钝齿棒杆菌FarR对精氨酸生物合成基因簇转录水平的影响及其与ArgR的关系

【目的】FarR蛋白可参与棒杆菌精氨酸生物合成途径中相关基因的调控,但具体机制不清楚。本研究通过比较钝齿棒杆菌farR、argR单敲除株和farR与argR双敲除株Arg生物合成途径中相关基因转录水平的变化来揭示FarR蛋白功能及其与ArgR的内在关联性。【方法】采用无痕敲除方法构建了钝齿棒杆菌farR单敲除株和farR与argR双敲除株;采用荧光定量PCR方法分析了farR、argR敲除及其组合敲除后精氨酸生物合成途径相关基因在转录水平的变化。【结果】在ArgR蛋白缺失的情况下,FarR可能发挥正调控功能;在ArgR存在时,敲除farR,目标基因的转录水平改变存在不一致性,表现出上调、下调或无影响。【结论】钝齿棒杆菌中FarR和ArgR在精氨酸生物合成途径的调控中存在关联性。     

钝齿棒杆菌argR基因克隆、表达及其重组菌发酵产精氨酸研究

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS.M7是筛选获得的一株高产精氨酸生产菌株。ArgR是精氨酸合成过程中的一种调控蛋白。为进一步验证其在钝齿棒杆菌中对精氨酸合成量的影响,利用特异性引物,分别扩增标准菌C. creantum AS 1.542和诱变菌C. creantum AS.M7的argR全长基因,测序后比较二者的差异;结果表明标准菌argR基因ORF全长516 bp,编码一个含172个氨基酸残基的蛋白;而诱变菌argR基因的109位碱基由C替换为T,导致ArgR蛋白在钝齿诱变菌中表达被提前终止。同时,将来源于标准菌的argR基因连接到穿梭表达载体pXMJ19中,电击转化至诱变菌C. crenatum AS.M7 得到重组菌株,用摇瓶发酵的方法观测重组菌产精氨酸量的变化。SDS-PAGE和Western blot分析证明标准菌的argR基因在诱变菌中得到了表达。对重组诱变菌产精氨酸量进行了测定,结果显示:产精氨酸能力由原来7.8 mg/ml下降至2.5 mg/ml,下降了约67.9%。     

比较pta及ack敲除对钝齿棒杆菌产L-精氨酸生理代谢的影响

旁支代谢途径的截断有利于目的氨基酸合成途径的集流。基于基因组尺度代谢网络模型的预测,以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)MT-M4为出发菌株,通过无痕敲除技术分别敲除了编码磷酸乙酰基转移酶的pta基因及编码乙酸激酶的ack基因,阻断了乙酸的合成。摇瓶发酵结果表明,pta缺失菌株精氨酸产量较出发菌株提高了25.60%,达15.46g/L。葡萄糖转化率提高了29.41%;ack缺失菌株精氨酸产量达13.82g/L,较出发菌株提高了12.81%,葡萄糖转化率提高了26.02%。同时,pta及ack敲除菌株的细胞生长较出发菌株均分别提高了9.19%及7.71%。因此,pta、ack的敲除不仅有利于精氨酸的合成,而且对菌体生长具有促进作用;但pta的敲除更有利于精氨酸的积累。     

proC及putP基因的敲除对钝齿棒杆菌产L-精氨酸生理代谢的影响

为了选育精氨酸高产菌株,基于谷氨酸棒杆菌的基因组尺度代谢网络模型的指导,以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)MT-M4为出发菌株,通过基因敲除技术构建了pro C和put P敲除菌株。摇瓶发酵结果表明,pro C敲除菌株精氨酸产量达到9.94g/L,较出发菌株提高了15.90%,葡萄糖转化率提高了26.02%。由于其生长受到明显抑制,因此在发酵液中外源添加24mmol/L的脯氨酸,结果发现其精氨酸产量达到12.22g/L,且菌株恢复生长。put P敲除菌株精氨酸产量达到12.23g/L,较出发菌株提高了42.70%,葡萄糖转化率提高了49.31%。以上结果显示,put P的敲除比pro C的敲除更有利于精氨酸的合成,put P的敲除对菌株的生理代谢基本无影响且无需外添加脯氨酸。     

γ-谷氨酰激酶基因敲除对产L-精氨酸钝齿棒杆菌8-193 生理代谢的影响

摘要:【目的】为了阻断L-精氨酸合成的前体物L-谷氨酸的分支代谢途径,增加L-精氨酸合成的代谢流,构建钝齿棒杆菌8-193(Corynebacterium crenatum 8-193)γ-谷氨酰激酶( EC:2.7.2.11,γ-glutamyl kinase) 基因proB 敲除的菌株,并研究proB 基因敲除对菌株生理特性的影响。【方法】运用PCR 技术分别扩增proB 基因的上游和下游序列,构建带有内部缺失的proB 基因的敲除载体。经过两次同源重组,敲除C．crenatum 8-193 的pro     

钝齿棒杆菌丙酮酸激酶的克隆表达及其对精氨酸合成的扰动影响

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA 5-5是诱变选育的一株高产精氨酸菌株。丙酮酸激酶(pyruvate kinase)是EMP途径的限速酶,对胞内能量产生和代谢流调节方面都有重要作用。为提高葡萄糖消耗速率以缩短发酵周期,以钝齿棒杆菌基因组为模板,克隆得到pyk基因并将其在C.crenatum SYPA 5-5中成功表达,葡萄糖平均消耗速率为1.71 g/L/h较C.crenatum SYPA 5-5提高33.5%,精氨酸产量和最大产率分别为43.32 g/L和0.55 g/L/h较C.crenatum SYPA 5-5分别提高20%和19.5%。结果表明,加强表达丙酮酸激酶能增强EMP途径,提高精氨酸产量。     

钝齿棒杆菌精氨酸琥珀酸酶编码基因argH的克隆表达及其重组菌发酵产精氨酸研究

钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）SYPA是本实验室筛选获得的一株高产精氨酸生产菌株。精氨酸琥珀酸酶（AL）是精氨酸合成过程中的最后一个酶,催化底物精氨酸琥珀酸生成产物精氨酸。为进一步提高精氨酸产量,本文以钝齿棒杆菌基因组为模板,扩增得到其编码基因argH,全长为1434 bp,编码476个氨基酸,理论蛋白分子量大小为50.8 kDa,其与C. glutamicum ATCC 13032比对其同源性为99.4%,相差10 bp,3个氨基酸。将其在E.coli BL21(DE3)及C. crenatum SYPA中成功表达。利用载体pET-28a上的6×His?Tag选用Ni柱亲和层析纯化AL,纯化后获得的重组蛋白的比酶活达156.9mU/mg蛋白,总回收率为72.3%,对该酶的部分酶学性质进行了初步研究,并发现产物精氨酸对其具有反馈抑制作用。成功构建钝齿棒杆菌重组穿梭表达质粒pJC1-tac-argH并将其通过电击转化法转入C.crenatum SYPA中,加强其代谢途径中AL蛋白表达量,并对其发酵产精氨酸做了初步分析。结果表明与出发菌株相比,转化子在精氨酸琥珀酸酶酶活增强了66.8%的基础上精氨酸产量达40.9 g/L,比出发菌株产量的35.8 g/L提高了约14.2%。     

过量表达钝齿棒杆菌柠檬酸合酶编码基因prpC2对L-精氨酸合成的影响

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5是诱变选育的一株高产精氨酸菌株。柠檬酸合酶作为TCA途径的关键酶,对细胞胞内氨基酸代谢流调节有重要作用。在钝齿棒杆菌SYPA5-5中过量表达同源的柠檬酸合酶(citrate synthase)基因prp C2,研究其对精氨酸及副产物合成的影响。重组菌C.crenatum SYPA5-5/p DXW-10-prp C2胞内柠檬酸合酶比酶活提高了5.37倍,使L-精氨酸产量在5L发酵罐中达到44.7g/L,与对照相比提高了23.1%。同时,有机酸测定分析TCA循环的精氨酸前体柠檬酸及异柠檬酸的量有所提高,且赖氨酸合成前体草酰乙酸量减少,氨基酸测定分析L-精氨酸发酵中最主要的副产物L-赖氨酸浓度由原来的5.96g/L降到1.21g/L,降低了80%。     

黄素还原酶Frd181和Frd188对钝齿棒杆菌产精氨酸的影响

[目的]钝齿棒杆菌中有两个黄素还原酶,一个是由frd1编码的F181,另一个是由frd2编码的F188。该文分别对这两个基因进行了敲除,比较二者分别对精氨酸产量的影响。[方法]基因敲除采用的是无痕敲除技术。[结果]敲除frd1的菌株其最终的L-Arg产量达到21. 36 g/L,较出发株提高了10. 6%;葡萄糖消耗速率比出发株慢,但菌体生长量提高显著,提高了约33. 3%。敲除frd2摇瓶发酵产L-Arg的量较出发株提高了3. 15%;菌体生长量介于出发株及敲除frd1的菌株之间;葡萄糖消耗与敲除frd1的菌株相当;敲除frd1的菌株积累NADH最多,产生H₂O₂最低。[结论]敲除frd1比敲除frd2对提高精氨酸的产量效果显著。     

谷氨酸棒杆菌1dh基因的敲除

谷氨酸棒杆菌中ldh基因编码乳酸脱氢酶,可催化丙酮酸转化生成乳酸.利用重叠延伸PCR的方法,获得中间缺失部分序列的dldh基因片段,将其与载体pk 18mobsacB连接,转化大肠杆菌感受态,筛选出阳性转化子后,转化谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞.分别在卡那霉素抗性平板及10％蔗糖平板上进行两次筛选,利用PCR方法鉴定,成功获得ldh基因缺失的谷氨酸棒杆菌突变株ATCC 13032-(4)ldh.应用荧光定量PCR检测,ATCC 13032-(z)ldh中的ldh基因在转录水平与野生型菌株ATCC 13032相比,相对表达量为O.ldh基因的敲除对菌株的生长造成了一定的影响.     

钝齿棒杆菌GlnK在氮代谢调控及L-精氨酸合成中的功能

【目的】钝齿棒杆菌是重要的氨基酸生产菌株,本研究针对氮代谢PⅡ信号转导蛋白GlnK展开相关功能研究,分析其在钝齿棒杆菌氮代谢调控及L-精氨酸合成中的作用。【方法】以GlnK蛋白为研究对象,通过基因敲除等遗传方法获得过表达、敲除及敲弱glnK的重组钝齿棒杆菌,研究GlnK对NH_4~+吸收的影响,通过RT-qPCR和酶活测定,从转录水平和蛋白水平上揭示GlnK对氮代谢和L-精氨酸合成相关基因表达水平及酶活的影响,通过5-L发酵罐发酵产L-精氨酸研究GlnK对L-精氨酸合成的影响。【结果】过表达glnK能明显促进NH_4~+的吸收,而敲除glnK后则会抑制NH_4~+的摄取;RT-qPCR和酶活测定发现,相比于野生型菌株Cc5-5,glnK过表达菌株Cc-glnK中与铵吸收相关的基因,表达量平均上调约4.58倍,L-精氨酸合成基因簇中基因的表达水平平均上调1.50倍。Cc-glnK中氮代谢相关蛋白的酶活平均提高46.97%;L-精氨酸合成途径上7个关键酶的酶活平均提高30.00%;5-L发酵罐发酵各重组菌株结果表明,Cc-glnK菌株的产量可达49.53 g/L,产率为0.516 g/(L·h),相比于出发菌株Cc5-5,其L-精氨酸产量提高了28.65%。【结论】过表达GlnK能促进NH_4~+的吸收及利用,并通过影响L-精氨酸合成途径上关键基因的表达水平,提高关键酶的酶活,最终提高L-精氨酸的产量。本研究为后续探索钝齿棒杆菌氮代谢调控机制及代谢工程改造钝齿棒杆菌生产L-精氨酸提供了一种新的策略。     

钝齿棒杆菌N-乙酰鸟氨酸转氨酶的克隆表达分析及其重组菌的精氨酸发酵

N-乙酰鸟氨酸转氨酶 (EC 2.6.1.11,ACOAT) 是钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum精氨酸合成途径中的第4个酶,催化底物N-乙酰谷氨酸半醛生成产物N-乙酰鸟氨酸。为研究N-乙酰鸟氨酸转氨酶在钝齿棒杆菌中精氨酸合成中的作用,考察其酶学性质,对培养基成分和发酵过程工艺条件的优化提高精氨酸产量提供依据。从精氨酸高产菌株钝齿棒杆菌SYPA 5-5染色体扩增获得ACOAT编码基因argD,全长1 176 bp,编码390个氨基酸,在Escherichia coli BL21(D     

抗反馈抑制的天冬氨酸激酶基因在钝齿棒杆菌中的表达

将来自钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）CD945具有AEC抗性的天冬氨酸激酶(AKfbr)基因克隆到穿梭载体pJC1上,构建重组质粒pLY153。用电击法将质粒pLY153转化到野生型菌株C. crenatum AS1.542及其突变株C. crenatum CD945中。携带AKfbr基因的C. crenatum AS1.542菌株能抗浓度皆为12mg/mL的AEC和苏氨酸。AKfbr基因在C. crenatum CD945中得到表达,天冬氨酸激酶活性提高4倍。摇瓶发酵实验结果表明,重组菌在对数前期和中期生长正常,不受抑制;与对照菌相比,赖氨酸终产量提高22％,赖氨酸生产率提高23％。     

钝齿棒杆菌溶氧诱导型启动子的筛选及其功能验证

[目的]筛选钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5内源溶氧诱导型启动子,验证其在不同溶氧条件下受溶氧调控的功能.[方法]以本课题组前期利用双向电泳结合质谱鉴定技术分离鉴定出的高低供氧条件下钝齿棒杆菌SYPA5-5胞内的显著差异蛋白(27个)为基础,结合棒杆菌基因组信息分析高低溶氧状态下显著差异蛋白中单位拷贝的表达量,以其中单位拷贝表达量高的蛋白为目的蛋白,克隆目的蛋白编码基因的上游启动子,分别替换棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒pDXW-8的外源tac启动子,在大肠杆菌和钝齿棒杆菌中表达报告基因gfp和cat,并检测其表达效率.[结果]筛选出高溶氧上调蛋白转酮醇酶和延胡索酸水化酶作为目的蛋白,克隆其启动子区命名为P-tkt和P-fum.在重组大肠杆菌和重组钝齿棒杆菌中,P-tkt在高溶氧条件下CAT活性是低溶氧条件下CAT活性的2.8和3.2倍.该结果在5L发酵罐中得到验证.[结论]启动子P-tkt为首次筛选到的钝齿棒杆菌内源性高溶氧诱导型启动子,适用于高溶氧条件发酵生产氨基酸的菌株中,有利于在高供氧条件下提高棒杆菌中氨基酸的合成代谢能力.     

氮源对钝齿棒杆菌谷氨酰胺合成酶的调节作用及溶菌酶对破壁作用…

钝齿棒杆菌６２８２谷氨酰胺合成酶的合成显著受氮源性质的影响,以５０ｍｍｏｌ／Ｌ谷氨酸钠为唯一氮源时,谷氨酰胺合成酶活力最高;ＮＨ４＾＋对谷氨酰合成酶的合成有阻遏作用,谷氨酸钠则具有解阻遏作用,蛋清溶菌酶对于菌株６２８２的细胞超声波破碎具有良好的辅助作用,适宜的细胞破碎条件为０．８ｍｇ／ｍｌ溶菌酶,３７℃保温４￣５ｈ,超声波１２０Ｗ处理１２ｍｉｎ。     

重组钝齿棒杆菌全细胞转化生产L-瓜氨酸条件优化

实现了精氨酸脱亚胺酶(ADI)首次在钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SYPA 5-5中的高效表达。通过Ni-NTA亲和层析纯化得到纯化ADI,经SDS-PAGE测定其分子量约为46.8 k Da,酶学性质研究发现ADI的最适催化温度为37℃,最适pH为6.5,ADI在最佳催化条件下作用于L-精氨酸的米氏常数为12.18 mmol/L,最大反应速率为0.36μmol/(min·mL)。优化了重组菌全细胞转化产L-瓜氨酸的工艺条件,在最优条件下可一次转化300 g/L L-精氨酸,转化速率达8 g/(L·h)。进行重组菌5 L罐发酵并进行罐上全细胞转化300 g/L L-精氨酸,一批菌体可进行多次转化,累计产量达1 900 g以上。     

限制修饰系统cglI赋予钝齿棒杆菌抗噬菌体功能活性

为解决氨基酸发酵工业中的噬菌体污染问题, 对cglI基因复合体在钝齿棒杆菌中的功能活性表达进行研究。通过PCR从谷氨酸棒杆菌基因组扩增cglI基因复合体, 构建重组质粒pJL23-cglI, 转化钝齿棒杆菌T6-13后得到重组菌株。定性和定量检测重组菌株的噬菌体抗性。实验结果表明, 携带cglI基因复合体的重组钝齿棒杆菌显示了明显的抗噬菌体功能活性和较广的抗噬菌体谱, 进而证实了cglI基因复合体用于构建钝齿棒杆菌抗噬菌体菌株的可行性, 为解决氨基酸发酵生产中的噬菌体污染问题提供了一种有效方法。     

限制修饰系统cglI赋予钝齿棒杆菌抗噬菌体功能活性

为解决氨基酸发酵工业中的噬菌体污染问题, 对cglI基因复合体在钝齿棒杆菌中的功能活性表达进行研究。通过PCR从谷氨酸棒杆菌基因组扩增cglI基因复合体, 构建重组质粒pJL23-cglI, 转化钝齿棒杆菌T6-13后得到重组菌株。定性和定量检测重组菌株的噬菌体抗性。实验结果表明, 携带cglI基因复合体的重组钝齿棒杆菌显示了明显的抗噬菌体功能活性和较广的抗噬菌体谱, 进而证实了cglI基因复合体用于构建钝齿棒杆菌抗噬菌体菌株的可行性, 为解决氨基酸发酵生产中的噬菌体污染问题提供了一种有效方法。     

氮源对钝齿棒杆菌谷氨酰胺合成酶的调节作用及溶菌酶对破壁作用的研究

钝齿棒杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｒｅｎａｔｕｍ）６２８２谷氨酰胺合成酶（ＧＳ）的合成显著受氮源性质的影响,以５０ｍｍｏｌ／Ｌ谷氨酸钠为唯一氮源时,谷氨酰胺合成酶活力最高;ＮＨ对谷氨酰胺合成酶的合成有阻遏作用,谷氨酸钠则具有解阻遏作用。蛋清溶菌酶对于菌株６２８２的细胞超声波破碎具有良好的辅助作用;适宜的细胞破碎条件为０．８ｍｇ／ｍｌ溶菌酶,３７℃保温４～５ｈ,超声波１２０Ｗ处理１２ｍｉｎ。     

抗噬菌体重组钝齿棒杆菌的生理稳定性

为了探索抗噬菌体重组钝齿棒杆菌的应用可行性,对重组质粒pJL23-cglⅠ在钝齿棒杆菌中的稳定性以及其对宿主细胞生长代谢的影响进行了研究。实验结果表明,重组质粒在钝齿棒杆菌中具有较好的稳定性,它在钝齿棒杆菌中的存在对重组菌株的早期生长有些影响,但未影响重组菌株的谷氨酸产生量。