对DNA与RNA区分染色实验的改进

核酸是主要的遗传物质 ,核酸的主要成分在细胞核中是 DNA,在细胞质与核仁中的是 RNA。由于 DNA与RNA在化学组成与分子结构上存在一定差别 ,因而对不同染料有不同的染色反应 ,可以根据这一原理来定性鉴定细胞中 DNA与 RNA的存在与分布。实验所采用染料为甲基绿 -焦宁 (Netyl- Green-Pyronin)染液 ,其中染液中的甲基绿能使细胞核中的DNA呈现绿色 ,而焦宁则能把细胞质与核仁中的 RNA染成红色。因此可以根据细胞中不同部位呈现颜色的不同来进行定性鉴定。1　材料与方法为了使实验方法快速简易而效果清晰准确 ,我们从染液的配方、材料…     

抗疟药物氯奎、阿的平、四氢-9-氨基(口了)啶与双链小牛胸腺DNA的结合

本文用体相微量量热计所得数据,估算了两种抗疟药物(antimalarial)分子和两种结构上相似的分子与DNA结合时的标准结合热焓。根据在不同离子强度下测定的表观结合常数获得了热力学结合常数。根据这些数据以及标准结合热焓计算出标准结合自由能、标准结合熵。结果发现凡与DNA结合的分子,具有线性芳环结构的,结合时主要取决于热焓的大小。具有脂肪链或脂肪环结构的,结合时主要取决于熵变。     

分子生物学技术讲座(六)──聚合酶链式反应(PCR)技术

聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）技术,简称PCR技术,是近年发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术。此方法操作简便快速,并且非常有效,可在很短的时间内得到数百万个特异DNA序列的拷贝。目前,此技术已在分子克隆、医学诊断、法医学和考古学等各个领域中得到广泛应用。1基本原理聚合酶链式反应用于扩增位于两个已知序列片段之间的DNA区段。其基本原理是利用TaqDNA聚合酶的聚合活性以及热稳定性,通过3个不同温度的重复循环,即首先双链DNA在含有两种过量引物和4种dNTPS的反应液中高温变性,然后在适当…     

应用于DNA分子转移和分子杂交实验的二偶氮苄氧甲基(DBM)-滤纸性质的研究

DBM-滤纸与硝基纤维素一样,近年来广泛地用作DNA或RNA分子的载体来进行分子杂交实验。但是在进行小分子DNA的分子和杂交实验中,以及需要用几种不同的分子探针在同一个DNA载体上反复地进行分子杂交时,DBM-滤纸显示了更大的优越性。用小球菌核酸酶水解鸡红血球细胞核,抽提出DNA并用[~(32)P-γ]ATP和T_4多核苷酸激酶制备成5’末端标记的DNA分子。经2%琼脂糖电泳,DNA分子按染色质的核小体结构的一系列不同长度(从单体至五聚体)的片段被分开。胶经过NaOH和NaOAC处理,将DNA分子转移到DBM-滤纸上。此滤纸再经NaOH和H_2O处理,分别测定从单体至五聚体的不同分子量DNA的转移效率。结果指出,电泳胶经过转移前处理,单体和二聚体的损失分别为7%和5%,三聚体至五聚体没有损失。转移后仍留在电泳胶上的DNA为2—3%。经过转移后处理的DBM-滤纸所结合的DNA分子,从单体到五聚体分别为89%,91%,96%,94%和94%。因此,在所分析的分子量范围内,DNA分子基本上定量地被转移。用~(32)P标记的SV40 DNA作为探针,检测DNA碱变性与分子杂交效率的关系。结果指出,分子杂交之前,DBM-滤纸经NaOH的处理是必须的,但DNA被转移到DBM-滤纸之前,对电泳胶的碱处理步骤是可以省略的。     

核酸的酸变性研究——Ⅲ.在酸变性过程中核酸“融点”的观察

(一)我们进行了DNA,大分子RNA及sRNA在加酸变性过程中“融点”及融化曲线改变的比较,当pH下降时三种核酸的融点都逐渐下降,大分子RNA与sRNA的融化曲线类似,而与DNA的不同。(二)经过加酸变性再恢复中性时,大分子RNA及sRNA的“融点”与融化曲线皆恢复较好,DNA则不能完全恢复。(三)根据DNA在加酸变性后再恢复中性时的融化曲线看,可以认为DNA在加酸变性后两链并未完全解开,可能留有“核心”部分。此核心部分“融点”高,估计含有大量的鸟便嘌呤-胞嘧啶链。另外在融化曲线中部有明显的热稳定区存在。(四)由DNA的加酸变性及加热变性后再恢复中性的融化曲线特征比较,两者极为相似,说明此两种变性作用所造成的结果是一致的。(五)由sRNA在加酸变性过程中融点与融化曲线的特征看来,所有变化皆与大分子RNA一致,而不与DNA一致,说明sRNA在溶液中的结构与大分子RNA相似而与DNA不同。     

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白的研究(四)

应用荧光探剂——荧光醋酸汞和荧光胺研究了棕色固氮菌固氮酶的两种蛋白组分与MgATP和MgADP的关系。实验确证该菌钼铁蛋白不能与MgATP和MgADP络合,而铁蛋白则能。每分子铁蛋白络合2个分子MgATP,但至少是络合2个分子MgADP,反应的部位是在铁蛋白的巯基上。MgATP和MgADP与铁蛋白络合后,引起铁蛋白构型变化,使铁蛋白中可与荧光胺反应的氨基量增加。MgATP和MgADP二者与铁蛋白作用后所得结果相近似。在没有MgATP存在条件下,钼铁蛋白仍能与铁蛋白相互作用,并在巯基部位上产生变化。对于氨基也有影响。     

底物对变性酶的修复作用

 兎肌肌酸激酶被LDS变性后,底物能够诱导变性酶使其活力和构象得到部分恢复。变性程度不同的酶,构象和活力的恢复程度也不同:低浓度LDS变性酶,恢复程度较高;反之亦然。活力的恢复与构象的恢复两者呈对应关系。底物修复作用的pH以8.2为好。底物修复作用受其它蛋白质(例如BSA)存在的影响。等速电泳结果表明,BSA能竞争性结合LDS-酶复合物的LDS,使酶成为游离酶。变性酶先与BSA保温再加底物所得的活力恢复,大约是变性酶与含BSA的底物保温所得活力的10倍。这一结果似表明LDS变性酶仍能结合底物;被结合的底物还能使变性酶的构象发生变化。     

生物工程技术讲座(九)

双链的DNA分子是由一条单链上的碱基与另一条单链上碱基相配对组成。分子中的碱基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)间有两处,鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)间有三处通过氢(H)结合配对,形成双链间的对应互补。由H在双链分子间形成的结合虽稳定,但是可逆的即经加热或碱     

DNA双链区的切割导致碱变性超螺旋质粒pBR322的分子内结节

为进一步研究碱变性超螺旋DNA(Ⅳ型DNA;DNA Ⅳ)的结构,对碱变性质粒pBR322进行了酶学分析并利用原子力显微镜(AFM)对新形成的DNA结构进行了观察和比较．在所有已检测的限制酶中只有PstⅠ可以切割质粒pBR322的Ⅳ型DNA分子,说明在这种变性的DNA分子中仍存在少数完整的限制酶识别位点．与碱变性DNA分子的闭合环状结构相反,AFM成像的结果显示PstⅠ处理后的DNA Ⅳ分子均为开放结构,同时这种分子包含明显的DNA结节．与DNA Ⅳ分子相比,这种DNA分子的表观长度缩短了大约11%．有意思的是,大肠杆菌拓扑异构酶Ⅳ(一种Ⅱ型拓扑异构酶)也可以在pBR322 DNA Ⅳ分子中引入分子内结节,而这种结节DNA分子仍然保持闭合状态．AFM的结果表明上述两种结节的DNA分子在表观长度及结节结构的尺寸上均比较相似．这些发现证实,在碱变性的超螺旋DNA分子中仍然保留着一些长度较短的、含有特异性碱基配对的DNA双链区,而在这些区域内的DNA双链断裂可以导致DNA结节．     

锁核酸的特点及其应用

近期 ,锁核酸 (lockednucleicacid ,LNA)作为一种新颖的核苷酸衍生物在药学研究领域引起了人们的广泛关注 ,有希望成为分子水平治疗各种疾病的新突破口 .它是一种特殊的双环状核苷酸衍生物 ,结构中含有一个或多个2′ O ,4′ C 亚甲基 β D 呋喃核糖核酸单体 ,核糖的 2′ O位和 4′ C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥 ,并连接成环形 ,这个环形桥锁定了呋喃糖C3′ 内型的N构型 ,降低了核糖结构的柔韧性 ,增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性 .由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架 ,故其对DNA、…     

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白某些特性的研究(二)

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白能与Mg-ATP结合,而钼铁蛋白则不能。每分子铁蛋白结合2个分子Mg-ATP。结合常数K为13.3～15.6μM。铁蛋白与不同浓度ATP结合时符合S型动力学。铁蛋白引起结合Mg-ATP后构型变化。在未变性的铁蛋白的12个半胱氨酸残基中,只有4个可被羧甲基化,加入Mg-ATP或低浓度对氯汞苯甲酸后,只有2个半胱氨酸残基被羧甲基化。对氯汞苯甲酸抑制铁蛋白活性,先加Mg-ATP再加列氯汞苯甲酸,能保持部分活性。     

国外动态

将蛋白质锁定在活性构型ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＮｅｗｓ 2 0 0 1年 2 1卷 14期报道 :哈佛医学院 (Ｂｏｓｔｏｎ ,ＭＡ)的研究者将一种蛋白锁定在活性构型而增加了对靶标的结合特性。这个发现可能在诊断和开发药物中发挥重要作用。众所周知 ,单个的蛋白分子可以形成不同的形状或构型 ,一般分为活性构型和无结合活性构型。在溶液中的蛋白有一部分蛋白分子以一种构型存在 ,而另一些分子则以另一种构型存在。目前研究者利用二硫键这种不容易断裂的共价键可使蛋白质分子保持结合活性的构型。ＴｉｍｏｔｈｌｙＳｐｒｉｎｇｅｒ和其同事研究整…     

家蚕浓核病毒(山梨株)DNA的电子显微镜研究

最近所分离的家蚕浓核病毒(DNV)山梨株(Y-DNV)与最初在家蚕中发现的DNV伊那株在各种理化性质方面有所不同。从Y-DNV中提取的病毒DNA在琼脂糖凝胶电泳中出现二条带(DNA Ⅰ和Ⅱ)。用限制性内切酶处理这些DNA,其结果也明显不同。为了弄清这些现象,用电子显微镜对这些DNA分子进行研究。通过琼脂糖凝胶电泳分离的DNA Ⅰ和DNA Ⅱ都是双链线状分子,但DNA Ⅰ分子的长度略长。在电子显微镜下,二种DNA的构象没有差异,因此可以肯定DNA Ⅰ和DNAⅡ有不同的碱基序列组成。这在DNV中是罕见的,因为到目前为止所知道的所有DNV都只有4种结构蛋白。基于这种情况,在前一篇论文我们曾推测这些蛋白质可能是来自两种DAV,它们各自具有其中3种或4种结构蛋白。应当指出的是,Y-DNV的衣壳本身是由一种还是由二种结构所组成的还需要进一步的研究给予证实。因为Y-DNV的病毒直径很小,它不可能包含二种DNA(分子量分别为2.1×10~6d,和1.7×10~6d.)所以家蚕Y-DNV很可能是由二种相似但是不相同的DNV所组成的混合物。     

短状杆菌的DNA分子杂交与分类学研究

利用非放射性光敏生物素标记DNA分子与固定在微稀释板上的热变性单链DNA杂交的方法,对短状杆菌(Brachybacterium)15个菌株的染色体DNA进行分子杂交．通过测定荧光强度,确定DNA间的同源值．根据其遗传相关性,对难以从形态特征、生理生化特性等进一步分类的细菌在种的水平上定论,确定其应有的分类位置．光敏生物素标记DNA,在微稀释板上进行分子杂交是一种准确、快速的杂交技术,在短状杆菌的分类学研究中起着决定性的作用．     

羧甲基壳聚糖-Cr(Ⅲ)配合物与鲱鱼精DNA的作用

采用循环伏安法和紫外光谱法研究了羧甲基壳聚糖-Cr(III)配合物与鲱鱼精DNA之间的作用方式。结果发现:(1)羧甲基壳聚糖-Cr(III)的存在导致Fe(CN)3-6/4-探针分子氧化还原峰电流下降,式量电位正移,显示羧甲基壳聚糖-Cr(III)和Fe(CN)3-6/4-与DNA之间存在竞争性作用,说明羧甲基壳聚糖-Cr(III)通过插入方式与DNA相互作用的;(2)中性红的加入导致羧甲基壳聚糖-Cr(III)/DNA体系的特征吸收峰发生增色效应、峰位红移并伴有等吸收点出现,这进一步表明羧甲基壳聚糖-Cr(III)是以插入方式与鲱鱼精DNA发生了相互作用,导致DNA分子的构象变化,并且CMC-Cr与DNA的结合比n(CMC-Cr):n(DNA)为3∶1。     

辽东湾斑海豹(Phoca largha)线粒体D-loop区异质型研究初探

采用PCR技术和DNA克隆测序技术,随机测定了3头斑海豹mtDNA控制区(D-loop区)csn-3上、下游1000bp左右的序列,每头斑海豹任选14个克隆菌斑进行测序,结果所得序列均无重复,得到42个单倍型.结合GenBank已发表的斑海豹mtDNA控制区序列(Phoca largha,AM181031),通过Clusta1X1.83、MEGA3.1和FastPCRv3.6等生物信息学软件进行序列比对,发现我国珍稀保护动物斑海豹个体内线粒体DNA(mtDNA)的控制区CSB-3之后存在异质型现象,且存在数目不等的串联重复序列.从分子水平进行了不同类型重复序列变化规律的研究,初探了mtDNA控制区异质型在斑海豹中的存在情况.     

外源添加巨桉两种挥发性化合物对受体植物萌发、生长及四种生理指标的影响

在前期巨桉挥发性物质鉴定及其林龄效应研究的基础上, 结合预备实验选择含量较高且随林龄变化较为明显的两种挥发性化合物(正癸烷和 2,2,4,6,6-五甲基庚烷), 研究其对受体植物(萝卜 Raphanus sativus、绿豆 Vigna radiata、莴苣 Lactuca sativa)萌发、生长及四种生理指标的影响。结果显示: 1)两种化感物质对三种受体植物种子萌发均具有抑制作用, 且随浓度升高而增强。两物质对三种受体植物根长呈低促高抑现象且随浓度的增加抑制作用逐渐增强。正癸烷对三种受体植物苗高具有低浓度促进高浓度抑制作用; 2,2,4,6,6-五甲基庚烷对萝卜和莴苣苗高具有低促高抑的作用,对绿豆苗高呈现高浓度显著抑制作用。正癸烷对萝卜、绿豆苗/根鲜重比随浓度增加呈现不显著或促进作用, 对莴苣苗/根鲜重比作用不显著; 2,2,4,6,6-五甲基庚烷对萝卜和绿豆的苗/根鲜重比呈现低浓度无显著变化高浓度促进作用, 而对莴苣苗/根鲜重比影响不显著。2)正癸烷和 2,2,4,6,6-五甲基庚烷对莴苣、2,2,4,6,6-五甲基庚烷对萝卜的 SOD活性含量无显著影响, 这两种物质对其它受体植物的 SOD、CAT 活性均具有低浓度促进或影响不显著, 高浓度时显著抑制作用。两物质对三种受体植物 MDA 含量具有低浓度抑制或无显著变化, 高浓度促进作用。两种化感物质对三种受体植物幼苗根系活力(TTC)均呈现低浓度促进或影响不显著高浓度抑制作用。     

重组 E.coli 解旋酶Ⅱ（UvrD）的DNA结合及解螺旋功能分析

E.coli 解旋酶Ⅱ（UvrD）是一种在甲基定向错配修复（methyl-directed mismatch repair, MMR）和核苷酸切除修复（nucleotide excision repair,NER）中起重要作用的3′→5′解旋酶.本研究对大肠杆菌的UvrD进行了重组表达和纯化,并检测其ATP酶比活性（87　U/mg）. 利用表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）方法实时检测了UvrD与同源双链DNA分子（homoduplex DNA）和异源双链DNA分子（heteroduplex DNA）结合的动态过程以及镁离子对此过程的影响.结果显示,UvrD与DNA的平衡解离常数在10 ^－7mol/L 水平. DNA分子中错配碱基的存在,在一定程度上影响了二者的结合,而镁离子不是两者结合的必要因素.本研究还利用原子力显微镜（atomic force microscopy,AFM）方法在单分子水平上观察到UvrD将双链DNA解链形成单链DNA的中间体.此研究得到的UvrD与DNA结合的动力学信息数据以及解螺旋中间体的单分子可视化,为进一步深入研究UvrD在修复过程中的作用机制奠定了基础.     

极大螺旋藻(Spirulina maxima)和微小小球藻(Chlorella minutissima)对UV-B增强的响应

本文研究了极大螺旋藻(Spirulina maxima)和微小小球藻(Chlorella minutissima)分别对紫外线-B(UV-B)的短时间和长时间处理的响应。在不同强度(0～2.0w·m~(-2))UV-B的短时间(6h)作用下,这两种藻的光化效率(F_V/F_M)均明显的降低,且降低的程度与UV-B强度呈正相关,极大螺旋藻较微小小球藻降低更显著;UV-B吸收物质的分泌和超氧化物歧化酶(SOD)活性,都与UV-B的增强无明显关系。经相同强度(0.9或1.8w·m~(-2))的UV-B长时间(1～80d)作用后,F_V/F_M随着作用时间的延长,极大螺旋藻的表现是先降后升,而微小小球藻则表现为逐渐下降;对于UV-B吸收物质的分泌和SOD酶活性,极大螺旋藻都表现为逐渐增强,而微小小球藻却表现为无明显变化。     

分子遗传学术语解释(续)

在离心场中,颗粒速率与离心力之比,用svedbergs表示,例如,密度梯度离心,把不同的DNA分子分开,Xenopus的DNA中有5S DNA(密度轻,位上)。