真核生物的DNA甲基转移酶与DNA甲基化

真核生物的ＤＮＡ甲基化就是在ＤＮＡ的ＣｐＧ二核苷酸胞嘧啶的第 5位碳原子上加上甲基 ,催化这一过程的是ＤＮＡ甲基转移酶 (Ｄｎｍｔ)。ＤＮＡ的甲基化修饰参与基因表达调控、胚胎发育、细胞分化、基因组印迹、Ｘ染色体灭活和细胞记忆等诸多重要生物学过程[1,2 ] 。在不同组织或同一类型细胞的不同发育阶段 ,基因组ＤＮＡ上各ＣｐＧ位点甲基化状态的差异即构成基因组的ＤＮＡ甲基化谱。根据催化反应类型。可以将ＤＮＡ甲基转移酶分为三类 :第一类将腺嘌呤转化成Ｎ6 甲基腺嘌呤 ;第二类将胞嘧啶转化成Ｎ4 甲基胞嘧啶 ;第三类将胞嘧啶转化成…     

用PCR扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组DNA

根据已发表的序列,分别在鸡贫血病毒（ＣＡＶ）环形基因组ＤＮＡ（全长２．３ｋｂ）的ＥｃｏＲＩ位点和ＢａｍＨＩ位点的两侧选择适当序列合成两对引物,用ＰＣＲ技术,从斑点杂交检测到病毒核酸的ＣＡＶ感染的ＭＤＣＣＲＰ１细胞基因组ＤＮＡ中,分别扩增出包含ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ分割开的病毒基因组两部分（１．５ｋｂ和０．８ｋｂ）约１．５ｋｂ和约１．２５ｋｂ的两个片段。再将其中相应序列拼接克隆进ｐＵＣ１８载体,获得包含ＣＡＶ全基因组序列ＤＮＡ片段的克隆质粒ｐＣＡＶ２．４。酶切分析表明,该质粒具有预期的ＢａｍＨＩ位点、ＰｓｔＩ位点、ＨｉｎｄⅢ位点,而预期的ＥｃｏＲＩ位点消失。重组质粒插入ＤＮＡ片段的两端序列分析表明,质粒ｐＣＡＶ２．４是包含ＣＡＶ全基因组序列的重组质粒,插入ＤＮＡ片段序列中的ＥｃｏＲＩ位点序列发生了一个碱基突变。     

大鼠衰老过程中脑细胞DNA与c－Ha－ras原癌基因的甲基化

用ＭｓｐⅠ／ＨｐａⅡ酶解电泳法和高效液相色谱（ＨＰＬＣ）两种方法进行比较,研究了不同年龄大鼠的肝、脑细胞基因组ＤＮＡ的甲基化程度。从酶解电泳图谱可观察到,肝、脑细胞基因组ＤＮＡ甲基化在青年鼠和老年鼠之间没有差异。但用具有高分辨率的高效液相色谱测量ＤＮＡ中５－ｍＣ的含量时发现,老年鼠脑细胞ＤＮＡ甲基化程度较大年鼠的下降６２％,而肝细胞ＤＮＡ甲基化程度在老年鼠与青年鼠之间并没有显著差异。这些结果提示：（１）用常规的酶解电泳法所分析的ＤＮＡ甲基化结果并不能反映整个基因组ＤＮＡ甲基化的水平。（２）衰老过程中,不同组织ＤＮＡ甲基化的改变存在差异,引起这种差异的原因可能与组织的增殖和分化程度有关。进一步分析脑细胞原癌基因ｃ－Ｈａ－ｒａｓ的甲基化水平,无论ＭｓｐⅠ酶切图谱,还是ＨｐａⅡ酶切图谱均可观察到分子大小为１９ｋｂ、７．５ｋｂ、１．３ｋｂ、０．９ｋｂ的四条阳性带,说明该基因未发生甲基化,且与年龄无关。     

用富集文库克隆人胰岛素基因组基因

通过构建可富集人胰岛素基因的λ噬菌体文库,克隆了人胰岛素基因组基因．首先从中国人血液白细胞中提取到人基因组ＤＮＡ,用ＥｃｏＲⅠ和ＢｇｌⅡ对基因组ＤＮＡ进行全酶切,经０．４％琼脂糖凝胶电泳,特异回收９．５ｋｂ左右的ＤＮＡ片段．将该片段与λＥＭＢＬ３／ＢａｍＨⅠ臂连接,构建成一个特殊的人基因组λ噬菌体文库（富集文库）,效价为２×１０４．同时采用ＰＣＲ方法及用引物Ⅰ：５′ＧＧＡＣＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧ３′,引物Ⅱ：５′ＣＴＧＣＧＴＣＴＡＡＴＴＧＣＡＧＴＡＧＴＴＣ３′,从人基因组ＤＮＡ中扩增出一段含胰岛素基因的１．３６ｋｂＤＮＡ片段,做为放射性标记探针,对文库进行了噬菌斑原位杂交筛选,从１×１０４个噬菌斑中筛选到一个含人胰岛素基因组基因的阳性克隆,并进一步完成了亚克隆和该基因１７３２ｂｐＤＮＡ序列的测定．结果该基因的１７３２ｂｐＤＮＡ序列包括部分５′端和３′端与国外发表的人胰岛素α型等位基因的序列相同     

DNA甲基化的3种可能转录抑制机制

尽管ＤＮＡ甲基化能抑制转录这一观点早已为人所知 ,但其精确的机制还不完全清楚[1] 。到目前为止 ,有 3种可能的机制被用来解释甲基化的转录抑制过程。第一种机制是ＤＮＡ甲基化直接干扰特异转录因子与各自启动子的识别位置结合[2 ] 。几种转录因子 ,如ＡＰ 2、Ｃ Ｍｙｃ/Ｍｙｎ、ＣＡＲＥＢ、Ｅ2Ｆ和ＮＦ κＢ ,能识别含ＣｐＧ残基的序列 ,当ＣｐＧ残基上的Ｃ被甲基化后 ,结合作用即被抑制 (图 1 )。相反 ,其他一些转录因子 (如ＳＰ1和ＣＴＦ)对结合位置上的甲基化不敏感 ,还有许多因子在ＤＮＡ上的结合位点上不含ＣｐＧ二核苷酸 ,ＤＮＡ…     

乙肝病毒核衣壳启动子内三链DNA的形成

用电泳迁移分析方法研究了２１ｎｔ脱氧寡核苷酸Ｇ３ＴＧ２ＴＧＴ２Ｇ５ＴＧ２ＴＧＴ（ＣＰ１）与１２９ｂｐ的乙肝病毒（ＨＢＶ）核衣壳启动子（Ｃｐ）片段内一位点结合形成的三链ＤＮＡ的特异性及稳定性．在克隆有ＨＢＶ基因组的质粒ｐＣＰ１０的酶切产物中,ＣＰ１仅与含Ｃｐ的１２９ｂｐ片段结合．在２０ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋溶液中其解离常数（Ｋｄ）为１．４×１０－７ｍｏｌ／Ｌ．不同离子稳定三链ＤＮＡ的效果依次为ｓｐ４＋（精胺）＞Ｍｇ２＋＞Ｚｎ２＋＞Ｎａ＋＞Ｋ＋,离子之间存在相互竞争作用．比ＣＰ１多一误配碱基的脱氧寡核苷酸Ｇ２ＴＧ２ＴＧＴＧ３ＴＧ２ＴＧ２ＴＧ２Ｔ（ＣＰ２）在２０ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋溶液中与Ｃｐ结合的Ｋｄ值约为ＣＰ１的１／７,而在６０ｍｍｏｌ／ＬＫ＋或５ｍｍｏｌ／ＬＺｎ２＋溶液中检测不到它与Ｃｐ的结合,这进一步显示了三链ＤＮＡ形成的特异性．细胞的生理离子浓度被认为是：Ｓｐ４＋１ｍｍｏｌ／Ｌ,Ｍｇ２＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ,Ｋ＋１４０ｍｍｏｌ／Ｌ,因此,ＣＰ１在细胞内将能特异地与Ｃｐ结合并具有较好的稳定性．     

胶质细胞源神经营养因子cDNA全序列的克隆及其生物学功能的研究

为了研究ＧＤＮＦ在神经系统中的生物学功能,通过ＲＴ－ＰＣＲ方法从大鼠睾丸总ＲＮＡ中扩增出ＧＤＮＦｃＤＮＡ全序列,序列分析表明与ＧｅｎＢａｎｋ中的顺序完全相同．将ＧＤＮＦｃＤＮＡ以非融合方式连接在真核表达载体ｐＥＧＦＰ－ＮⅠ的绿色荧光蛋白的上游,在ＣＭＶ启动子控制下表达．通过绿色荧光蛋白报告基因的表达表明ＧＤＮＦｃＤＮＡ能在真核细胞ＨｅＬａ中很好表达．采用裸ＤＮＡ转染方法研究ＧＤＮＦ对损伤的坐骨神经的修复作用,在雏鸡出生后３ｈ切断其右侧坐骨神经,将ｐＥＧＦＰ－ＧＤＮＦ与Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ的混合物注射到坐骨神经切断位点附近肌肉内,５ｄ后追补一次．２０ｄ后进行实验检测,观察到ＧＤＮＦｃＤＮＡ的转染阻止了切断神经侧的腰脊髓内［Ｌ４－Ｌ６］运动神经元的大量死亡,并显著促进了切断坐骨神经的再生．     

乙肝病毒核衣壳启动子内三链DNA的形成

用电泳迁移分析方法研究了２１ｎｔ脱氧寡核苷酸Ｇ３ＴＧ２ＴＧＴ２Ｇ５ＴＧ２ＴＧＴ与１２９ｂｐ的乙肝病毒核衣壳启动子片段内一位点结合形成的三链ＤＮＡ的特异性及稳定性。在克隆有ＨＢＶ基因组的质粒ｐＣＲＰ１０的酶切产物中,ＣＰ１仅与含Ｃｐdisplay structure     

人类基因组辞汇(续)

人类基因组辞汇（续）柴建华ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＰｒｏｂｅ杂交探针。一个小的ＤＮＡ（或ＲＮＡ）分子。用同位素（或非放射性染料,或荧光染料）标记后可用分子杂交的方法探测同源顺序的存在。ＨＴＦＩｓｌａｎｄＨＴＦ岛。“Ｈｐａｌｌ-Ｔｉｎｙ-Ｆｒａｇ－ｍｅｎｔ”（Ｈｐａｌｌ小片段岛）,也叫做ＣｐＧ岛。单拷贝,在脊椎动物基因组内为非甲基化位点。     

棒状杆菌2,5—二酮基—D—葡萄糖酸还原酶Ⅰ基因在大肠杆菌中的克隆？…

从棒状杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ＳＣＢ３０５８）初步纯化得到两个２,５－二酮基－Ｄ－葡萄糖酸（２,５－ＤＫＧ）还原酶,在此基础上利用ＰＣＲ技术,以基因组ＤＮＡ为模板,扩增得到含有２,５－ＤＫＧ还原酶Ⅰ基因的片段,定向连接到ＰＧＥＭ３Ｚｆ（＋并转化大肠杆菌ＤＨ５α,是到阳性克隆ｐＧＥＭ８１３。     

p53基因对人胃癌细胞系恶性生长的影响

以ｐ５３ｃＤＮＡ为探针,用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹法对人胃癌细胞系ＢＧＣ８２３进行了检测,发现该细胞中ｐ５３基因存在异常,将可在真核细胞表达的重组野生型Ｐ５３质粒ｐＣ５３－ＳＮ３和突变型ｐ５３质粒ｐＣ５３－ＳＣＸ３,用指质体介导法,分别导入ＢＣＧ８２３细胞,获得了较长时间受Ｇ４１８的多个阳性克隆。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ抑迹法证实阳性克隆细胞中有外源性ｐ５３基因存在。     

人淋巴细胞CD2基因5’侧翼序列的克隆和鉴定

本文报告以ＣＤ２ｃＤＮＡ５’端的片段作探针,从人Ｔ淋巴细胞基因组文库筛选阳性重组克隆,经限制性内切酶降解和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析,证明其中一个阳性克隆的插入片段中含ＣＤ２基因５’侧翼顺序。经插入片段的亚克隆、限制性内切酶图谱及ＤＮＡ序列分析,鉴定出一含转录起始点及其上游序列的４．０ｋｂ片段。将此片段中含转录起始点和两个ＤＮ（ａｓｅ）Ⅰ高敏感位点的２．５ｋｂ片段定向克隆到以虫萤光素酶为报告基因的表达载体ｐＭＧ３中,并用限制性内切酶对此２．５ｋｂ片段作不同程度缺失,构成一系列突变子。这些重组的表达质粒转染人ＪｕｒｋａｔＴ细胞后,以瞬时表达实验分析各突变子驱动虫萤光素酶基因的表达,结果发现在ＣＤ２基因５’上游具有很弱的启动子活性,初步测定该启动子位于－１．２ｋｂ～－９８ｂｐ域。ＣＤ２基因具有弱启动子、强增强子的特点与Ｔ细胞表面其它抗原分子基因是相似的。     

光敏核不育水稻光敏色素基因的RFLP分析

以灿稻“ＩＲ３６”光敏色素基因ｐｈｙＡ的ｃＤＮＡ克隆作探针,对光敏核不育水稻“农垦５８Ｓ”和对照水稻“农垦５８”进行ＲＦＬＰ分析,性内切酶ＥｃｏＲｖ,ＤｒａＩ,ＨｉｎｄⅢ、ＸｂａＩ、ＭｓｐＩ等都没有显示出多态性,而用ＨｐａⅡ显示出了多态性。ＭａｐＩ和ＨｐａⅡ是一对同裂酶（识别位点为ＣＣＧＧ）,但二者对识别位点上第２个胞嘧啶（即ＣｐＧ）甲基化的敏感性不同。实验结果表明,“农垦５８Ｓ”ｐｈｙＡ基因中Ｃ     

破伤风霉素C片段基因克隆,重组表达及免疫原性研究

应用ＰＣＲ技术从破伤风梭状芽孢杆菌ＤＮＡ中扩增出１．４ｋｂ ＤＮＡ基因,将其克隆到ｐＣＵ１８质粒中,经测序证明该ＤＮＡ片段为破伤风片段Ｃ的基因,并将此基因片段亚克隆到时ｐＧＥＸ－４５－２,构建成表达质粒ｐＧＥＸ－ＴＣ,在Ｅ．ｃｏｌｉ中进行表达。     

大鼠衰老过程中脑细胞DNA与c—Ha—ras原癌基因的甲基化

用Ｍｓｐ Ｉ／ＨｐａⅡ酶解电泳法和高效液相色谱（ＨＰＬＣ）两种方法进行比较,研究了不同年龄大鼠的肝、脑细胞基因组ＤＮＡ的甲基化程度。从酶解电泳图谱可观察到,肝、脑细胞基因组ＤＮＡ甲基化在青年鼠和老年鼠之间没有差异。但用具有高分辨率的高效液相色谱测量ＤＮＡ中５－ｍＣ的含量时发现,老年鼠脑细胞ＤＮＡ甲基化程度较青年鼠的下降６２％,而肝细胞ＤＮＡ甲基化程度在老年鼠与青年鼠之间并没有显著差异。这此结果提示     

乙型肝炎病毒与肿瘤抑制基因p53相互作用的生物学功能及意义

以前的研究发现：ＨＢＶ Ｘ蛋白能与肿瘤抑制基因ｐ５３蛋白结合,在原发性肝癌的发生中具有重要意义。为进一步探讨二者之间的关系,经过计算机比较分析发现,在ＨＢＶ基因组中存在与经典的ｐ５３ＤＮＡ－蛋白质结合位点类似的序列（ＴＧＣＣＴ）,用含有此序列的ＨＢＶ基因片段作探针,与肝癌细胞核蛋白作用,通过凝胶电泳迁移率移位实验、凝胶电泳迁移率超移位实验和原位紫外线交联实验,确定其ＨＢＶ ＤＮＡ与ｐ５３蛋白的特异     

HCV非结构蛋白(NS2/NS3)基因表达载体的构建及其一级结构分析

应用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术,从ＨＣＶ感染者血清中扩增编码ＨＣＶ病毒蛋白酶的ＮＳ２－ＮＳ３ｃＤＮＡ片段,在其５′和３′端分别引入ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ限制性内切酶位点,定向克隆至真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建重组载体ｐｃＤＮＡ－ＮＳ２３,重组表达载体经限制性内切酶消化鉴定．用ＳＰ６和Ｔ７通用引物对目的基因片断进行序列分析．序列同源性分析结果表明,与ＨＣＶ－Ｊ、ＨＣ－Ｃ２有高度的同源性,与ＨＣＶ－１、ＨＣＶ－Ｊ６、ＨＣＶ－Ｊ８同源性差,提示所克隆的基因属ＨＣＶⅡ型．该区内重要的功能位点如Ｚｎ２＋依赖性金属蛋白酶催化中心、丝氨酸蛋白酶催化中心等均高度保守     

毛细胞白血病5q13.3断裂位点线性DNA荧光原位杂交定位

毛细胞白血病经常与５ｑ１３．３断裂位点相关联,该断裂位点区域及位于这一区域的重要基因有待研究。我们探索了ＤＮＡ纤维荧光原位杂交方法（即ＤＮＡ纤维ＦＩＳＨ）检测该断裂位点的可行性。实验选用含有断裂位点区域的两个基因组克隆及位于断裂位上是的两个ｃｏｓ质粒探针与带有结构性到位（５）（ｐ１３．１ｑ１３．３）的线性ＤＮＡ共杂交（ＤＮＡ来自ＨＣＬ患者的细胞系）。实验证明该断裂位点将探针信号一分为二。根据这些结果描绘出断裂位点区域图。研究表明,ＤＮＡ纤维ＦＩＳＨ方法是绘制高精度物理图谱和检出遗传重排的一种有效的研究手段。     

人vigilin基因5'端调控区域的研究

在克隆了人基因组全长ｖｉｇｉｌｉｎ基因的基础上,对其５端转录调控区域再克隆,获得Ｖｉｇ－ＣＧ５－７Ｅ克隆,再用限制酶ＡｐａⅠ和ＥｃｏＲⅠ切除３端约４ｋｂ部分,得到Ｖｉｇ－ＣＧ５－７Ｅ３ＡＥ克隆,并对该克隆进行双向测序分析．结果表明：克隆Ｖｉｇ－ＣＧ５－７Ｅ用ＡｐａⅠ酶消化后,用ｃＤＮＡ上游开始的２０个碱基组成的寡聚核苷酸做探针进行分子杂交,可见一条小于０．１ｋｂ杂交带,根据物理图谱分析,位于Ｖｉｇ－ＣＧ５－７Ｅ３ＡＥ克隆的ＡｐａⅠ端,从而推断该克隆含有转录调控元件,５端序列分析得到二个ＴＡＴＡ盒,一个ＣＡＡＴ盒和一个ＧＣ盒以及二个可能的Ａｐ－１和Ａｐ－２结合位点．认为ＧＣ盒可能为人ｖｉｇｉｌｉｎ基因启动子的组成部分     

CD3ε和PMA对fas基因转录调控作用的研究

研究了ＣＤ３ε和ＰＭＡ对细胞凋亡基因ｆａｓ的转录调控作用．根据已知的人ｆａｓ基因５＇上游序列设计引物,用ＰＣＲ法从人胸腺细胞基因组ＤＮＡ中扩增出ｆａｓ５＇上游长为４４６ｂｐ的启动子片段．将此片段定向克隆到以虫荧光素酶为报告基因的真核细胞表达载体ｐＸＰ２中．经限制性内切酶酶切鉴定及序列测定分析表明此重组表达质粒ＤＮＡ的结构和序列正确．用此质粒（ｐＸＰ２－ｆａｓｕｐ）瞬时转染人ＪｕｒｋａｔＴ淋巴细胞,分析报告基因的表达水平．结果表明ｆａｓ基因上游－５０６到－６０的区域有弱启动子活性,约是阴性对照的１．５倍．抗ＣＤ３ε抗体和ＰＭＡ处理均可增强ｆａｓ启动子的活性,促进报告基因的表达,其虫荧光素酶活性分别是未经处理的ｐＸＰ２－ｆａｓｕｐ转染细胞的１．７倍和３．３倍,但二者没有协同作用．ＰＫＣ的抑制剂ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ和ＰＴＫ的抑制剂ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎＡ可抑制ＰＭＡ诱导的ｆａｓ基因转录,使虫荧光素酶基因的表达降至未用ＰＭＡ处理的水平．但ＰＴＫ的另一种抑制剂ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ可与ＰＭＡ发挥协同作用,上调ｆａｓ基因的转录,使虫荧光素酶活性增加到５倍．这些结果为阐明ＣＤ３ε及ＰＭＡ介导Ｔ淋巴细胞激活和凋亡的分子机制