MS2噬菌体lys基因的质粒型条件自溶菌的构建与应用

【背景】传统外源蛋白的原核表达通常需要以超声破碎或者酶解的方式破碎菌体,过程比较烦琐。【目的】构建基于MS2噬菌体lys基因的质粒型条件自溶菌,以简化外源蛋白的获取流程。【方法】从MS2噬菌体中克隆lys基因,构建重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,以此构建质粒型条件自溶菌,通过生长曲线和菌落形成单位反映自溶菌裂解效率,利用SDS-PAGE检测外源蛋白释放情况。【结果】构建了pBAD-lys BL21(DE3)、pBAD-Opti-lys BL21(DE3)及pCDF-BAD-Opti-lys BL21(DE3)这3种质粒型条件自溶菌。以上自溶菌在阿拉伯糖诱导后其宿主裂解效率均为99.99%以上,CFU结果显示含pCDF-BAD-Opti-lys质粒的宿主裂解效果更优,在此自溶菌BL21(DE3)中表达含His标签的重组绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP),经阿拉伯糖诱导后菌体中约63.00%以上的eGFP释放至胞外,利用Ni-NTA可以直接从培养基中纯化得到约30 kDa的单一目的蛋白。【结论】基于MS2噬菌体lys基因成功构建了阿拉伯糖诱导的质粒型条件自溶菌,此自溶菌能够以自我裂解的方式释放大部分胞内外源蛋白,简化传统外源蛋白获取流程。     

不同浓度壳聚糖对炭黑曲霉和硫色镰刀菌生长和发育的影响

【背景】壳聚糖是广泛存在于甲壳动物的一种多糖，具有广谱的抗真菌活性，但壳聚糖是否影响炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)和硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)生长和发育尚未见报道。【目的】明确不同浓度壳聚糖对A. carbonarius和F. sulphureum生长和发育的影响。【方法】通过在PDA培养基中添加不同浓度壳聚糖，测定两种真菌的菌落直径、生物量和菌丝干重，观察产孢量、孢子萌发和芽管长度，比较抑菌的差异。【结果】壳聚糖处理可显著改变两种真菌的菌落形态，处理浓度越高菌落皱缩和变形越明显；壳聚糖还可以有效抑制两种真菌的菌落生长、菌丝干重和菌丝生物量，抑制效果呈明显的浓度依赖，对F. sulphureum的抑制效果更好。壳聚糖可抑制两种真菌的产孢量、孢子萌发和芽管伸长，处理浓度越高抑制效果越好，对F. sulphureum的抑制效果更为明显。壳聚糖对A. carbonarius和F. sulphureum的EC₅₀值分别为0.12 mg/mL和0.075 mg/mL。【结论】壳聚糖可有效抑制A. carbonarius和F. sulphureum的生长发育，抑制效果呈浓度依赖，F. sulphureum对壳聚糖更为敏感。     

鸭疫里默氏杆菌流行菌株的分离鉴定及生物学特性

【背景】鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是引起雏鸭、鹅、火鸡等多种家禽、野禽发生传染性浆膜炎的病原,在全世界范围内广泛存在,危害养禽业发展,造成严重的经济损失。【目的】了解国内RA的流行现状,探究该菌的生物学特性,更好地指导防控鸭疫里默氏杆菌病。【方法】对2020-2021年从山东省、河北省、广东省、山西省等地分离的RA疑似菌株进行PCR、生化和血清型鉴定,并根据药物敏感性结果分析耐药现象,根据半数致死量(median lethal dose,LD₅₀)测定结果分析致病力差异。【结果】共鉴定78株RA分离株,其中,血清1型4株、2型21株、10型11株、6型3株、7型17株,1株有交叉凝集现象,21株血清型未定型;药敏结果显示78株分离株对多粘菌素B、磷霉素、克林霉素等的耐药性最强,对头孢拉定、多西环素、呋喃唑酮、氟苯尼考等抗生素最为敏感,并且78株分离株均存在多重耐药性,其中77株耐药5重及以上;动物试验结果显示,RA的分离株致病力普遍较强,而且不同地区分离株、同地区不同分离株之间均存在差异,数株RA分离株的LD₅₀在10⁴-10⁷ CFU不等。【结论】RA在国内流行表现了强致病力及严重耐药情况,本研究结果为更好地预防控制、临床用药及后续致病机制研究提供了参考依据。     

YPS1/YPS2失活改进酿酒酵母An-α菌株β-葡萄糖苷酶分泌表达

[背景] 工业酵母菌株的蛋白质表达通常存在表达量低、分泌效率低的问题。[目的] 考察失活Yapsin蛋白酶Yps1p和Yps2p对β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母An-α菌株中表达的影响。[方法] 利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,首先构建得到未折叠蛋白响应（Unfolded Protein Response,UPR）指示菌株An-α（leu2：：UPRE-lacZ）即An-αL,然后分别失活其YPS1和YPS2基因,导入以YEplac195为载体的β-葡萄糖苷酶表达质粒（简称BG）,进行生长和酶活分析评价。[结果] 菌株An-αL的YPS1和YPS2基因失活对其在酵母浸出粉胨葡萄糖（Yeast Extract Peptone Dextrose,YPD）培养基中的生长未造成明显的不利影响;导入质粒BG后将在酵母浸出粉胨纤维二糖（Yeast Extract Peptone Cellobiose,YPC）培养基中生长的最大OD₆₀₀分别提高了21.9%和7.4%;最大总酶活值为0.087 5和0.068 6 U/（mL·OD₆₀₀）,是对照菌株相应值的2.268倍和1.778倍;分泌比例提高了19.4%和22.2%;β-葡萄糖苷酶表达水平与β-半乳糖苷酶酶活水平所代表的UPR信号响应值之间呈现良好的相关性。[结论] YPS1和YPS2基因失活有助于改进酿酒酵母An-α菌株中β-葡萄糖苷酶的分泌表达。     

海水养殖生境中硫酸盐还原菌活性的抑制机制

【目的】海水养殖生境中的硫化物(H₂S)严重损害养殖生物健康,控制该条件下硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)的代谢活性是有效抑制H₂S产生的重要途径。【方法】本研究利用稀释涂布-叠皿夹法对海水养殖生境底泥中SRB进行富集筛选,获得SRB菌株,通过投加硝酸盐对菌株产H₂S的活性进行抑制。【结果】获得的2株SRB Desulfovibrio sp.NY-1和Clostridium sp.NH-1,能够在35℃、pH为7.0及盐度为20–30 mg/L条件下,分别积累高达435和150 mg/L H₂S。硝酸盐不能有效抑制NY-1产H₂S的活性,基因调控作用以及缺乏将硝酸盐作为电子受体的酶体系是其不能被抑制的主要原因。硝酸盐对NH-1 H₂S产生活性有可逆性抑制,其具有硝酸盐异化还原成铵(dissimilatory nitrate reduction to ammonium,DNRA)的能力,优先利用硝酸盐作为电子受体。DNRA作用下的中间代谢产物亚硝酸盐是有效抑制菌株NH-1产H₂S活性的主要原因,其抑制机理主要为抑制菌株的生长繁殖。【结论】硝酸盐对不同SRB菌株具有不同的抑制机制和效果,在进行硫化物污染控制前需要对产生硫化物的SRB菌群进行分析判别。     

基于谷氨酸消旋酶基因(murI)构建杀香鱼假单胞菌减毒活疫苗株的染色体-质粒平衡致死表达系统

【目的】构建一种基于谷氨酸消旋酶(MurI)基因的染色体-质粒平衡致死系统,用于杀香鱼假单胞菌减毒活疫苗株(Pseudomonas plecoglossicida ΔtssD-1, Pp ΔtssD-1)中表达外源抗原,为开发多联活疫苗提供新的思路和方法。【方法】利用同源重组技术,将亲本株Pp ΔtssD-1中的murI基因敲除,构建murI基因缺失突变株;将广宿主穿梭质粒pBBR1MCS-2的卡那霉素抗性基因替换为murI基因,构建平衡致死质粒(即无抗性回补质粒);在平衡致死质粒的多克隆位点处插入绿色荧光蛋白以检测外源抗原是否稳定表达,对重组菌株进行生物学特性分析,包括生长曲线、质粒稳定性和外源抗原表达水平。【结果】murI基因缺失株在不含D-谷氨酸的LB培养基上无法生长;无抗性回补株在不含D-谷氨酸的LB培养基上恢复了生长能力,但生长速度低于亲本株;经鉴定外源抗原可在无抗性质粒中稳定表达,并可在荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光信号;此外,平衡致死质粒在重组菌株中具有良好的遗传稳定性。【结论】本研究以murI为靶点构建了新型的染色体-质粒平衡致死系统,可在无抗性筛选条件下在Pp ΔtssD-1中表达外源抗原,为开发多联活疫苗提供了新的策略和方法。     

拟态弧菌金属蛋白酶基因PrtV缺失株的构建及生物学特性分析

【背景】研究发现PrtV基因编码含多囊肾病(polycystic kidney disease)结构域的金属蛋白酶,其在多种细菌的致病过程中具有重要作用。拟态弧菌是一种感染多种水生动物的重要病原菌,PrtV基因在拟态弧菌致病中的作用尚不清楚。【目的】探究PrtV基因对拟态弧菌致病相关生物学特性的影响。【方法】采用自然转化的方法构建拟态弧菌PrtV基因缺失株(ΔPrtV),同时通过基因与质粒重组后电转化导入缺失株构建回补株(ΔPrtV/pPrtV),对突变株的生长特性、生化特征、生物被膜形成、自聚集能力、胞外产物卵磷脂酶和蛋白酶活性,以及致病性和细胞毒性等进行分析。【结果】与野生株相比,缺失株的生长特性、生物被膜形成、自聚集能力和卵磷脂酶活性无变化,但分解尿素、甘氨酸、香豆酸盐、鸟氨酸和赖氨酸的理化特性改变;胞外产物蛋白酶活性显著降低(P<0.05),细胞毒性显著下降(P<0.05),对杂交鲇的致病力下降10倍。【结论】PrtV基因与拟态弧菌的细胞毒性及致病性等多种生物学特性有关。该结果为进一步解析拟态弧菌PrtV基因功能及其致病机制提供了依据。     

通辽地区犊牛腹泻大肠杆菌耐药性检测及一株多重耐药菌全基因组测序分析

【背景】大肠杆菌(Escherichia coli)是引起犊牛腹泻的最主要病原菌,其耐药性菌株的不断出现引起广泛关注。【目的】了解内蒙古自治区通辽市犊牛腹泻大肠杆菌耐药性及耐药基因流行情况。【方法】从通辽市多个旗县采集犊牛腹泻样品40份,经细菌分离纯化及16S rRNA基因测序,最终鉴定出20株大肠杆菌。采用药敏试验和PCR方法对分离菌进行耐药性及耐药基因检测分析,并对其中1株多重耐药菌株进行全基因组测序。【结果】20株分离菌均具有多重耐药性,对链霉素、环丙沙星、恩诺沙星和复方新诺明的耐药率达80%以上。所检耐药基因中,aphA1、strB、TEM-1和qnrS检出率达100%。通过对代表性菌株TL-13全基因组测序发现,其基因组大小为4897185bp,GC含量为50.68%,同时携带2个质粒,大小分别为108288bp(pTL13-1)和64018bp(pTL13-2)。质粒中共携带18个可移动耐药基因。【结论】通辽地区犊牛腹泻大肠杆菌多重耐药性普遍存在,4种常见耐药基因普遍流行。     

pVA质粒中II型分泌系统同源基因对副溶血弧菌生物学特性及PirAB表达和分泌的影响

【背景】副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是引起养殖对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)的病原之一，毒素蛋白PirAB是该病原的致病因子，由病原携带的pVA质粒上的pirA和pirB编码。PirAB的分泌途径尚未明确。【目的】探究pVA质粒中Ⅱ型分泌系统同源基因epsG2和epsE2对副溶血弧菌生物学特性及PirAB表达和分泌的影响。【方法】通过生物信息学分析发现副溶血弧菌VP220218株pVA质粒上存在2个Ⅱ型分泌系统(type Ⅱ secretion system, T2SS)的同源基因epsG2和epsE2；利用框内缺失方法构建了突变株ΔepsG2和ΔepsE2，检测其生长、生物被膜形成、运动力和胞外蛋白酶活力的变化，进一步用RT-qPCR和Western blotting分析了PirAB表达和分泌的变化。【结果】epsG2和epsE2能够抑制VP220218的胞外蛋白酶活力(P<0.001)、在对数生长期抑制细菌的生长(P<0.05)；此外，epsG2能够促进细菌的运动(P<0.05)、在平台期抑制VP220218的生物膜形成(P<0.05)，epsE2能够抑制细菌的运动、在对数生长中后期促进VP220218的生物膜形成(P<0.05)。RT-qPCR结果显示，epsE2对pirA和pirB的表达无影响；epsG2在对数生长初期和中期抑制pirA和pirB的表达，在对数生长后期和平台期则促进pirA和pirB的表达。Western blotting结果显示，epsG2对PirAB的合成和分泌无影响，epsE2能够促进PirAB的合成和分泌。【结论】epsG2和epsE2参与了副溶血弧菌VP220218的生理活动，且epsE2影响PirAB的合成和分泌。研究结果为了解致AHPND菌PirAB毒素的合成和分泌途径提供了参考。     

H2O2预处理胜利褐煤镜质组的生物产气研究

【目的】研究H₂O₂处理对煤中镜质组生物产气的影响。【方法】选择内蒙古胜利褐煤作为研究对象,以实验室前期富集保存的产甲烷微生物作为出发菌群,首先通过浮选对煤炭进行显微组分分离(高镜质组GJ、中镜质组ZJ和低镜质组DJ),并对煤的物化性质进行表征,然后在固液比1:15、H₂O₂浓度10%、预处理时间30 d条件下用H₂O₂处理不同镜质组含量的样品,再以处理前后的原煤及残煤进行生物产气实验。采用气相色谱、X射线衍射和傅里叶变换红外光谱等方法分析H₂O₂处理前后产气及煤的物化性质变化。【结果】经过H₂O₂预处理后,煤中镜质组的含量有所下降,挥发成分增加,固定碳减少,H₂O₂与高镜质组煤样反应更剧烈,氧含量增加,碳含量减少。未经过处理的煤在100 d时产甲烷量为GJ＞ZJ＞DJ,分别为174.24、164.31、135.52 μmol/g煤,而经过H₂O₂预处理的煤在20 d后停止产气,最终产甲烷量分别为39.63、39.61、41.55μmol/g煤,比原煤产气减少了77.26%、75.89%和69.34%。随着镜质组含量的增加,经过H₂O₂处理后的煤样芳香环层片的层间距d₀₀₂、单层层片的延展度L_a和层片的堆叠度L_c减小,而芳香层数N增加,表明晶核结构变小。经过H₂O₂处理后煤芳烃碳、芳香族、C=O基团和C=C基团所占比例增加,芳环缩合度增大,含氧官能团变多。【结论】利用H₂O₂长时间处理使煤基质中较易被微生物利用的有机质结构减少,从而降低了产气能力。     

苯唑西林敏感、mecA基因阳性的猪源金黄色葡萄球菌的流行、分子分型及耐药性研究

[目的] 为了解我国猪源苯唑西林敏感-mecA阳性金黄色葡萄球菌（Oxacillin-susceptible,mecA-positive Staphylococcus aureus,OS-MRSA）的流行情况、菌株分子特征及耐药性,本研究对我国中西部4个省份（甘肃、陕西、河南和广西）的9个规模化养猪场进行鼻腔拭子样本采集。[方法] 运用PCR扩增nuc和mecA基因及苯唑西林耐药性检测对OS-MRSA菌株进行分离鉴定。然后对分离所得的OS-MRSA菌株进行26种毒素编码基因、16种抗生素耐药性以及spa、MLST和SCCmec分型检测。[结果] 结果表明,采集的884份样本中,67份样本7.6%（67/884）分离到金黄色葡萄球菌,包括50株甲氧西林敏感菌株（Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus,MSSA）、8株苯唑西林耐受-mecA阳性金黄色葡萄球菌（Oxacillin-resistant mecA-positive,OR-MRSA）和9株OS-MRSA菌株。26种被检毒素编码基因中有9种毒素编码基因被检出,其中hla基因检出率最高,其次为hld、hlb、hlg、sei、sem、seg、sen和seo。此外,67株分离株中仅有16株携带肠毒素编码基因,其中OR-MRSA和OS-MRSA菌株分别占37.5%（6/16）和50.0%（8/16）,且携带毒素编码基因的菌株克隆型均为ST9-t899。16种所测试抗生素中,菌株对12种抗生素表现为耐药,其中MSSA、OR-MRSA和OS-MRSA分离株分别主要对1-8、10-12和7-11种抗生素耐药。所有分离株共有4种克隆型ST398-t571、ST9-t899、ST398-t034和t11241,其中ST9-t899为MRSA菌株唯一克隆型和ST398-t571为MSSA优势克隆型。除4株分离株未检测到SCCmec分型外,IV_b（76.5%,13/17）是MRSA分离株的唯一分型。[结论] 结果表明,我国猪源MRSA分离株对苯唑西林药物敏感性发生了改变,出现了较多的苯唑西林敏感菌株。此外,MSSA和MRSA分离株优势克隆型分别为ST398-t571和ST9-IVb-t899。研究还发现,克隆型与毒素编码基因有显著相关性,携带毒素编码基因的菌株克隆型均为ST9-t899。通过了解我国猪源MSSA、OR-MRSA和OS-MRSA的流行、分子特征和耐药性,可以为我国猪源金黄色葡萄球菌的防控提供数据支持。     

水稻条斑病菌gacA基因的克隆及功能初析

根据黄单胞菌gacA基因的同源性设计简并引物,采用PCR方法从水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)中克隆了gacA同源基因,命名为gacA_Xooc。序列比较显示,该基因在黄单胞菌中是相对保守的。通过同源重组的方法,构建了gacA_Xooc的插入突变株。对0.1% Tryptone的趋化应答能力检测发现,gacA突变株的趋化能力明显降低,证明gacA与Xooc的趋化性相关。