重组质粒转染蟑螂对黑胸大蠊浓核病毒的拯救

用Ｇｌａｓｓｍｉｌｋ法纯化ＰｆＤＮＶｄｓＤＮＡ,在其３′端和ＰｓｔⅠ切开的ｐＵＣ１１９质粒的３′端分别加ｄＧ和ｄＣ尾,连接、转化、筛选得到分子量为８．７ｋｂ的重组质粒。通过酶切证明插入ＤＮＡ为ＰｆＤＮＶ全基因组ＤＮＡ。利用ＤＥＡＥｄｅｘｔｒａｎ转染技术,将此重组质粒导入黑胸大蠊幼虫体内,此重组质粒能使虫体发病死亡。电镜超薄切片观察发现虫体细胞内存在大量的病毒粒子。同样,在免疫扩散实验中虫体ＰＢＳ浸出液能与抗ＰｆＤＮＶ的抗体产生沉淀线。用重组质粒感染致死的虫体喂食健康黑胸大蠊,也能使其发病死亡,通过电镜可以观察到在细胞内增殖的病毒粒子。     

含荧光素酶基因的黑胸大蠊浓核病毒重组质粒的构建与表达

黑胸大蠊(Periplaneta fuliginosa)是我国分布最广的蟑螂种类.黑胸大蠊浓核病毒(Periplaneta fuliginosa densovirus, PfDNV)是我室1991年在国内首次报道并在国内外第一个分类鉴定的蟑螂细小病毒[1].我们构建了PfDNV全基因组克隆和酶切亚克隆重组质粒,测定并分析了病毒基因组全序列与结构.序列分析表明该病毒基因组具有细小病毒基因组的结构特征,其末端具有反转重复序列(Invert Terminal Repeatant, ITR)和回文结构,这类病毒基因组两端的特殊结构可能是与病毒复制,整合,拯救,包装有关的必需顺式元件[2～5].为了进一步研究黑胸大蠊浓核病毒基因复制及表达机理,尤其是其末端结构在病毒基因复制中的作用,我们将荧光素酶基因插入了PfDNV基因组保留了两个完整的末端结构而其它部分缺失的重组质粒中.将这种重组质粒转染虫体后,在虫体中检测到了荧光素酶的表达,说明在缺失基因组中间部分时,插入的外源基因依然可以复制、表达.本结果证实了PfDNV基因组的末端结构是PfDNV复制的必需结构.这一实验为将外源基因引入病毒基因组,构建基因工程杀虫剂提供了有效的技术途径.现将结果报告如下.     

黑胸大蠊浓核症病毒的研究

1990年我们从黑胸大蠊(Periplaneta fuliginosa)的若虫中,首次分离发现黑胸大蠊浓核症病毒(PfDNV)。根据Kock's 法则,将它进行了回感试验,结果表明：这一病毒对该虫可引起同样的病症,并从中重新分离出完全一样的DNV。同时,对诊病毒进行了分类鉴定,结果表明：其病毒粒子的形态结构呈球状二十面体,大小一致, 直径为20 nm; 病毒核酸呈线状, 长度为1.7/μm 分子量为1.7x10⁶ Dal(ssDNA),基因组为单链DNA;结构蛋白为4条多肽,分子量分别为81k、62k、53k、29k。根据病毒分类命名原则,证明从黑胸大蠊中分离出的病毒属细小病毒科(Parvoviridae)中的浓核症病毒属(Desovirus)。我们将它命名为黑胸大蠊浓核症病毒Periplaneta fugtnosa Densonucleosis Virus简称PfDNV).     

黑胸大蠊（Periplaneta fuliginosa）病毒的分离及某些特性

从黑胸大蠊(Periplaneta fuliginosa)自然罹病的虫尸中分离得到一株非包涵体病毒。将病毒悬液均匀拌入无菌饲料并供食154～169日龄黑胸大蠊健康若虫时,能使其感染、发病,死亡率可达98％以上。在电子显微镜下观察时,病毒为球形二十面体颗粒,直径约23nm。病毒悬液具有典型核蛋白紫外吸收光谱。病毒用DNase和RNase处理并经吖啶橙染色、二苯胺和苔黑酚试验及甲醛反应证明:该病毒含有单链DNA。以上特性与细小病毒科的特征有点类似。     

黑胸大蠊浓核病毒NS2蛋白亚细胞定位

黑胸大蠊浓核病毒(Periplaneta fuliginosa densonucleosis virus,PfDNV)是胡远扬等人在国内首次报道,并在国内外第一个正式分类鉴定的蟑螂浓核病毒[1],ICTV第八次会议正式将其独立列为一个属:Pefudensovirus.     

Bac-to-Bac系统在杆状病毒功能基因研究上的应用

利用Bac-to-Bac系统,在大肠细菌中复制增殖杆状病毒质粒bacmid,并通过RecA介导法、ET-recombination法在bacmid DNA上缺失或插入功能基因,构建功能基因缺陷型或补回型的杆状病毒质粒.该质粒转染到昆虫细胞中产生重组病毒,进而在细胞甚至虫体水平上研究基因的功能,极大改善了传统上用空斑实验筛选重组病毒的不足.     

用大肠杆菌同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组

利用大肠杆菌细胞内质粒间同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组 DNA,高效构建携带有外源基因的均一重组腺病毒 .将带有狂犬病毒糖蛋白 (GP)基因和加强型 GFP(enhanced GFP,EGFP)表达盒的重组穿梭质粒 p Ad- Track- CMV/ GP与腺病毒骨架载体质粒 p Ad Easy- 1一起同时电击共转化大肠杆菌 BJ51 83.在 BJ51 83细胞内 ,带有同源序列的重组穿梭质粒与骨架载体可进行同源重组 ,得到以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组 p Ad- GP’.以 p Ad- GP’为模板 ,经DNA测序确认 GP基因成功整合入此质粒中的腺病毒基因组 E1区外源基因表达盒中 .线形化的p Ad- GP’转染 2 93细胞后可得到基因组结构均一、在 E1区插入有 GP和 EGFP表达盒的重组腺病毒 ,病毒滴度可达 1× 1 0 8pfu/ ml.电镜下此重组病毒颗粒直径约为 70 nm,略呈球形 ,用荧光显微镜观察感染细胞有很强的 EGFP表达 .实验表明 :利用大肠杆菌同源重组获得克隆化的重组腺病毒基因组 DNA,可高效制备高滴度的均一重组腺病毒     

CH50真核表达载体pCH503的构建及小鼠体内表达的趋化与抗肿瘤活性

构建重组 FN多肽 CH50真核表达载体并在小鼠体内表达 ,研究其趋化与抗肿瘤作用 .采用重组 DNA技术构建表达质粒 ;体内进行基因转染 ,采用 RT- PCR鉴定导入基因的表达 ;通过肝素亲和层析、SDS- PAGE和 Western blot鉴定表达产物 ;腹腔细胞计数、Giemsa染色分析以及肌肉组织切片与染色观察体内基因转染后的趋化作用 ;小鼠黑色素瘤模型研究基因转染抑制肿瘤的作用 .从 CH50原核表达载体获得重组多肽的 c DNA,5′端加上小鼠 IFN- 5′端非编码区和信号肽编码区的 c DNA,3′端加上人 FN c DNA的 3′端非编码区 ;将重组 c DNA插入 p REP8质粒 ,即构建出p CH50 3质粒 .巨噬细胞在体内经 p CH50 3转染 ,然后在体外培养 ,能够产生 CH50多肽 .以p CH50 3分别进行腹腔基因转染和肌肉内基因转染 ,均可对免疫细胞产生趋化作用 ;p CH50 3体内转染可以使小鼠腹腔内黑色素肿瘤结节数降低 50 %～ 60 % . CH50真核表达载体 p CH50 3可在小鼠体内表达 ,体内基因转染可趋化免疫细胞和抑制肿瘤结节形成 ,在肿瘤综合治疗中有重要意义 .     

感染性猪圆环病毒2型基因组DNA的分子克隆

本研究通过PCR扩增出猪圆环病毒2型(PCV-2)的全基因组(1 768bp),克隆入pcDNA3载体的EcoRI酶切应点,获得含有PCV-2全基因组的重组质粒,命名为pcDNApcv2.将重组质粒大量扩增后,用EcoRI切出1 768bp的PCV-2全基因组,在体外用T4 DNA连接酶使其连接环化.用脂质体法将体外连接产物转染无PCV污染的PK-15细胞,经4次连续传代,用间接免疫荧光实验(IFA)及电镜观察证实已获得复制能力的PCV-2病毒.由此可见,本试验构建的环化的PCV-2全基因组DNA具有感染性.     

CH50真核表达载体pCH503的构建及小鼠体内表达的趋化与抗肿瘤活性

构建重组 FN多肽 CH50真核表达载体并在小鼠体内表达 ,研究其趋化与抗肿瘤作用 .采用重组 DNA技术构建表达质粒 ;体内进行基因转染 ,采用 RT- PCR鉴定导入基因的表达 ;通过肝素亲和层析、SDS- PAGE和 Western blot鉴定表达产物 ;腹腔细胞计数、Giemsa染色分析以及肌肉组织切片与染色观察体内基因转染后的趋化作用 ;小鼠黑色素瘤模型研究基因转染抑制肿瘤的作用 .从 CH50原核表达载体获得重组多肽的 c DNA,5′端加上小鼠 IFN- 5′端非编码区和信号肽编码区的 c DNA,3′端加上人 FN c DNA的 3′端非编码区 ;将重组 c DNA插入 p REP8质粒 ,即构建出p CH50 3质粒 .巨噬细胞在体内经 p CH50 3转染 ,然后在体外培养 ,能够产生 CH50多肽 .以p CH50 3分别进行腹腔基因转染和肌肉内基因转染 ,均可对免疫细胞产生趋化作用 ;p CH50 3体内转染可以使小鼠腹腔内黑色素肿瘤结节数降低 50 %～ 60 % . CH50真核表达载体 p CH50 3可在小鼠体内表达 ,体内基因转染可趋化免疫细胞和抑制肿瘤结节形成 ,在肿瘤综合治疗中有重要意义 .     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism