酶法生产L-高苯丙氨酸的研究进展

L-高苯丙氨酸(L-homophenylalanine,L-HPA)作为一种重要的非天然氨基酸,是合成治疗高血压的普利类药物等的关键中间体,具有广阔的市场前景。目前L-高苯丙氨酸的合成主要依赖于化学法,但化学合成L-高苯丙氨酸具有原料昂贵、步骤繁琐和污染严重等缺点,限制了广泛应用。因此,国内外研究者对L-高苯丙氨酸的酶法生产进行了深入的研究。本文就目前酶法合成L-高苯丙氨酸的工艺,包括脱氢酶法、转氨酶法、海因酶法和脱羧酶法的研究进展进行了综述,为酶法合成L-高苯丙氨酸提供一定的借鉴,为最终实现L-高苯丙氨酸的酶法工业化生产奠定基础。     

酶法生产L-苯丙氨酸酶转化条件研究

通过单因子和正交试验 ,对酶法生产L 苯丙氨酸的转化条件进行优化 ,在L 苯丙氨酸积累浓度不降低的情况下 ,减少转化时间 ,缩短生产周期 ,得到最适的转化条件 ,提高酶的二次利用率 ,降低成本。     

化学-酶法制备L-高苯丙氨酸

以苯丙酸乙酯为原料,通过正交设计优化2-氧4-苯基丁酸盐的制备条件：苯丙酸乙酯与草酸二乙酯摩尔比为1：3,缩合反应时间为2．5h,H2SO4质量分数为20％,水解反应时间为15h,优化条件下2-氧-4-苯基丁酸盐的产率为68．24％。随后,利用E．coli A5所产的天冬氨酸转氨酶为生物催化剂制备L-高笨丙氨酸。酶转化反应的最适条件为：游离细胞体系pH、温度、底物质量浓度和细胞质量浓度分别为8．5、37℃、20g/L和30g／L;而固定化细胞体系则分别为7．0—9．0、40℃、10g／L和30g/L。采用廉价的L-谷氨酸（L—Glu）作为氨基供体,添加表面活性剂有利于提高L-HPA产率。通过研究固定化细胞转化反应进程,结果发现8h内90％的底物可转化为L—HPA。     

三酶级联催化L-苏氨酸生产L-2-氨基丁酸

L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一种重要的化工原材料和手性医药中间体,为了实现L-ABA的高效生产,本研究在大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)中分别表达大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶(Threonine deaminase,TD)、苏云金芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶(Leucine dehydrogenase,LDH)和博伊丁假丝酵母来源的甲酸脱氢酶(Formatedehydrogenase,FDH),构建体外级联酶催化反应实现L-苏氨酸向L-ABA的转化,体系中TD、LDH和FDH添加最适比例为1∶1∶0.2。为了简化生产工艺,将3种酶在一株菌E. coli 3FT+L中共表达并实现上述配比,在30 L发酵罐中用E. coli 3FT+L全细胞转化12 h,L-ABA的产量为68.5 g/L,底物L-苏氨酸的摩尔转化率达到99.0%。该工艺路线绿色高效,为未来大规模生产L-ABA提供借鉴。     

粘红酵母产L-苯丙氨酸解氨酶的条件和酶法合成苯丙氨酸的研究

研究了粘红酵母(Rhodotorula glutinis)中L-苯丙氨酸解氨酶(PAL)(EC4.3.1.5)的产酶条件及用此酶把反式肉桂酸转化成苯丙氨酸的条件.结果表明,在下列培养基(g/L)及培养条件下PAL的活力较高:酵母膏10.0,蛋白胨10.0,NaCl5.0,KH_2PO_4 0.5,苯内氨酸0.5,(NH_4)_2SO_41.0,葡萄糖5.0,pH6.0—6.5,培养温度为30℃.转化过程中,[NH_4~+]对初速度的影响符合米氏方程,其K_m和V_(max)分别为16.85mol/L和5.96 g·L~(-1)·h~(-1),最适pH为10.0.底物肉桂酸对反应初速度的影响,在低浓度时有激活作用,在高浓度下则有抑制作用.肉桂酸转化为苯丙氨酸的转化率在60.0%以上.     

粘红酵母产L-苯丙氨酸解氨酶发酵培养基的优化

通过单因子和正交试验 ,对粘红酵母产 L -苯丙氨酸解氨酶 ( PAL )培养基进行优化 ,L-苯丙氨酸的积累浓度可以从 2 .0 g/1 0 0 ml提高到 3 .3 g/1 0 0 ml,最终得到了 L-苯丙氨酸解氨酶发酵的最适条件     

利用酵母菌细胞转化肉桂酸生成L-苯丙氨酸

对利用酵母菌转化肉桂酸生成L-苯丙氨酸的方法进行了菌株筛选、菌体细胞培养、转化反应条件以及产物提取等方面的探索。从13个属的71株酵母菌中选到转化生成L-苯丙氨酸较高的粘红酵母(Rhodosorula glusinis)As 2.102菌株。经实验得出该菌株的最佳培养条件为:在含有1.5%酵母膏、1%葡萄糖、1.5%蛋白胨、0.05%L-苯丙氨酸、0.05% KH₂PO₄、0.5%NaCl、pH5.0的培养基中,30℃振荡培养20小时;最佳转化条件     

D-氨基酰化酶拆分D,L-苯丙氨酸制备D-苯丙氨酸

进行了以D,L-苯丙氨酸为原料经D-氨基酰化酶制备D-苯丙氨酸的研究。乙酰-D,L-苯丙氨酸浓度为0.5mol.L-1,给酶量为3×104U.L-1时,24 h拆分率可达到97%。采用阳离子交换树脂进行了拆分液中的D-苯丙氨酸的分离,D-苯丙氨酸的收率为95.4%。采用醋酸酐作为催化剂,在145℃的条件下,乙酰-L-苯丙氨酸可以消旋成乙酰-D,L-苯丙氨酸继续拆分。     

一菌双酶法制备L-4-氟苯丙氨酸

利用重组E．coli产天冬氨酸酶和天冬氨酸转氨酶催化生产L-4-氧苯丙氨酸的工艺。实验结果表明最佳转化条件为-37℃,pH值4．5—8．5,菌体与酮酸的质量浓度比为1.5,CTAB的质量分数为0．04％,酮酸的质量浓度11．28g／L,富马酸铵与酮酸的摩尔比为3．0：1．0,添加1mmol／L的Fe^2＋,L-天冬氨酸与酮酸的摩尔比为0．4：1。在最适条件下,经过14h酶转化反应达到平衡,酮酸转化率可达到95％以上,L-4-氟苯丙氨酸得率也可达到80％以上。此法原料简单易得,为L-4-氟苯丙氨酸的制备提供了一种新方法：     

丝胶蛋白粉末的制备及其应用于L-天冬酰胺酶的固定化

蚕丝蛋白经高压高温水脱胶后所得的丝胶溶液,经过纯化、浓缩以及喷雾干燥,制成丝胶蛋白粉末.这种丝胶蛋白分子质量高达200 ku,其粉末呈白色,平均粒度10 μm,为热水溶性蛋白.以这种丝胶蛋白粉末为载体,用戊二醛为交联剂,制成固定化L-天冬酰胺酶.对这种固定化酶活性和动力学性质进行初步研究和分析,结果表明这种固定化酶性能稳定,对热的稳定性有所提高,并具有较好的操作稳定性,抗胰蛋白酶水解能力大大提高.     

亮氨酸脱氢酶C端Loop区域的理性设计及多酶级联高效合成l-2-氨基丁酸

亮氨酸脱氢酶 (Leucine dehydrogenase,LDH) 是制备l-2-氨基丁酸的关键限速酶,针对该酶的Loop区域进行改造以提高关键酶的酶活及稳定性从而高效合成l-2-氨基丁酸。通过亮氨酸脱氢酶的分子动力学模拟分析均方根涨落 (Root mean square fluctuation,RMSF) 值,对其波动非常明显的Loop区域合理设计以得到比酶活提高的截短突变体EsLDHD2,其比酶活为野生型的123.2%;此外,由于l-2-氨基丁酸制备过程中苏氨酸脱氨酶催化l-苏氨酸制备2-酮丁酸的速率过快导致多酶催化不平衡,因此双拷贝亮氨酸脱氢酶及甲酸脱氢酶以平衡多酶催化速率,构建多酶级联催化的单细胞E. coli BL21/pACYCDuet-RM,其摩尔转化率相较于E. coli BL21/pACYCDuet-RO提高74.6%;对菌株E. coli BL21/pACYCDuet-RM的全细胞转化条件进行优化,其最适pH、温度、底物浓度分别为7.5、35 ℃和80 g/L,此时摩尔转化率大于99%;在1 L转化体系和最适转化条件下分批加入l-苏氨酸80 g和40 g,l-2-氨基丁酸的产量达97.2 g。总之,该策略为l-2-氨基丁酸的制备提供了绿色、高效的合成方法,具有工业化制备药物前体的巨大潜力。     

Different strategies for multi-enzyme cascade reaction for chiral vic-1,2-diol production

Bioprocess and Biosystems Engineering - The stereoselective three-enzyme cascade for the one-pot synthesis of (1S,2S)-1-phenylpropane-1,2-diol ((1S,2S)-1-PPD) from inexpensive starting substrates,...     

多酶级联反应的构建及其在双官能团功能化学品合成中的应用

利用多酶级联催化反应合成精细化学品是近年来生物催化领域的研究热点。通过构建体外多酶级联体系,可以替代传统的化学合成法,实现多种双官能团功能化学品的绿色合成。本文系统介绍了多酶级联催化反应中不同级联方式的特点及其构建策略,总结了级联反应中元件酶常用的筛选方法、NAD(P)H和ATP等辅酶的再生策略及其在多酶级联反应中的应用,并且阐述了多酶级联催化反应体系在6种双官能团功能化学品,包括ω-氨基脂肪酸、烷基内酰胺、α,ω-二元羧酸、α,ω-二胺、α,ω-二醇、ω-氨基醇合成中的应用。     

番茄红素基因工程菌多酶调控研究进展

作为类异戊二烯化合物中四萜的代表性产品番茄红素,在生物体中是典型的多酶参与催化的反应产物,在2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸盐(MEP)和甲羟戊酸(MVA)合成途径中起着至关重要的作用。从番茄红素在原核和真核中的多酶合成途径出发,针对番茄红素合成途径的各种优化策略,首先介绍了多酶合成中的常规调控方法,包括多基因共表达质粒构建、基因顺序调控、启动子与核糖体结合位点调控及基因敲除和替换等方法。之后介绍了一些新型的多酶调控方法,包括多片段组装技术、人工支架自组装方法等。最后重点介绍了这些多酶调控方法在番茄红素合成中的应用。这些多酶合成调控方法为构建高产番茄红素菌株提供了极大的启发和研究基础。     

Leucine zipper-mediated targeting of multi-enzyme cascade reactions to inclusion bodies in Escherichia coli for enhanced production of 1-butanol

Metabolons in nature have evolved to facilitate more efficient catalysis of multistep reactions through the co-localization of functionally related enzymes to cellular organelles or membrane structures. To mimic the natural metabolon architecture, we present a novel artificial metabolon that was created by targeting multi-enzyme cascade reactions onto inclusion body (IB) in Escherichia coli. The utility of this system was examined by co-localizing four heterologous enzymes of the 1-butanol pathway onto an IB that was formed in E. coli through overexpression of the cellulose binding domain (CBD) of Cellulomonas fimi exoglucanase. To target the 1-butanol pathway enzymes to the CBD IB, we utilized a peptide-peptide interaction between leucine zipper (LZ) peptides. We genetically fused the LZ peptide to the N-termini of four heterologous genes involved in the synthetic 1-butanol pathway, whereas an antiparallel LZ peptide was fused to the CBD gene. The in vivo activity of the CBD IB-based metabolon was examined through the determination of 1-butanol synthesis using E. coli transformed with two plasmids containing the LZ-fused CBD and LZ-fused 1-butanol pathway genes, respectively. In vivo synthesis of 1-butanol using the engineered E. coli yielded 1.98 g/L of 1-butanol from glucose, representing a 1.5-fold increase over that obtained from E. coli expressing the LZ-fused 1-butanol pathway genes alone. In an attempt to examine the in vitro 1-butanol productivity, we reconstituted CBD IB-based metabolon using CBD IB and individual enzymes of 1-butanol pathway. The 1-butanol productivity of in vitro reconstituted CBD IB-based metabolon using acetoacetyl-CoA as the starting material was 2.29 mg/L/h, 7.9-fold higher than that obtained from metabolon-free enzymes of 1-butanol pathway. Therefore, this novel CBD-based artificial metabolon may prove useful in metabolic engineering both in vivo and in vitro for the efficient production of desired products.     

Strategies and perspectives of assembling multi-enzyme systems

Multi-enzyme complexes have the potential to achieve high catalytic efficiency for sequence reactions due to their advantages in eliminating product inhibition, facilitating intermediate transfer and in situ regenerating cofactors. Constructing functional multi-enzyme systems to mimic natural multi-enzyme complexes is of great interest for multi-enzymatic biosynthesis and cell-free synthetic biotransformation, but with many challenges. Currently, various assembly strategies have been developed based on the interaction of biomacromolecules such as DNA, peptide and scaffolding protein. On the other hand, chemical-induced assembly is based on the affinity of enzymes with small molecules including inhibitors, cofactors and metal ions has the advantage of simplicity, site-to-site oriented structure control and economy. This review summarizes advances and progresses employing these strategies. Furthermore, challenges and perspectives in designing multi-enzyme systems are highlighted.     

基于双酶级联协调表达策略高效催化合成D-甘露醇北大核心CSCD

D-甘露醇(D-mannitol)作为合成抗肿瘤药和免疫刺激剂的重要前体被广泛应用于制药和医疗等行业,酶法合成D-甘露醇反应成本昂贵无法满足工业化生产。本研究首先筛选关键酶获得较优性能的甘露醇脱氢酶Lp MDH和用于辅因子NADH再生的葡萄糖脱氢酶Ba GDH,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中共表达,实现了基于双酶级联反应催化底物D-果糖合成D-甘露醇,D-甘露醇的初步摩尔转化率为59.7%。针对双酶级联催化反应中辅酶再生用酶与催化用酶表达量不协调的问题,通过增加Bagdh拷贝量来提高辅因子循环能力,获得了双酶催化速率平衡的重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet-Lpmdh-Bagdh-Bagdh。进一步对重组菌的全细胞转化条件进行优化,确定了最适转化条件为反应温度30℃,初始pH值6.5,菌体量OD600=30,底物D-果糖100.0 g/L,辅底物葡萄糖与底物1︰1摩尔当量。于最优转化条件下5 L发酵罐转化24 h,D-甘露醇的最高产量为81.9g/L,摩尔转化率为81.9%。本研究提供了一种绿色、高效生物催化生产D-甘露醇的方法,为实现其规模化生产奠定了基础,同时也对其他相关稀有糖醇的研究具有指导意义。     

多酶级联反应合成能够促进肠道益生菌生长的纤维寡糖

聚合度2–6的可溶性纤维寡糖是一种具有多种生物功能的低聚糖,它能够促进双歧杆菌(Bifidobacteria)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracei)等肠道益生菌的增殖,因此对人体肠道微生态具有调节作用。本研究通过在大肠杆菌中表达纤维寡糖磷酸化酶(cellodextrin phosphorylase,CDP),构建Cc 01菌株,并与之前构建的COS 01菌株联合使用,建立了基于COS 01、Cc 01的三酶级联反应催化底物葡萄糖和蔗糖合成纤维寡糖反应体系。经过优化后,最终可溶性纤维寡糖的产量达到97g/L,纯度约为97%,其中含有纤维二糖(16.8wt%)、纤维三糖(49.8wt%)、纤维四糖(16.4 wt%)、纤维五糖(11.5 wt%)和纤维六糖(5.5 wt%)。在纤维寡糖对益生菌株生长促进作用的测试中,以菊粉、低聚木糖、低聚果糖为基准,干酪乳杆菌(WSH004)、副干酪乳杆菌(WSH005)以及嗜酸乳杆菌(WSH 006)利用纤维寡糖(聚合度2–6)为碳源进行生长后,益生菌的生物量(OD600)相比对照增加约2倍。该研究证明了三酶级联反应能够高效合成纤维寡糖,并表明聚合度2–6的纤维寡糖是一类具有促进肠道微生物增殖的功能性碳水化合物。     

Biocatalytic conversion of cycloalkanes to lactones using an in‐vivo cascade in Pseudomonas taiwanensis VLB120

Chemical synthesis of lactones from cycloalkanes is a multi‐step process challenged by limitations in reaction efficiency (conversion and yield), atom economy (by‐products) and environmental performance. A heterologous pathway comprising novel enzymes with compatible kinetics was designed in Pseudomonas taiwanensis VLB120 enabling in‐vivo cascade for synthesizing lactones from cycloalkanes. The respective pathway included cytochrome P450 monooxygenase (CHX), cyclohexanol dehydrogenase (CDH), and cyclohexanone monooxygenase (CHXON) from Acidovorax sp. CHX100. Resting (non‐growing) cells of the recombinant host P. taiwanensis VLB120 converted cyclohexane, cyclohexanol, and cyclohexanone to ?‐caprolactone at 22, 80–100, and 170 U g_CDW^?1, respectively. Cyclohexane (5 mM) was completely converted with a selectivity of 65% for ?‐caprolactone formation in 2 hr without accumulation of intermediate products. Promiscuity of the whole‐cell biocatalyst gave access to analogous lactones from cyclooctane and cyclodecane. A total product concentration of 2.3 g L^?1 and a total turnover number of 36,720 was achieved over 5 hr with a biocatalyst concentration of 6.8 g_CDW L^?1.