假密环菌Armillariella tabescens EJLY2098 β-甘露聚糖酶的克隆、表达及性质分析

本研究利用RT-PCR和RACE技术从Armillariella tabescens EJLY2098(一种食用真菌)中克隆出了β-甘露聚糖酶的全长cDNA,构建到pPICZaA载体上,并在毕赤酵母GSIl5中表达了含His标签的β-甘露聚糖酶(re-atMAN47).该酶的全长cDNA共1481 bp,编码445个氨基酸,序列分析表明该序列除含有β-甘露聚糖酶结构域外,还含有CBD和GHF5的结构域,因此可被归为糖苷水解酶家族5的一个新成员.诱导培养72 h时重组酶活可达到1.067 U/mL,蛋白含量为440 mg/L.重组酶的最适反应温度为60℃.在30℃～65℃比较稳定;酶促最适pH为5.5、4.5～7.0之间比较稳定.这是首次关于Armillariella.tabescens EJLY2098产β-甘露聚糖酶的报道,得到了一个有较好热稳定性、pH稳定性和生物安全性的糖苷水解酶,将在饲料,食品、药物生产等方面有广泛的应用.     

Armillariella tabescens EJLY2098 β-甘露聚糖酶atMAN47的纯化及酶学性质分析

以魔芋精粉为唯一碳源, 对假蜜环菌(Armillariella tabescens) EJLY2098进行培养, 诱导其产生β-甘露聚糖酶。经DEAE－阴离子交换层析后, 分离纯化出β-甘露聚糖酶atMAN47。酶学性质分析: 该酶分子量约为47 kD, 酶的最适反应温度为50°C, 在pH 5.0~6.5之间该酶的稳定性较好; Na+ 和Ba2+ 对该酶有激活作用, 用TLC对酶产物分析, 表明该酶为内切β-甘露聚糖酶。该酶为偏酸性的内切甘露聚糖酶, 适合发展为饲料的酶制剂, 具有良好的应用前景。     

Armillariella tabescens EJLY2098β-甘露聚糖酶的诱导、纯化及酶学性质分析

Armillariella tabescens EJLY2098经魔芋精粉诱导,可产β-甘露聚糖酶,再用正交实验优化诱导培养基,结果在培养基为魔芋精粉2％、蛋白胨1％、土豆汁25％、KH2PO4 0.3％、MgSO4·7H2O 0.15％、维生素B1 0.01％时可诱导出较高活性的酶。用DEAE－阴离子交换色谱从培养上清分离纯化β-甘露聚糖酶,出现2个活性组份。 活性组份P2 的SDS-PAGE分析,发现为电泳纯的一条带,分子量约78.9kD。 HPTLC分析, P2为内切β-甘露聚糖酶;酶反应的最适温度为60℃,最适pH 为4.0～6.0。保温30min的半失活温度t1/2为63℃,在pH 4.5～6.0之间稳定性较好。Na+和Ba2+对其有激活作用,等电点pI约为4.0～4.1。本研究获得了一株产β-甘露聚糖酶的新菌种,为进一步用基因工程方法克隆并构建具有完整自主知识产权的重组β-甘露聚糖酶基因工程菌提供了一个重要的基础工作。     

芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因的克隆及表达

从新疆极端干燥环境土壤样品中筛选到具有高β-甘露聚糖酶活性的芽孢杆菌(Bacillus sp.MX).运用PCR技术从该菌基因组中克隆得到β-甘露聚糖酶基因,连接到表达载体pET-28a上.在大肠杆菌BL21中高效表达的基因产物经亲和层析纯化,SDS-PAGE凝胶电泳分析显示该蛋白的相对分子质量为41 kD.酶学性质分析表明该酶在25～95℃,pH3.0～9.6范围内均具有酶活.最适作用温度55℃和pH值5.0,酶比活力为4 572 U/mg.在最适pH 5.0,高温85℃和95℃分别处理10min后,该酶相对酶活力仍保持51%和34%,显示β-甘露聚糖酶具有较好的耐酸性和热稳定性.     

产β-甘露聚糖酶内生菌

植物内生菌研究已经成为微生物研究的热点[1],最初主要集中于拮抗菌的筛选,近几年更关注于生物活性物质的分离.最近有报道,将从植物内生菌作为一种开发工业用酶资源的新角度去研究[2],这为继续开发其它工业用酶或生物活性物质的内生菌的研究提供了理论依据,从而拓宽了植物内生菌的应用研究范围.     

枯草芽孢杆菌中性内切β-甘露聚糖酶的纯化及性质

三草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＭ９６０２产生的中性内切β－甘露聚糖酶（ｅｎｄｏ－β－１,４－Ｄ－ｍａｎｎａｎ ｍａｎｎａｎｏｈｙｄｒｏｌａｅｓ,ＥＣ,３．２．１．７８）经硫酸铵分级沉淀、ＤＥＡＥ－纤维素（ＤＥ２２）离子交换柱层析,得到电泳纯的样品,提纯了４５．５倍,收率为５．９％。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得该酶的分子量为３５ｋＤ。用ＰＡＧＥＩＥＦ测得其等电点ｐⅠ为４．５。酶反应的     

基于易错PCR的假密环菌Armillariella tabescens MAN47β-甘露聚糖酶耐高温定向进化

本研究利用易错PCR技术突变假密环菌Armillariella tabescens MAN47β-甘露聚糖酶野生型基因,PCR产物与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体pYCα上连接,在大肠杆菌DH5α中扩增后电转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,构建了库容为10_4的初级突变体库,筛选得到耐高温最佳突变株M262.DNS法测得80℃处理30 min后最大酶活力为25 U/mL,较之野生型最适条件酶活力提高了4.3倍.序列分析表明,突变体有3个碱基发生了突变:T343A/C827T/T1139C,相应的氨基酸改变为Ser115Thr/Thr276Met/Val380Ala,利用SWISS-MODEL数据库同源建模显示,这3个突变氨基酸分别位于第4个13折叠的第6个氨基酸、第6个α螺旋的第1个氨基酸、第10个α螺旋和第11个β折叠之间的转角.     

产β-甘露聚糖酶内生菌的筛选及酶学特性分析

采用富集培养的方法从黄豆种子中分离出17株内生菌菌株, 利用刚果红染色法筛选出3株产β-甘露聚糖酶的内生菌。摇瓶培养并分别测定其酶活力, 其中一株酶活力较高, 达54.59 U/mL。经生理生化性质测定及16S rDNA序列分析, 鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。酶学性质分析发现, 该酶最适作用温度和pH分别为30 °C?50 °C和7.0, 在50 °C保温2 h酶活仍保留68%, pH 5.0?9.0条件下保温1 h酶活仍保留64%以上; Zn2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、K+对该酶有激活作用, 其中以Ca2+的激活作用最为明显, 使酶活提高了31%, Mn2+和EDTA对该酶有抑制作用。     

基于易错PCR的假密环菌Armillariella tabescens MAN47 b-甘露聚糖酶耐高温定向进化

本研究利用易错PCR技术突变假密环菌Armillariella tabescens MAN47 β-甘露聚糖酶野生型基因,PCR产物与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体pYCα上连接,在大肠杆菌DH5α中扩增后电转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,构建了库容为104的初级突变体库,筛选得到耐高温最佳突变株M262。DNS法测得80oC处理30min后最大酶活力为25U/mL,较之野生型最适条件酶活力提高了4.3倍。序列分析表明,突变体有3个碱基发生了突变:T343A/C827T/T1139C,相应的氨基酸改变为Ser115Thr/Thr276Met/Val380Ala,利用SWISS-MODEL数据库同源建模显示,这3个突变氨基酸分别位于第4个β折叠的第6个氨基酸、第6个α螺旋的第1个氨基酸、第10个α螺旋和第11个β折叠之间的转角。     

假密环菌cDNA文库的构建及其阿拉伯糖苷酶基因的克隆(英文)

用SMART技术构建了载体为λTriplEx2的假密环菌的表达型cDNA文库。文库滴度为1．0×106pfu／ml,重组率约为98．3％,扩增后滴度为3．1×108pfu／ml,容量约为4．2×1010。从文库中随机挑选176个克隆进行5’端测序,得到147条表达序列标签(EST),并将测序结果提交到EMBL数据库。随机测序结果表明:插入片段长度均在200-800之间。测序结果经过生物信息学分析,发现有43条序列与已知序列有明显同源性,其中序列AJ620046与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列有很高的序列一致性。用SMART-RACE技术成功获得了AJ620046的全长cDNA,克隆了AJ620046的开放阅读框AF,并成功构建了重组质粒pHIL-S1-AF,在毕赤酵母菌中进行了初步表达。     

重组阿拉伯糖苷酶在毕赤酵母中的分泌表达及其活性分析

假密环菌是一种果树腐病菌,具有较强的分解代谢纤维素的能力。本文根据已克隆出的阿拉伯糖苷酶基因序列（Accession Number AJ620046）设计引物从假密环菌的mRNA中克隆出阿拉伯糖苷酶的ORF片段,构建重组质粒pPIC9-AF,与组氨酸标签融合,电转化毕赤酵母菌GS115并进行诱导表达。所得到的重组阿拉伯糖苷酶在30-35℃时有较高的酶活,最适反应活性pH值在6.0-8.0之间,而在pH4.0－8.0范围内酶活基本保持在80%以上,比大多已报道的阿拉伯糖苷酶最适pH范围宽。本研究工作对于高效表达重组阿拉伯糖苷酶以及对其进一步的酶学性质研究提供了一个良好的基础。     

假蜜环菌发酵工艺的优化研究

目前,国内普遍采用亮菌固体发酵工艺生产亮菌制剂。采用小型发酵罐液体深层发酵和液体静置发酵对亮菌发酵工艺进行优化研究。液体深层发酵采用28℃,200 r/min,通气量1∶1 v/v·m,培养7 d,亮菌干重为16.55g/L,其中菌丝体中多糖含量为5.42%,蛋白含量为1.75%;液体静置发酵采用500 mL三角瓶,28℃,150 r/min,摇瓶3 d后静置发酵14 d,亮菌干重可达10.69 g/L,发酵液中多糖含量为1.016 g/L,蛋白含量为0.320 g/L。对液体静置发酵进一步研究发现其发酵液中亮菌甲素含量可达3.118 mg/L。由此可见,两种发酵方式在保证生物量和活性成分的前提下,缩短了发酵周期,均优于传统的固体发酵工艺,值得工业生产借鉴。     

假蜜环菌液体种子培养条件的优化及其应用研究

目前国内多采用固体菌种进行假蜜环菌的发酵生产。在假蜜环菌液体种子的培养及培养条件优化等方面进行了探讨,优化条件为:玉米淀粉为较适宜碳源;酵母浸出粉为较适宜氮源;添加KH2PO4、吐温-80对菌丝生长有一定的促进作用。正交试验结果显示,适合假蜜环菌菌丝体生长的培养基配方为玉米淀粉30 g/L,酵母浸出粉3g/L,KH2PO41.5 g/L。此外,还探讨了液体种子与传统的固体种子对固体发酵产物的影响,结果表明,接种液体种子能提高固体发酵的主要代谢产物的产量。该实验为改善假蜜环菌现行的生产工艺提供参考。     

Oxidase or peptidase? A computational insight into a putative aflatoxin oxidase from Armillariella tabescens

Aflatoxin oxidase (AFO), an enzyme isolated from Armillariella tabescens, has been reported to degrade aflatoxin B1 (AFB1). However, recent studies reported sequence and structure similarities with the dipeptidyl peptidase III (DPP III) family of enzymes and confirmed peptidase activity toward DPP III substrates. In light of these investigations, an extensive computational study was performed in order to improve understanding of the AFO functions. Steered MD simulations revealed long-range domain motions described as protein opening, characteristic for DPPs III and necessary for substrate binding. Newly identified open and partially open forms of the enzyme closely resemble those of the human DPP III orthologue. Docking of a synthetic DPP III substrate Arg₂-2-naphthylamide revealed a binding mode similar to the one found in crystal structures of human DPP III complexes with peptides with the S1 and S2 subsites’ amino acid residues conserved. On the other hand, no energetically favorable AFB1 binding mode was detected, suggesting that aflatoxins are not good substrates of AFO. High plasticity of the zinc ion coordination sphere within the active site, consistent with that of up to date studied DPPs III, was observed as well. A detailed electrostatic analysis of the active site revealed a predominance of negatively charged regions, unsuitable for the binding of the neutral AFB1. The present study is in line with the most recent experimental study on this enzyme, both suggesting that AFO is a typical member of the DPP III family.     

耐碱性甘露聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

通过功能平板从土壤中筛选得到含甘露聚糖酶基因的耐碱菌株。构建其基因组文库,从中筛选到甘露聚糖酶基因TM1并测序分析,用BLAST分析表明,TM1的氨基酸序列与其他在GenBank发表的甘露聚糖酶的氨基酸序列的同源性均低于60%,故确定其为一个新的甘露聚糖酶基因(GenBank登录号为AY623903)。将此基因去除信号肽后的编码序列克隆到表达载体pHBM905C上,得到重组质粒pHBM1201。经SalⅠ酶切后分别转化毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71、GS115、SMD1168,得到分泌表达的重组毕赤酵母。挑选相对表达量最高的重组毕赤酵母SMD1168-3在摇瓶中诱导产酶,对该酶的粗酶进行酶学性质分析表明,其最适反应温度为55℃,最适PH值为7.5,以魔芋粉为底物所测得的最高酶活为41.8U,半衰期为1h,在80℃保温5min其酶活由最初酶活的77%下降到11%,温度下降到55℃后活性可恢复到最初酶活的60%以上。     

假蜜环菌黄曲霉毒素氧化酶的基因克隆、表达、纯化及酶学性质分析

【目的】黄曲霉毒素氧化酶(aflatoxin-oxidase,AFO)来源于假蜜环菌(Armillariella tabescens)的细胞内提取物,具有转化黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)的特性。为更进一步了解该酶的性质,我们克隆了AFO的基因,并进行了重组AFO蛋白的表达、纯化和酶学性质分析。【方法】本研究利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得的AFO短肽序列设计简并引物进行逆转录,再通过cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术获得了AFO基因的全长cDNA序列。构建重组表达载体pPIC9-afo,在毕赤酵母中进行重组AFO(rAFO)的融合分泌表达,用Ni离子螯合层析进行rAFO的纯化,获得有活性的rAFO后,对其进行肽质量指纹(peptide mass fingerprinting,PMF)鉴定和酶学性质分析。【结果】黄曲霉毒素氧化酶(AFO)基因的开放阅读框为2088 bp,编码695个氨基酸;肽质量指纹鉴定结果显示重组AFO的肽片段序列覆盖率为63.2%。活性测定表明纯化后的重组AFO(rAFO)比活力为234 U/mg;对rAFO进行酶学性质分析表明,对于底物黄曲霉毒素B1,rAFO的Km值为3.93±0.20×10-6 mol/L;反应最适温度为30℃,最适pH为6.0;30℃放置90 min后酶活力下降50%;rAFO在pH5.5-7.0之间酶活力较稳定,相对活力维持在51%-65%之间。【结论】本文第一次成功克隆并重组表达了一种具有黄曲霉毒素B1转化功能的酶——黄曲霉毒素氧化酶(aflatoxin-oxidase,AFO),纯化后的重组AFO(rAFO)具有较好的黄曲霉毒素B1转化活性,为进一步研究和应用奠定了基础。     

Cloning,expression, and characterization of Aureobasidium melanogenum lipase in Pichia pastoris

cDNA of Aureobasidium melanogenum lipase comprises 1254 bp encoding 417 amino acids, whereas genomic DNA of lipase comprises 1311 bp with one intron (57 bp). The lipase gene contains a putative signal peptide encoding 26 amino acids. The A. melanogenum lipase gene was successfully expressed in Pichia pastoris. Recombinant lipase in an inducible expression system showed the highest lipase activity of 3.8 U/mL after six days of 2% v/v methanol induction. The molecular mass of purified recombinant lipase was estimated as 39 kDa using SDS-PAGE. Optimal lipase activity was observed at 35–37 °C and pH 7.0 using p-nitrophenyl laurate as the substrate. Lipase activity was enhanced by Mg²⁺, Mn²⁺, Li⁺, Ca²⁺, Ni²⁺, CHAPS, DTT, and EDTA and inhibited by Hg²⁺, Ag⁺, SDS, Tween 20, and Triton X-100. The addition of 10% v/v acetone, DMSO, p-xylene, and octanol increased lipase activity, whereas that of propanol and butanol strongly inhibited it.     

抗菌肽CM4基因克隆及其在毕赤酵母中的表达鉴定

为了在毕赤酵母中获得抗菌肽CM4表达,将抗菌肽CM4基因克隆入表达质粒pPIC9,SacⅠ线性化的重组表达质粒pPIC9-CM4电击转化P.pastorisGS115(his-),采用MM、MD板和PCR法筛选Mut 表型,甲醇诱导表达;抗菌活性检测、Tricine-SDS-PAGE及酸性活性电泳均表明抗菌肽CM4在毕赤酵母中成功地分泌表达;重组抗菌肽CM4对黑曲霉(Aspergillus niger)、绿色木霉(Trichoderma viride)都有很强的抑菌活性。