白木香SRAP-PCR反应体系的建立

本实验对白木香SRAP-PCR反应体系的影响因素(模板DNA,Taq 酶,Mg2+,dNTP,引物)在4个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立白木香SRAP-PCR反应的最佳体系(20 μL):模板DNA 50 ng、引物0.30 μmol/L、Mg2+ 1.5 mmol/L、dNTP 0.4 mmol/L和Taq DNA聚合酶1.0 U.适用于白木香的SRAP-PCR反应体系迄今未见报道,这一优化系统的建立为今后利用SRAP标记技术对白木香进行基础研究提供了一个标准化的程序.     

缢蛏SRAP-PCR体系的正交优化

运用L16(45)正交设计对影响缢蛏SRAP-PCR反应的5个因素:Taq酶浓度、Mg2+浓度、模板DNA浓度、dNTPs浓度和引物浓度在4个水平上进行了优化试验,PCR结果采用SPSS v16.0软件分析.结果表明,各因素对SRAP-PCR反应的影响依次为:引物>Taq酶>模板DNA>Mg2+;缢蛏SRAP反应最佳体系为:在20μL PCR反应体系中,引物0.3 μmol/L、Taq 酶0.5 U、模板DNA 50 ng、dNTPs 0.2 mmol/L及Mg2+2 mmol/L.用不同缢蛏的基因组DNA两次SRAP-PCR扩增,8对引物均能扩增出清晰且重复性好的谱带.因而建立的缢蛏反应体系稳定可靠.     

罗汉果SRAP反应体系的建立与优化

建立适合罗汉果的SRAP-PCR扩增体系,为罗汉果的遗传图谱构建及基因定位奠定基础。实验对罗汉果SRAP-PCR反应体系的影响因素(引物,dNTP,Taq酶,Mg~(2+),模板DNA)在多个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了罗汉果SRAP-PCR反应的最佳体系(10μL):引物0.6μmol/L、dNTP0.25 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5U、Mg~(2+)2.0 mmol/L和模板DNA 30 ng。该体系的建立能很好的满足罗汉果基因组DNA的扩增要求,SRAP标记应用于罗汉果遗传研究是可行的。     

正交试验优化八角ISSR-PCR反应体系

利用正交试验设计研究Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物(UBC 886)、dNTP、Mg2+浓度5个因素对云南八角ISSR-PCR反应的影响,建立其最佳反应体系。结果表明:25μL的反应体系中5个因子的最佳水平为:Mg2+3 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L。PCR最佳反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,46℃退火45 s,72℃延伸1 min,40次循环;72℃最后延伸7 min,4℃保存。     

马铃薯SRAP-PCR反应体系优化及验证

为建立马铃薯最佳的SRAP-PCR反应体系,以马铃薯基因组DNA为模板,采用单因素和正交试验相结合的方法,对影响SRAP-PCR反应体系的5个因素(引物浓度、Mg2+浓度、模板DNA用量、d NTPs浓度和Taq DNA聚合酶用量)进行优化,建立马铃薯优化的SRAP-PCR反应体系。结果表明:马铃薯SRAP-PCR最佳反应体系中模板DNA用量为60 ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,d NTPs浓度为0.25 mmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为0.75 U。各因素对扩增结果影响依次是:Mg2+浓度Taq DNA聚合酶用量模板DNA用量引物浓度d NTPs浓度。用6份马铃薯样品DNA对优化体系进行验证,扩增结果清晰稳定,可用于马铃薯遗传多样性分析和遗传图谱构建等研究。     

怀地黄SRAP扩增体系的建立与引物的筛选

为建立适合怀地黄SRAP-PCR分子标记技术体系,通过单因子实验分别研究了DNA模板浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、引物浓度以及dNTP浓度对怀地黄SRAP扩增反应的影响,确立了适合怀地黄SRAP最佳反应体系为:在25μL的反应体系中,模板DNA量20ng/25μL、2.5mmol/LMg2+、0.32μmol/L的上下游引物、0.30μmol/L的dNTP以及2.5UTaq酶,并利用确定的体系从88个引物组合中筛选出12对适合怀地黄SRAP-PCR反应的引物。     

利用正交设计优化异色瓢虫SRAP-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对异色瓢虫Harmonia axyridis(Pallas)SRAP-PCR反应体系的5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物)在4个水平上进行优化试验,试验结果用DPS和MINITAB软件进行分析,建立了异色瓢虫SRAP-PCR反应的最佳体系,即在20μL体系中模板50~100ng、引物0.25μmol/L、dNTPs0.1mmol/L、Taq DNA聚合酶1.5U、Mg2+0.375~0.625mmol/L。并对反应体系进行梯度退火试验,得到最佳退火温度为50.3℃。这一优化系统的建立,为今后利用SRAP技术进行瓢虫遗传图谱的构建、多态性分析和基因定位奠定了技术基础。     

毛薯ISSR-PCR反应体系的建立

本研究主要建立毛薯ISSR-PCR的最佳反应体系。研究采用改良CTAB法提取毛薯总基因组DNA,应用单因子实验法设定模板DNA,Mg2+浓度,dNTP浓度,Tap酶浓度以及退火温度的5个不同梯度,探讨单因素变化对毛薯ISSR-PCR扩增的影响。实验结果表明,毛薯ISSR-PCR最佳反应体系为:总体积20μL,模板DNA为50ng、Taq酶为0.8U、Mg2+浓度为2.0mmol/L、引物浓度为0.5μmol/L、dNTPs浓度为0.5mmol/L。     

大苞萱草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

分别采用正交设计和单因子试验两种方法对影响大苞萱草ISSR-PCR反应体系的4个因素(Taq酶,Mg2+,dNTP,引物)在3个水平上进行优化试验。正交设计选用L9(34)方案,采用直观分析法获得影响因素最佳反应水平。单因子试验分别研究各因素对ISSR-PCR反应的影响情况,找出最佳反应水平。两种方法所得影响因素最佳水平存在差异,通过综合比较与分析,最终建立了大苞萱草ISSR-PCR的最佳反应体系。在20μL的反应体系中:Taq酶1 U,Mg2+1.5 mmol/L,dNTP0.20 mmol/L,引物0.4μmol/L,1×PCR buffer,30 ng模板DNA。在此基础上筛选出10个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度。     

节瓜ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

旨在开展节瓜种质资源分类鉴定与遗传多样性研究。通过正交试验设计与单因素分析相结合的方法,对节瓜ISSR-PCR反应体系5个因素(模板DNA浓度、dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓度与Taq聚合酶浓度)在4个水平上进行优化分析,建立了节瓜稳定可靠且具丰富多态性的最佳反应体系,进而对引物退火温度进行梯度试验分析。结果表明,20μL节瓜ISSRPCR最佳反应体系为70 ng模板DNA、0.2 mmol/L dNTP、1.2 mmol/L Mg2+浓度、0.96μmol/L引物、0.8 U Taq DNA聚合酶和2.0μL10×buffer;引物IS807最佳退火温度为53℃。以此为基础,利用4条引物对4份节瓜种质进行最佳反应体系稳定性验证,证明该体系稳定可靠、扩增谱带清晰、多态性丰富且重复性较好。