黑曲霉α-鼠李糖苷酶高产菌株的选育

本文首次报道利用Davis方法制备的透明圈法筛选α-鼠李糖苷酶高产菌株.用甲基磺酸乙酯对出芽8 h的黑曲霉孢子进行诱变处理,用透明圈法初筛出的菌株中,产量提高40%以上的突变菌株占11%;用摇瓶培养对初筛出的菌株进行两轮复筛α-鼠李糖苷酶高产突变株T-226,摇瓶培养α-鼠李糖苷酶活达373.4 U/mL,比出发菌株提高了22.7%.对该高产突变株进行5 L罐发酵实验,发酵84 h测得α-鼠李糖苷酶活为631.9 U/mL.用新建立的方法选育高产α-鼠李糖苷酶的高产菌株,不仅具有较高的筛选效率,还具有良好的准确性.     

微生物来源α-L-鼠李糖苷酶的分子和结构生物学研究进展

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase(EC 3.2.1.40))是一种水解酶,分布在GH13、GH28、GH78和GH106家族,其中3种GH78家族的α-L-鼠李糖苷酶具有典型的(α/α)6桶状结构,它能够特异性地水解许多糖苷类物质末端的α-L-鼠李糖基,在食品饮料加工工业和医药业中具有重要的应用价值。介绍了微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶的性质及应用,主要阐述了α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表达及该酶晶体结构方面的研究进展。     

黑曲霉a-鼠李糖苷酶高产菌株的选育

本文首次报道利用Davis方法制备的透明圈法筛选α-鼠李糖苷酶高产菌株。用甲基磺酸乙酯对出芽8 h的黑曲霉孢子进行诱变处理, 用透明圈法初筛出的菌株中, 产量提高40%以上的突变菌株占11%; 用摇瓶培养对初筛出的菌株进行两轮复筛α-鼠李糖苷酶高产突变株T-226, 摇瓶培养α-鼠李糖苷酶活达373.4 U/mL, 比出发菌株提高了22.7%。对该高产突变株进行5 L罐发酵实验, 发酵84 h测得α-鼠李糖苷酶活为631.9 U/mL。用新建立的方法选育高产α-鼠李糖苷酶的高产菌株, 不仅具有较高的筛选效率, 还具有良好的准确性。     

α-L-鼠李糖苷酶特性简述及影响酶活的因素

α-L-鼠李糖苷酶是一个非常重要的工业酶,广泛分布于各种生物中。不同来源的α-L-鼠李糖苷酶具有多样性。细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶的最适pH接近中性或偏碱性,而真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶的最适pH在酸性范围。除此之外,不同来源的α-L-鼠李糖苷酶在最适温度、热稳定性和底物特异性等方面也不尽相同,酶学性质的差异,决定了其在工业应用时所具有的优势和限制。因此,分析不同来源的α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质、阐明其在催化机制和底物特异性等方面的异同点、探究底物的糖苷配体和金属阳离子对酶活性的影响以及L-鼠李糖和葡萄糖对酶的竞争性抑制作用,可以为工业生产中准确选择α-L-鼠李糖苷酶提供参考,进一步推动该酶的工业化应用进程。     

基于宏基因组学方法挖掘新型α-L-鼠李糖苷酶资源北大核心CSCD

α-L-鼠李糖苷酶是特异性切割末端含α-L-鼠李糖的天然化合物的一类糖苷水解酶,该酶在食品、医药、化学等行业都有广泛的应用。本研究旨在利用保守氨基酸基序结合PCR驱动的宏基因组学方法,从提取的健康人体粪便宏基因组DNA中获得新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因。通过对CAZy数据库GH78家族中193条细菌源α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列进行多重序列比对,首次将α-L-鼠李糖苷酶家族分为3个亚家族,并确定了其中两个亚家族的两对保守氨基酸基序。基于保守基序氨基酸序列设计简并引物,PCR扩增保守基序间基因片段,对PCR产物克隆测序,结果获得12条α-L-鼠李糖苷酶基因片段,对其编码的氨基酸序列在Gen Bank数据库进行Blast序列比对,其中两条基因片段的氨基酸序列一致性仅为52%,一条为73%,其余9条在94%以上。根据Gen Bank数据库中序列一致性94%以上片段对应全长基因序列设计上下游引物,以人体粪便宏基因组DNA为模板,扩增获得3条α-L-鼠李糖苷酶全长基因,并将其克隆于载体p ET-28a,在E.coli BL21(DE3)内进行异源表达,目的蛋白多以包涵体形式存在于沉淀中,少量以可溶性形式存在于上清中。人体肠道细菌宏基因组为新型α-L-鼠李糖苷酶基因发现提供了潜在的基因资源库,基于保守氨基酸基序驱动的宏基因组学方法,从人体肠道以及环境宏基因组中直接获取新酶基因是可行的。     

鸟肠球菌(Enterococcus avium)中α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆表达及酶学性质

【背景】前期工作中筛选出一株产α-L-鼠李糖苷酶的细菌,经分子生物学方法鉴定为鸟肠球菌(Enterococcus avium)。α-L-鼠李糖苷酶能够从天然类黄酮化合物中特异性切割末端鼠李糖,在食品生产、医药加工和化工等方面具有极大的开发前景和应用价值。【目的】克隆、表达鸟肠球菌中α-L-鼠李糖苷酶基因,进一步对重组蛋白的酶学性质进行研究。【方法】以鸟肠球菌(Enterococcus avium)strain 352基因组中推定的α-L-鼠李糖苷酶基因序列为基础,设计特异性引物扩增其编码区序列。以p ET-28a(+)为载体构建重组表达质粒,将重组蛋白在Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达。使用镍亲和层析纯化重组蛋白,以p NPR为底物测定重组蛋白的酶学性质。【结果】重组蛋白Ea Rha1分子量大小约为130 k Da。以p NPR为底物,Ea Rha1最适p H是7.0,最适温度为50℃,在p H 5.0-8.0稳定性较好,在40℃以下能保持较高酶活。金属离子对Ea Rha1有不同程度的促进或抑制作用。甲醇对Ea Rha1有抑制作用,并且抑制作用随着甲醇浓度的增大而增强。酶动力学常数K_max和V_max分别为0.35 mmol/L和4.2μmol/(mg·min)(R²=0.999)。Ea Rha1能催化水解新橙皮苷、柚皮苷和芦丁。【结论】通过对重组蛋白Ea Rha1酶学性质的研究,确定了该蛋白对黄酮类化合物的水解特性,为黄酮类化合物的生物转化奠定了理论基础。     

人粪便宏基因组α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质及其对芦丁的生物转化

HFM-rha78是本实验室从健康人体粪便宏基因组DNA中获得的新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因。该基因全长2 166 bp，编码蛋白质分子质量为83 kD，等电点5.58，其二级结构以α螺旋和无规卷曲为主，整体表现出亲水性，其氨基酸序列与GenBank收录的序列一致性仅为48%。系统进化树表明，该酶被分类至亚家族Ⅱ，其催化广义酸和广义碱均为谷氨酸，催化残基高度保守。为明确其酶学性质，以对硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷（p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside，pNPR）为底物，通过紫外 可见分光光度法测定产物对硝基苯酚的生成量，得到HFM-Rha78的最适反应温度为50℃，最适pH为6.5，且在30～46℃下保温30 min，不影响活力。为初步研究其对芦丁的水解能力，首先对HFM-Rha78的有机溶剂耐受性进行了研究。结果表明，该酶能普遍耐受1%的有机溶剂，甚至1%～ 5%的异丙醇和1%的β 巯基乙醇，有提高其活性的能力。当DMSO浓度为10%时，仍能保持79%的酶活性。HFM Rha78对底物pNPR的Vmax为129.9 μmol min-1 mg-1，HFM-Rha78的KM较大，为26.0 mmol L-1。转换数kcat为185.1 s-1，催化效率kcat/KM为7.1×103 s-1 mol-1 L。采用高效液相色谱仪检测HFM-Rha78水解芦丁的能力。结果表明，37℃条件下，随着酶浓度和水解时间增加，芦丁转化率增大。反应10 h时，芦丁转化率达41.8%。本研究获得了HFM-Rha78的最适反应条件，并确定其可特异性生物转化芦丁为异槲皮素。     

黑曲霉DB056产柚苷酶发酵条件初步优化

以α-鼠李糖苷酶活力和柚苷酶活力为考察指标, 研究了发酵条件对黑曲霉DB056产柚苷酶的影响。结果表明: 发酵温度、菌丝形态、培养基初始pH、接种量和装液量对黑曲霉DB056产柚苷酶都具有重要影响。初步优化得到黑曲霉DB056产柚苷酶的条件为: 培养基初始pH 8.0, 玻璃珠添加个数5个, 装液量45 mL, 接种量7%, 发酵温度34°C, 摇床转速190 r/min。采用此条件进行发酵, 高效液相色谱法检测α-鼠李糖苷酶活力最大可达1076.32 U/mL, 柚苷酶活力最大可达420.68 U/mL, 分别比初始条件提高了72.35%和78.03%。黑曲霉DB056不仅在对数生长期能快速合成柚苷酶, 在稳定期及衰亡期也会不断地分泌柚苷酶。阐明了发酵条件对黑曲霉DB056产柚苷酶的影响并获得了经过初步优化的发酵条件, 为进一步优化发酵条件, 提高黑曲霉DB056产柚苷酶的产量奠定了良好的基础。     

酶法提取铁皮石斛多糖工艺优化及对挥发性成分的影响研究

铁皮石斛具有重要的药用价值,但其资源有限,因此对其充分开发和利用具有重要的意义。本文利用α-L-鼠李糖苷酶辅助提取铁皮石斛多糖,通过对酶解温度、酶解时间及加酶量三个因素进行优化,提高铁皮石斛多糖提取率;结果显示,在酶解温度为40℃、酶解时间为1 h、加酶量为2.5%时,多糖提取率为38.4%,而不加酶处理多糖提取率仅为21.7%,酶法处理大大增加了铁皮石斛的多糖提取率。同时,运用顶空固相微萃取技术结合气相色谱质谱联用仪(HS-SPME-GC-MS)分析比较α-L-鼠李糖苷酶对铁皮石斛挥发性成分的影响;GC-MS分析表明,铁皮石斛加酶处理前后共发现31种挥发性成分,主要成分均为己醛、1-辛烯-3-醇、异薄荷醇和3-辛烯-2-酮,并且醛类化合物在加酶处理前后的样品中相对含量均最高,且加酶处理后产生6种新的挥发性成分。该研究结果表明α-L-鼠李糖苷酶的使用可显著增加对铁皮石斛多糖提取率,并为铁皮石斛挥发性成分的研究和开发利用提供一定的参考依据。     

乌苏里鼠李的名实问题

在野外观察和查阅大量标本的基础上,认为Rhamnus ussuriensis J. Vass.应作为Rh. davurica Pall.的异名。     

黑曲霉CICIM F0410中α-葡萄糖苷酶的酶学性质研究

研究了黑曲霉(Aspergillus niger)CICIMF0410发酵粗酶液中α-葡萄糖苷酶的酶学性质,发现该酶最适反应温度为55℃,最适反应pH值5.0,在65℃以下保持酶活力相对稳定,且能在pH值(4.0～6.5)范围内保持相对较高的酶活力。以该菌株的染色体DNA为模板,PCR扩增出大小为3.1kb的片段,经序列比对发现与NCBI上已公布的黑曲霉(Aspergillus niger)CBS513.88(登录号XP_001402053)序列有2个碱基的区别:2272(A→G),3098(T→G),导致2个氨基酸残基的变化:687(Asn→Ser)、983(Ser→Arg)。     

黑曲霉Tx-78耐酸性α-淀粉酶的分离纯化及其性质研究

从酒由中选育得到产耐酸性α-淀粉酶的嗜酸性黑曲霉菌株Tx-78,经酒精沉淀,CM52和DE52纤维素离子交换层析对该酶进行纯化,通过SDS-PAGE检验其纯度并测得其分子量为74 ku.该耐酸性α-淀粉酶具有显著的热稳定性及酸稳定性.其最适反应温度与pH分别为70℃和pH 4.0.当反应温度低于60℃时,该酶在pH 4.0条件下可保持稳定活性达3 h以上.Ca2 、Ba2 对提高酶活力具有明显作用.薄层层析表明该酶制剂水解淀粉最终产物主要为麦芽糖和葡萄糖.     

霉菌α—糖苷酶固态发酵的研究

研究了一株产α-糖苷酶能力较高的黑曲霉菌株H－8的固态发酵的较佳产酶条件。结果表明：当麸皮加水比为1：1．00、混料装量10g（500ml三角瓶）、接种量2环、35℃培养48h后,酶活力对干麸曲计可达496.89U／g。     

棘孢曲霉固态发酵柚皮产柚苷酶及其在柑橘果汁脱苦中的应用

为了建立柚皮固态发酵产柚苷酶的工艺以及阐明其柚苷酶的应用价值,利用棘孢曲霉Aspergillus aculeatus JMUdb058对柚皮进行固态发酵,并研究其产酶特性。采用高效液相色谱法检测酶活力,通过单因素实验方法研究豆饼粉及培养基灭菌对柚苷酶发酵的影响;采用酶活力、还原糖以及生物量的变化解析发酵的动态规律;采用柚皮苷的水解活性表征柚苷酶对柑橘果汁的脱苦效果。结果表明,棘孢曲霉JMUdb058固态发酵柚皮可产生柚苷酶,额外添加豆饼粉可大幅度提高其柚苷酶活力;对培养基进行121℃20min的灭菌将导致柚苷酶活力急剧下降;当培养基组成为5g柚皮粉、0.75g豆饼粉、5.75mL蒸馏水,经30℃发酵8d时,柚苷酶和α-L-鼠李糖苷酶活力分别达到5.81IU/gds和6.08IU/gds;通过对产酶进行动力学拟合,发现柚苷酶和α-L-鼠李糖苷酶主要在棘孢曲霉的对数生长期内合成,它们的积累属于生长关联型;该柚苷酶可高效水解柚汁中的柚皮苷,柚皮苷去除率高达99.6%。因此,柚皮是固态发酵柚苷酶的良好原料,用棘孢曲霉对柚皮进行固态发酵是生产柚苷酶的有效方法。     

中国鼠李族花粉形态的研究

本文对国产鼠李科鼠李族5属25种的花粉形态进行了光学显微镜和扫描电镜的观察,并观察了 乌苏里鼠李的外壁超微结构。根据花粉大小、孔沟交界处四块加厚的程度和所形成的H形明显与否以及纹饰的不同作出了分类检索表,同时根据花粉形态特征认为把鼠李属的裸芽亚属和鳞芽亚属分立成为两个独立的属是比较适宜的。     

黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

【目的】以毕赤酵母（Pichia pastoris）KM71为宿主菌表达黑曲霉（Aspergillus niger）SG136 α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）。【方法】以实验室保藏的A. niger SG136总DNA为模板,根据NCBI 数据库中A. niger CBS 513.88 α-葡萄糖苷酶的cDNA序列（aglu）设计引物,通过PCR和重叠延伸PCR（overlap-PCR）方法,扩增得到aglu,将其克隆到载体pMD18-T simple vector,测序结果表明,aglu编码960个氨基酸。与A. niger CBS 513.88 α-葡萄糖苷酶相比仅有一个氨基酸的差异。将得到的aglu亚克隆到质粒pPIC9K,构建表达载体pPIC9K-aglu,经Bgl Ⅱ线性化后电转化P. pastoris KM71,经过MD、YPD/G418平板筛选表型,PCR方法验证,获得分泌表达重组P. pastoris KM71/pPIC9K-aglu。摇瓶培养中通过添加终浓度为1 %的甲醇诱导α-葡萄糖苷酶的分泌。【结果】SDS-PAGE显示表达蛋白的大小亚基分子量分别为98 kDa和33 kDa,阴性对照中没有出现此条带,非变性电泳检验为一条带。制备的粗酶液的酶学性质表明,转苷反应最适pH为5,最适温度为55 ℃。在最适pH和温度下,反应24 h时低聚异麦芽糖的总含量达到最大为26.0 %。【结论】黑曲霉α-葡萄糖苷酶在P. pastoris中获得可溶性表达,并证明有一定的转糖苷活性。     

Bacillus pumilus阿拉伯呋喃糖苷酶的重组表达及水解木聚糖的研究

从短小芽孢杆菌中克隆阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43并重组表达,有利于将该酶分离纯化后应用于其他半纤维素多糖的水解。该研究利用E.coli BL21表达系统对实验室克隆到的短小芽孢杆菌的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43进行重组表达并分析其酶学性质,将重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43和来源于棒曲霉突变菌株的商业木聚糖酶联合作用于燕麦木聚糖。结果表明:以燕麦木聚糖为底物,重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43的最适温度为50℃,最适p H为6.0。该酶在p H 5.0~10.0和45~55℃下较稳定。与木聚糖酶单独作用相比,重组Xyn43酶与商业木聚糖酶同时加入以及先用木聚糖酶水解后加入Xyn43酶,水解产物中的还原糖含量分别增加了16%和20%,木糖含量增加了35%和48%。该结果研究结果表明重组Xyn43酶能够和商业木聚糖酶协同降解燕麦木聚糖,提高水解效率,产生更多的木寡糖,阿拉伯糖和木糖。     

鼠李糖脂生物表面活性剂的研究进展

鼠李糖脂是一种重要的生物表面活性剂。综述了鼠李糖脂生物表面活性剂的化学结构、特性、生理学功能及其发酵生产,特别讨论了利用廉价原料——工农业的废物,如植物油废渣等来生产鼠李糖脂,其不仅可降低生产成本,还能减少工农业废渣对环境的污染,降低其处理费用。     

产鼠李糖脂生物表面活性剂大肠杆菌的构建与优化

目前鼠李糖脂生物表面活性剂主要由条件致病的铜绿假单胞菌生产获得,从而影响工业应用。为了开发一种相对安全的鼠李糖脂生产菌,将带有不同强度组成型合成启动子的鼠李糖基转移酶基因(Rhamnosyltransferase gene,rhl AB)以单、中、高3种拷贝数分别在大肠杆菌ATCC 8739中异源表达,实现了不同产量的鼠李糖脂异源合成。对rhl AB基因和rha BDAC基因簇(TDP-L-鼠李糖合成的基因簇)进一步利用合成启动子进行组合调控,筛选获得了最优生产鼠李糖脂工程菌——大肠杆菌TIB-RAB226。对大肠杆菌TIB-RAB226进行发酵温度优化,鼠李糖脂产量达到124.3 mg/L,是优化前的1.17倍。通过分批补料发酵,12h时鼠李糖脂产量达到209.2 mg/L。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析,共检出相对含量变化的5类质核比不同的鼠李糖脂同系物。本研究可为异源合成产鼠李糖脂提供重要参考。     

鼠李糖脂对微生物降解石油烃废水的影响

目的:研究鼠李糖脂对微生物降解石油烃废水的影响.方法:通过测定生物量和观察菌株表面来研究鼠李糖脂对菌株的影响;通过正交实验设计,确定石油烃降解率影响因素.通过石油烃降解率的测定,探讨鼠李糖脂与H2O2深度氧化协同作用对微生物降解石油烃的影响.结果:菌株对石油烃的降解率达53%,在相同条件下,添加鼠李糖脂的石油烃降解率提高了12%-20%.添加鼠李糖脂后菌株的生物量明显增多,菌株细胞表面疏水.正交设计表明,影响石油烃降解的主导因子是培养温度,其次是培养时间和鼠李糖脂的添加量.正交设计得到最佳组合为A3B2C1,即培养时间为7d;温度为35℃,鼠李糖脂浓度为60mg/L.3个因素的最佳组合下,石油烃降解率为82%.加入200 mg/L的H2O2时,降解率从82%提高到97%.结论:鼠李糖脂能促进菌株的生长.鼠李糖脂与H2O2深度氧化协同作用有助于微生物对石油烃类污染物降解效率的提高.