自然界中难分离培养微生物的分离和应用

采用在分离培养基中添加自然来源的抽提液,或加入一些特殊化合物,使其中处于Viable but non-culturable（VBNC）状态的微生物恢复其生长繁殖能力,从而得到分离。实验结果发现甜菜碱、丙酮酸钠、SOD以及过氧化氢酶可使分离到的微生物种类及菌落总数明显增加。还采用固液结合的方法来分离那些在普通平板培养基上不能形成肉眼可见菌落的那些微小菌落的微生物。采用这几种方法从4份土壤样品中共分离得到52株放线菌,103株细菌,17株真菌。对其中的放线菌和真菌进行了生物活性的测定,得到多株具有抗菌活性的微生物,经过多次复筛的平均阳性率为4.325％,略高于用常规方法分离得到的微生物。因此证明有效的分离方法将为今后微生物药物的筛选和药用微生物菌种的保藏提供更丰富的来源。     

长木蜂蜂粮中微生物丰度及抑菌活性菌株的筛选

长木蜂属于野生蜂类,后代的生存和繁衍完全依靠雌蜂所提供的蜂粮,蜂粮保鲜时间的长短对蜂群的繁衍具有关键性作用。本文采用营养琼脂培养基、改良"LB"培养基、MRS(4.5)、MRS(6.5)培养基分别对芍药的手采花粉、长木蜂蜂花粉和不同酿制时间的蜂粮样品中的微生物进行菌落计数、分析和分离鉴定。酿制初期的蜂粮样品在营养琼脂培养基生长的细菌菌落数占优势,随酿制时间的延长而迅速下降;7d、8d蜂粮样品在改良"LB"培养基上生长的细菌菌落数占优势;10d之后的蜂粮样品在MRS(6.5)培养基上微生物菌落数占优势;分离的68株菌株,其中细菌43株,酵母17株,放线菌8株。从蜂粮中分离的酵母菌和放线菌菌株均来自长木蜂雌蜂的体表。分离的68株菌株中有12株有较强抑菌活性,尤其是放线菌NF-34菌株对真菌和细菌均有抑菌活性。     

老鼠簕(Acanthus illicifolius L.)根际内生菌分离与活性评价

从老鼠簕(Acanthus illicifolius L.)根际土壤和植物根、叶、茎中共分离得到97株微生物,其中包括27株放线菌,44株细菌以及26株真菌,并且土壤中的分离得到的微生物最多。对获得的菌株进行细胞毒活性、抗金黄色葡萄球菌和抗白色念珠菌的测定,结果发现细菌的活性百分比最高,而放线菌和真菌活性百分比相对较小。     

凡口铅锌矿酸性底泥可培养微生物资源的探索分离

通过改良优化多种传统分离培养基,对凡口铅锌尾矿的酸性底泥可培养微生物资源进行分离,并结合多种分子标记基因对分离资源进行系统发育地位分析。结果表明,凡口铅锌尾底泥中分离获得细菌41株,分属于放线菌门(Actinomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)的11目,18科,18属;真菌8株,分属于2门,5目,5科,5属;藻类1株,属于Galdieria属的红藻。改良ISP 2和改良9号培养基的分离效果较好,分离获得的微生物多样性较为良好。研究结果为矿山酸性废水微生物多样性研究提供参考,为酸性废水的修复及生态治理研究提供物质基础。     

喜树种子内生放线菌的分离鉴定及抗菌活性物质初分离

【目的】探究含有抗肿瘤活性喜树碱的喜树(Camptotheca acuminata Decne.)种子中内生放线菌的多样性,以及从内生放线菌中寻找新型活性化合物产生菌。【方法】利用放线菌富集培养基分离喜树种子内生放线菌,并根据菌落形态及16S rRNA基因序列同源性分析进行菌种鉴定;以及利用与病原微生物共培养方法检测分离菌株的抗菌活性。【结果】从上海交通大学校园的喜树种子中共分离到33株内生疑似放线菌,经基于16S rRNA基因序列分析的分子鉴定,确定其中21株属于链霉菌,1株属于拟诺卡氏菌,另有3株由于序列相似性低于95%而无法分类;8株因未能克隆16S rRNA基因序列而未确定分类。这11株疑似内生放线菌是否是新放线菌(种)类群,有待后续深入研究。初步的抗细菌、真菌活性检测发现,分离到的内生放线菌中42.42%以上对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)有很强的抑制菌核形成的作用,54.54%内生菌有较强抑制芽孢杆菌生长的作用。并且挑选其中具有代表性的菌株Streptomyces sp.CXSZ1进行代谢产物的分析,初步发现其代谢产物中含有抗细菌活性成分。【结论】喜树种子内生放线菌的分离、鉴定及生物活性物质分离鉴定的研究工作,一方面可以为揭示喜树等高等植物种子内生菌的起源、演化等提供有价值的信息,同时也为新结构、新活性化合物发掘提供实验材料。     

广西北部湾茅尾海红树林生境放线菌分离培养基的比较

【背景】红树林生境拥有丰富的微生物资源,分离获得更多的纯培养放线菌为新型抗生素的发现提供菌种资源。【目的】使用新型放线菌分离培养基,发掘广西北部湾茅尾海红树林生境放线菌资源,评估新型放线菌分离培养基分离效果。【方法】设计出新型放线菌分离培养基——椰子汁-海藻糖培养基,对广西北部湾茅尾海红树林根际土壤和红树林根皮放线菌进行分离。基于分子生物学鉴定方法,对获得的纯培养放线菌进行多样性分析。【结果】从红树林根际土壤样品中分离获得65株放线菌,分布在5个目10个科15个属,使用YIM171培养基分离到7个属,MA培养基分离到5个属,椰子汁-海藻糖培养基分离到11个属,其中包括4株潜在新种;从红树林根皮样品中分离获得19株放线菌,分布在4个目7个科10个属,使用YIM171和椰子汁-海藻糖培养基分别分离到7个属,包括4株潜在新种;使用椰子汁-海藻糖培养基在红树林生境两类样品中获得3株潜在新种。【结论】广西北部湾茅尾海红树林根际土壤和根皮中放线菌多样性丰富,使用椰子汁-海藻糖培养基分离放线菌效果较佳,可用作放线菌的分离培养基。     

药用植物内生放线菌的分离和生物学特性

[目的]探索药用植物内生环境可培养放线菌的分离、培养方法,总结药用植物内生放线菌的生物学特性,探讨其物种多样性,挖掘新的微生物资源.[方法]采用10种分离培养基对37个新鲜的药用植物样品进行内生放线菌的分离;通过比较,选择适合植物内生放线菌生长的培养条件;根据菌落形态和细胞特征观察结果,选择其中174株菌测定16S rRNA基因序列,分析药用植物内生放线菌的多样性;应用Biolog GENⅢ微孔培养、API 50CH以及API ZYM试剂条测试27株代表菌株的生理生化特性.[结果]分离得到940株植物内生菌,分属于47个属,30个科,其中放线菌600余株,分属于34个属,共发现潜在的新分类单元有7个;本研究中药用植物内生放线菌的培养条件是:PYG培养基、pH7.2、28℃- 32℃;菌株间的生物学特性的差异与菌株系统进化关系呈正相关关系;不同环境植物的内生菌菌株的生物学特性差异较大,相同环境的不同植物内生菌的生物学特性差异较小.[结论]药用植物内生放线菌物种丰富多样;药用植物内生放线菌在唯一碳源利用、发酵碳源产酸及酶学活性等生理生化特性方面没有表现出和宿主植物的直接相关性,而是呈现出和宿主植物的地理分布有一定的相关性.     

海洋动植物共附生微生物的分离和抗菌活性研究*

从海参、海胆、海葵、海兔、石莼、羊栖菜、裙带菜分离得到125种共附生海洋微生物,以6种敏感菌为指示菌,从中获得具有抑菌活性的细菌21株,放线菌8株,真菌2株。21株抑菌海洋细菌中芽孢杆菌属为7株,占33.3%,弧菌属为11种,占52.2%,其余3株为假单孢杆菌属,占14.5%。8株抑菌海洋放线菌中链霉菌属为5株,占62.5%,小单孢菌属为3株,占36.5%。2株抑菌海洋真菌均为青霉属。     

中国树花可培养内生真菌分离、鉴定及系统发育分析

[目的]了解中国树花内生真菌的多样性及其系统发育关系。[方法]通过常规组织分离法,采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)分离培养中国树花内生真菌,对内生真菌的菌落、菌丝和孢子进行观察并结合r DNA-ITS序列的PCR扩增测序,对获得的ITS序列通过Gen Bank数据库搜索同源序列并进行分析确定其分类地位并构建系统发育树。[结果]从中国树花中分离得到可培养内生真菌51株,分属4纲、5目、7科、12属,其中青霉属(Penicillium sp.)和曲霉属(Aspergillus sp.)总相对分离率分别为47%、18%,为中国树花内生真菌优势属。[结论]首次对中国树花进行内生真菌的分离,并确定其分类地位,对分离得到的51株内生真菌进行合并相同菌落形态和显微结构,共获得18株内生真菌,通过系统发育分析发现这18株聚为5大类。     

海洋动植物共附生微生物的分离和抗菌活性研究

从海参、海胆、海葵、海兔、石莼、羊栖菜、裙带菜分离得到125种共附生海洋微生物,以6种敏感菌为指示菌,从中获得具有抑菌活性的细菌21株,放线菌8株,真菌2株。21株抑菌海洋细菌中芽孢杆菌属为7株,占33．3％,弧菌属为11种,占52．2％,其余3株为假单孢杆菌属,占14．5％。8株抑菌海洋放线菌中链霉菌属为5株,占62．5％,小单孢菌属为3株,占36．5％。2株抑菌海洋真菌均为青霉属。     

小蓬竹根际土壤微生物及内生真菌多样性分析

为了解喀斯特典型物种-小蓬竹根际土壤微生物及不同部位内生真菌多样性,采用沿等高线等距离取样法采集小蓬竹根际土壤及健康植株,通过可培养对根际土微生物及内生菌进行分离,利用分子技术对其进行鉴定,根据鉴定结果构建系统发育树,并计算小蓬竹根际土壤微生物和根茎叶内生真菌多样性。结果如下：（1）共从根际土壤、根、茎、叶分离得到139个真菌菌株,隶属于27属,其中根际土壤分离得到34个真菌菌株隶属于12属,根部分离得到的63个内生真菌菌株隶属于17个属,茎部分离得到的14个内生真菌菌株隶属于8个属,叶部分离得到28个内生真菌菌株隶属于9个属;（2）根际土壤共分离得到41株细菌菌株,隶属于7个属26个种,20株放线菌菌株,隶属于1属15种;从Shannon-Wiener多样性指数、均匀度指数、Simpson指数排序来看,真菌主要表现为根 > 根际土壤 > 茎 > 叶,细菌和放线菌多样性均较低。（3）按层次聚类分析可分别将真菌、细菌、放线菌聚为3支。小蓬竹根际土壤、根、茎和叶具有丰富的微生物多样性,不同部位菌群组成存在差异性（P<0.05）,且存在以假单胞菌属、芽孢杆菌属等为优势属的抗盐耐旱菌群,这有助于揭示小蓬竹对喀斯特生境的适应性,以及为微生物-植物群落之间相互关系提供一定基础数据,为后期寻找小蓬竹相关耐性功能菌奠定基础。     

丹参、黄精内生放线菌的分离及遗传多样性分析

从四川遂宁地区采集了丹参、黄精2种道地中药材, 样品通过0.87%次氯酸钠不同时间梯度消毒, 用组织法和匀浆法对植株进行处理, 并在HV、G2、S等培养基中加入不同浓度的重铬酸钾和萘啶酮酸以抑制非放线菌的生长, 确定了分离中药材内生放线菌比较适宜的方法。经分离、纯化得到52株菌落大小、形态、颜色各异的内生放线菌。选取其中12株代表菌株进行16S rRNA PCR-RFLP分析, 在88%的相似水平上, 被分为5个遗传类型, 表明了药用植物内生放线菌的遗传多样性。     

海绵内/共生稀有放线菌Dermacoccus sp. X4次级代谢产物分离纯化及结构解析

从中国南海西沙群岛10 m深海水中采集得到一株未鉴定海绵样品,对其进行共附生微生物的分离,得到真菌及细菌共16株。通过分子生物学鉴定及菌株发酵液抑菌活性测定,发现其中一株稀有放线菌皮生球属菌株Dermacoccus sp.X4对金黄色葡萄球菌具有较好抑菌活性。大量发酵制备该菌株发酵液,通过硅胶分配层析、ODS反相层析、SephadexTMLH-20凝胶过滤层析及C18反相层析等分离方法对发酵液成分进行分离,并使用液相质谱连用、一维核磁及二维核磁分析对分离得到的单一化合物进行鉴定,确定二酮哌嗪类化合物1个,吲哚酸酯类化合物2个。本研究中吲哚酸酯类化合物为首次从微生物次级代谢产物中得到,为丰富海洋微生物药用资源作出贡献。     

中华蜂体内放线菌的分离、多样性及抗菌活性研究

【目的】探索药用昆虫中华蜂(Apis cerana cerana Fabricius)体内可培养放线菌的分离方法,研究其物种多样性及抗菌活性,挖掘更多微生物资源。【方法】选用7种分离培养基对中华蜂样品体内放线菌进行分离;通过采用16S rRNA PCR-RFLP和16S rRNA基因序列分析方法研究其多样性;选用4种致病菌对菌株进行抗菌活性初探。【结果】共分离得到180株放线菌,根据菌落的形态和细胞特征观察结果,从中选取84株作为代表菌株,其分属于3个目、4个科中的4个属,其中6株为潜在新种;最适的表面消毒方法:浓度为0.2%的Cl O2(二氧化氯)作为消毒剂,作用60 s;拮抗实验显示,31.0%、48.8%、27.4%、16.7%的代表菌株分别对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、玉米弯孢病菌、西瓜枯萎病菌有不同程度的抗菌活性,71.4%的代表菌株对至少一种病原菌有拮抗作用。【结论】分离方法的选择对昆虫体内放线菌的分离效果影响较大;中华蜂体内放线菌具有丰富的多样性,展现出很好的抗菌活性,表明其在发现新型生物活性物质中具有很大的潜力。     

塔里木河天然胡杨林中病灶微生物的分离与形态学初探

目的:从塔里木河中下游废弃上百年的河道周围选取2处样点,采集具有不同病症胡杨的茎叶,从中进行菌种分离。方法:显微镜镜检,革兰氏染色及生理生化检测。结果:通过形态观察,得到13株细菌、4株真菌。其中的7株细菌分离于病叶,其余10株分离于病变树皮。对13株细菌革兰氏染色结果表明,2株为革兰氏阴性菌,11株为革兰氏阳性菌。对真菌的孢子形态观察表明,4株均为霉菌。结论:实验首次对胡杨特殊病灶微生物进行分类统计,为解决由微生物感染引起的胡杨林退化问题积累数据。     

西沙群岛海域海洋放线菌的分离及其抗菌活性

分离西沙群岛海域放线菌并研究其抗菌活性。采用干燥、辐射、冷冻及加热处理等11种样品预处理方式和10种培养基对海洋放线菌进行分离,对代表性菌株进行鉴定,并考察分离放线菌生长的海水依赖性。进一步以金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、啤酒酵母和扩展青霉为指示菌考察分离放线菌的抗菌活性。从西沙群岛海域样品中分离获得放线菌383株,其中专性海洋放线菌23株。选定93株代表菌株进行鉴定,93株菌隶属于9个科,11个属。不同培养基对分离放线菌菌株的数量及种类影响显著。6株放线菌对4种指示菌均有抑菌活性,其中4株为专性海洋放线菌,表明海洋环境具有丰富的放线菌资源,这些放线菌特别是专性海洋放线菌有望为新型抗菌物质的发现与开发提供菌种来源。     

不同来源溶藻菌的分离、鉴定及溶藻效果比较

为了探究从何种类型的自然生境中更易分离得到溶藻微生物,采用高氏1号培养基分别从水库底泥、湖泊底泥、农田土壤、林地土壤等四种来源共36份样品中分离了7 600株菌,并最终从中筛选得到了5株溶铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的溶藻菌,其中4株为假单胞菌(Pseudomonas sp.),1株为黄杆菌(Flavobacterium sp.),5株菌溶藻效率的变化范围为62%~95%。结果表明,当采用高氏1号培养基作为分离培养基时,湖泊底泥和水库底泥中的成功筛选概率最高,农田土壤次之,而林地土壤中则难以筛选得到,假单胞菌是较容易筛选得到的溶藻菌。     

新疆特色药食两用植物恰玛古内生放线菌的分离与鉴定

恰玛古（Qamgur, Brassica rapa L.）内生菌的研究主要集中在内生真菌,内生放线菌的研究报道较少。通过研究新疆药食两用植物恰玛古内生放线菌多样性,以期发现产新活性物质的放线菌或新种放线菌,为研究微生物药物奠定基础。从恰玛古根、茎和叶三个部位分离培养获得内生放线菌,对其菌落与个体形态进行观察,并利用序列测定方法进行鉴定,以获取其分类地位。从恰玛古三个部位共分离得到17株内生放线菌,其中12株为革兰氏阳性杆菌,3株为革兰氏阳性球菌,2株为革兰氏阳性丝状菌;17株内生放线菌分属于红球菌属（Rhodococcus）、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）、链霉菌属（Streptomyces）、短杆菌属（Brevibacterium）、小短杆菌属（Brachybacterium）、两面神菌属（Janibacter）和微杆菌属（Microbacterium）。从新疆药食两用植物恰玛古中分离获得17株内生放线菌以稀有放线菌为主。     

陈皮中微生物的分离与鉴定

摘要:【目的】陈皮保存的时间越长即陈皮越老其药用功效越显著。本工作拟从7年陈皮中分离有益微生物,并制成相应的微生物产品,应用于高品质耐储存陈皮的生产。【方法】以7年陈皮为材料,用4 种培养基分离微生物;采用SDS-PAGE全细胞蛋白电泳和IS-PCR指纹图谱对所分离到的微生物进行聚类分析,再选取每个类群的代表菌株进行分子系统发育分析及生理生化鉴定。【结果】从7年陈皮中分离、纯化23株细菌,但没有分离到真菌与放线菌。23株细菌聚为4个类群,其中类群I属于芽孢杆菌属(Bacillus),类群II、类群III、类群IV 属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus)。【结论】4个类群中只有类群II代表菌株cp20具有明显的柠檬酸盐利用能力,在陈皮的试验制作过程中具有防腐耐储存作用。     

不同红树林地区老鼠簕内生放线菌的分离及其环境适应性

【目的】比较不同红树林地区的老鼠簕内生放线菌的地理分布,了解内生放线菌与其所处环境的相关性。【方法】分别从5个不同地点的红树林采集老鼠簕全株植物,采用9种分离培养基,从植株不同部位分离内生放线菌,用16S rRNA基因序列分析鉴定到属,用添加不同NaCl浓度的ISP 2液体培养基进行耐盐度测试,用无氮基础培养基进行固氮活性测试。【结果】共分离得到内生放线菌52株,其中从叶、茎和根部分别获得5株、2株和45株,花和果中未分离到。52株内生放线菌分别属于小单孢菌属(47株),链霉菌属(3株),疣孢菌属(1株)和继生菌属(1株)。48株菌表现出耐盐或嗜盐特征,其中18株最高耐盐度20%,4株不能在无盐条件下生长,12株菌可在含有3.3%NaCl的培养基上生长良好。4株菌可在无氮培养基下生长。【结论】对47株内生小单孢菌的地理分布分析表明,老鼠簕内生小单孢菌的类群因不同地理位置有很大差异。耐盐和固氮活性测试结果表明了老鼠簕内生放线菌对环境的适应性。