El Tor型CTXΦ对O1群不同霍乱弧菌的转染性研究

研究丝状噬菌体CTXΦ对O1群不同霍乱弧菌的水平转移效率及菌株的噬菌体免疫能力。利用带有氯霉素抗性基因遗传标记的CTXETΦ感染颗粒对O1群的4株不同霍乱弧菌进行体外和体内转染实验,根据氯霉素抗性筛选转染子,通过Southern Blot等方法进行验证并判断CTXΦ基因组的存在形式,计算比较不同菌株的转染率,分析转染及噬菌体免疫机制。带有遗传标记的CTXETΦ对古典型霍乱弧菌1119的体内转染率高于体外;体内转染实验中,古典菌株1119的转染率远高于其它3株El Tor型霍乱弧菌;在El Tor型霍乱弧菌中,不含rstR基因的IEM101的转染率高于另外两株带有rstR基因的霍乱弧菌2~3个数量级。古典型霍乱弧菌比El Tor型菌株对CTXETΦ噬菌体颗粒更易感,TCP菌毛的表达和rstR基因介导的噬菌体免疫影响CTXΦ在霍乱弧菌中的水平转移。     

4株霍乱弧菌非产毒株溶源性噬菌体pre-CTXΦ 的基因组结构分析

霍乱弧菌溶源性噬菌体CTXΦ携带霍乱毒素基因ctxAB,通过其结构基因gⅢ编码产生的PⅢ蛋白识别霍乱弧菌毒素共调菌毛(toxin co-regulated pilus, TCP)的主要结构亚单位TcpA,从而感染具有TCP的霍乱弧菌,使之成为产毒菌株。CTXΦ还有不携带ctxAB的前体pre-CTXΦ,根据CTXΦ基因组中调控基因rstR序列型不同,可分成不同的型别。在不同霍乱弧菌菌株的基因组中,已发现CTXΦ/pre-CTXΦ基因组及其亚型的多种组合排列方式。研究该噬菌体家族的基因组多样性,能够分析其进化及在霍乱弧菌产毒株形成中的作用。本研究发现了4株O1和O139群霍乱弧菌非产毒株具有pre-CTXΦ基因组及多样的rstR序列型,进一步对pre-CTXΦ在4株菌株中的基因组特征进行了分析。利用第3代基因测序法(短读长测序技术和单分子长读长测序技术),获得了4株菌株的基因组序列。利用长读长测序和拼接分析,精确地获得了具有长片段重复序列结构的pre-CTXΦ基因组排列,明确了4株测序菌株中多样的pre-CTXΦ基因组排列。在非产毒株基因组菌株VC3193中发现了携带古典型pre-CTXΦ;还在菌株VC702的pre-CTXΦ基因组中首次发现了肺炎克雷白菌的转座子结构(Gen Bank序列号：SRIL00000000)。在这4株测序菌株中,受体TcpA以及pre-CTXΦ的PⅢ蛋白也具有明显差异的序列,有 TcpA和PⅢ新序列型,这提示了CTXΦ家族感染宿主菌的受体-配体相互识别的复杂对应关系。本研究丰富了对CTXΦ/pre-CTXΦ家族基因组及其整合排列的多样化认识,也为分析该溶源性噬菌体在不同遗传特征霍乱弧菌菌株间的水平转移和促使新产毒克隆形成方面提供了更多的证据。     

从霍乱样腹泻患者分离出一株霍乱弧菌不凝集变异株及其鉴定

本文报道从一霍乱样腹泻患者粪便中分离出一株不凝集弧菌。该分离菌株的形态及生化反应等均与霍乱弧菌流行株相似,但与霍乱弧菌“Ｏ”多价血清不凝集。采用限制性核酸内切酶谱分析发现其染色质ＤＮＡ酶切图谱与霍乱弧菌流行株很相似,呈高度同源,认为该不凝集株可能是由霍乱弧菌变异形成,这在震乱流行病学上具有重要的意义。     

霍乱弧菌01群E1 Tor型溶血素的氨基末端区在古典型菌株中的表达及其细胞毒性

<正>产生霍乱毒素(CT)的01群霍乱弧菌引起人霍乱。某些非01群霍乱弧菌株能产生与霍乱毒素相似的肠毒素,而另一些来自临床腹泻病例的非01群菌却不产生这种毒素,这表明还有其它因素能引起腹泻反应。现已证明这些菌株能产生溶血素——一种可能的腹泻因素,尽管其致病机理尚不清楚。Yamamoto等人证实了非01群菌株和周群E1 Tor型菌株所产生的溶血素在生物学、理化住质和免疫学方面是难区分的。Southern杂交分析表明两者的基因基本上是相同的。     

冻干口服霍乱rBS-WC菌苗安全及效率评价的小鼠模型探讨

我们构建了高产、分泌霍乱毒素B亚单位的工程菌株E.coli MM2,并用该菌株生产的重组霍乱毒素B亚单位(rBS)与灭活霍乱弧菌菌体制成冻于口服rBS-WC菌苗。这一菌苗的实验室动物研究亦已进行,肯定其在多种动物安全、有效。目前已能较大量地生产rBS,正在探索放大与工业化生     

伤寒沙门氏菌Ty21α-霍乱弧菌杂交株口服菌苗的霍乱弧菌O-抗原在人体内的免疫迹象

<正>伤寒沙门氏菌Ty21a——一种安全有效的口服伤寒活苗苗——已被键议作为公认的外源性保护性抗原的载体。这种杂交株的称之为EX645的衍生林可产生霍乱弧菌Inaba株的O-抗原,最近显示出对用霍乱弧菌攻击的人类志愿者诱导低水平的抗临床霍乱的保护作用。尽管在口服EX645菌苗后产生强的局部性刺激和系统的体液抗-伤寒脂多糖(LPS)抗体应答,它们对霍乱弧菌O-抗原的应答却是低水平的。所观察到的抗霍乱弧菌攻击的低水平保护则属于不充足的局部抗体应答。     

O1群霍乱弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的:建立针对O1群霍乱弧菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法,并进行模拟粪便标本的检测评价。方法:根据O1群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb的特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立检测O1群霍乱弧菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法,对所建立的方法分别进行实验室内的灵敏度及特异性评价;将O1群霍乱弧菌灭活菌株悬液倍比稀释后与健康成人新鲜粪便混匀,制备成模拟带菌者粪便标本,提取DNA,进行Taq-Man PCR检测,用以评价该方法。结果:建立了快速检测O1群霍乱弧菌的实时荧光定量TaqMan PCR方法,灵敏度为每反应体系104拷贝;该方法对其他14种肠道菌DNA没有扩增;该方法对模拟粪便标本的检测灵敏度为每反应体系102 CFU。结论:建立了一种快速、高效检测O1群霍乱弧菌的荧光定量PCR检测方法,该方法可用于O1群霍乱弧菌临床粪便标本的检测。     

应用噬菌体肽库筛选能封阻霍乱噬菌体VP1转染菌细胞的寡肽

噬菌体感染细菌首先要吸附于细菌表面受体 ,从目前报道的细菌与噬菌体相互作用的研究中发现 ,这些受体包括细菌细胞外膜上的蛋白、糖脂结构和鞭毛等。霍乱弧菌是霍乱的病原体 ,高守一等 (副霍乱资料汇编 ,1 984,2 37～ 2 4 5 .)从国内分离并选择出 5株噬菌体 (VP1～VP5 ) ,根据霍乱弧菌菌株对噬菌体的敏感性不同 ,将埃尔托型霍乱弧菌分为 32个噬菌体型。结合生物学分型方法 ,可区分埃尔托型霍乱弧菌的两类不同菌株 (流行株和非流行株 )和不同菌型。对各种来源的菌株进行分型 ,可作为一种追溯传染来源、传播途径和分析流行形式的流行病学研…     

非01群霍乱弧菌溶血素基因的初步研究

本文报导86个不同血清型非01群霍乱弧菌菌株,用含El Tor霍乱弧菌溶血素基因的同位素探针作菌落原位杂交,结果显示其中80个菌株(占93%)具有与El Tor霍乱弧菌溶血素同源性基因;其余6株菌则显示阴性结果,表明不存在这种溶血素基因。但用表型方法测定时,它们都显示有溶血性。此说明非01群霍乱弧菌中存在有不同种溶血素。     

用单克隆抗体ELISA研究和分析霍乱弧菌抗原结果

本文用ELISA以12株单克隆抗体(McAb)对55株EI Tor弧菌和用遗传学方法突变的28株霍乱弧菌的菌体抗原进行了研究,同时与四种常规分型方法进行对比试验。用12株McAb可将55株El Tor弧菌分成11种抗原决定簇和18个McAb型,将遗传学方法的突变株分成9种抗原决定簇和10个McAb型。其中一株McAb2B_1H_1F_3能识别所有55株EI Tor弧菌和大部分突变株霍乱弧菌,表明有种的特异性;其余11株McAb与各型霍乱弧菌的抗原反应,均有差异,与这些菌株的反应百分比各不相同(21.0％～100％),表明可能存在着亚型和亚群。文中着重讨论了用McAb研究分析抗原的重要意义和McAb用于诊断的价值。     

PCR检测霍乱弧菌RTX吸毒素基因

建立了一种扩增最近发现的霍乱弧菌RTX毒素基因的PCR方法。在世界各地引起流行和散发霍乱病例的166株临床和环境霍乱弧菌分离物中,用PCR和Hep—2细胞细胞毒性试验发现它们都是产毒的。而在相关基因簇中有缺失的古典生物型标准株用这两种方法结果都是阴性。这是第一个用于鉴别O1群霍乱弧菌古典生物型菌株和E1　Tor生物型菌株以及包括O139血清型的其它非O1群菌株的快速基因分型方法。建立的PCR方法也可特异性地检测霍乱弧菌中的RTX毒素基因,因为用此RTX毒素特异性PCR以及Hep—2细胞毒性试验时副溶血弧菌、致腹泻性大肠杆菌、气单胞菌和邻单胞菌的临床分离株都是阴性。这些结果使霍乱弧菌中RTx毒素的特性明显了。其在细菌致病中的作用需要进一步研究。     

调控子fur影响霍乱弧菌生物膜的形成

目的:铁摄取调节蛋白Fur,其在细菌体内维持铁代谢稳态中担任着抑制剂和激活剂的双重角色,已有研究证实Fur还是霍乱孤菌的毒力调控子.研究证实生物膜的形成和游动性与霍乱弧菌的毒力相关,因此我们通过一系列表型实验分析Fur蛋白对霍乱弧菌生物膜形成影响,并预测依赖Fur与霍乱弧菌致病相关的基因,为后续研究做准备.方法:基于自杀质粒缺失霍乱弧菌的Fur基因,并构建相应回补株及蛋白表达株;通过表型实验,比较霍乱弧菌野生株和fur突变株在细菌运动能力、生物膜形成.结果:成功构建霍乱弧菌fur缺失株,回补株和蛋白表达株,His-Fur蛋白在上清液表达.表型实验表明fur突变株的菌株游动性降低,生物膜形成能力增强.结论;因此我们得出Fur可能与其它调控子一起,调控霍乱弧菌的表多糖,TCP和鞭毛蛋白的合成,从而抑制霍乱弧菌生物膜的合成.转录调控子Fur直接或间接调控一些与环境生存和致病相关的基因,对霍乱弧菌的传播、侵染、定殖等过程发挥作用奠定了基础.     

我国霍乱弧菌的脂肪酸分型研究

目的 对脂肪酸分型方法在霍乱弧菌菌株鉴定、菌株相似性分析等方面的应用价值进行评价。方法 选取了分离自我国的两个主要致病血清群的194株霍乱弧菌菌株（1961年以来的El Tor型和1992年以来的O139群）,提取脂肪酸,应用MIDI公司的脂肪酸分型系统,进行数据分析。结果 检测的所有菌株都含有的脂肪酸成分有13种。霍乱弧菌的判断符合率为88.6%。二维聚类分析没有成明显可区分的群, O139群霍乱弧菌的脂肪酸组成与O1群的相似,产毒与非产毒霍乱弧菌的脂肪酸成分没有显著差异。结论 脂肪酸分型对弧菌种的快速鉴定有应用价值,对霍乱弧菌的现场分离鉴定有辅助意义,在小样本暴发资料的研究中能够反映菌株之间的亲缘关系,但其对霍乱弧菌种属内的各种特征性菌群不具有鉴别能力。     

霍乱病与其它弧菌有关的腹泻(续完)

<正>A 流行病学和细菌学 a.O I霍乱弧菌 霍乱在人群中的传播形式需要结合最有效的流行病学技术和环境卫生微生物学做更细致的研究。这些研究应统一方法,要可能是防治霍乱最有效的特殊措施。 需要同时进行流行病学、微生物学和社会学的研究以便统一的确定霍乱的地方流行,在外环境中的持久性和季节性。 继续监测O I霍乱弧菌对抗菌素的耐药性,在自然界搜索含R因子菌株的规划须加速进行     

辽宁省2006-2012年霍乱弧菌表型特征及分子分型研究

目的分析辽宁地区2006-2012年霍乱弧菌的表型及分子分型特征。方法采用K-B纸片法,对29株霍乱弧菌菌进行10种抗菌药物的药敏试验;以PCR检测霍乱毒素基因(ctx A)、小带联结毒素基因(zot)、辅助霍乱肠毒素基因(ace)、溶血素基因(hly A)、毒素协调菌毛基因(tcp A)、外膜蛋白基因(omp U)和调控蛋白基因(toxR);采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法对菌株进行分子分型。结果霍乱弧菌对大部分抗生素敏感。毒力基因检测中,只有2011年水产品来源的菌株含有ctx A基因,水产来源菌株都含有hly A、toxR、omp U;外环境来源菌株均检出hly A、toxR。对29株霍乱弧菌进行PFGE分型(Not I酶切),共分为16个型别,分成4个聚类。结论辽宁省霍乱弧菌随着时间推移表型及分子特征均发生了变化。     

E1 Tor生物型霍乱弧菌溶血素的遗传和生物化学的研究

<正> 以前,我们从E1 Tov生物型OI群霍乱弧菌提纯了溶血素,发现这是一种分子量为60000的蛋白,它与非OI群霍乱弧菌溶血素在生物学、物理化学和免疫学上都难以区别之。     

霍乱弧菌甘露醇PTS操纵子中mtlR为转录抑制基因

产毒和非产毒的El Tor生物型霍乱弧菌对甘露醇发酵利用的速率有明显差别,在霍乱致病株的快速判断中有重要的参考价值。通过比较快发酵菌株(非产毒株)和慢发酵菌株(产毒株)mtlR缺失突变株与野生株在含0.2%甘露醇的M9培养液及甘露醇发酵液中生长、产酸等的变化,定性地证明了mtlR基因的抑制作用;另外通过定量RT-PCR进一步验证了MtlR蛋白在mtlCBA转录水平发挥负调控作用。但是mtlR还不是引起快慢发酵菌株对甘露醇发酵差异的直接原因。本研究也为我们研究霍乱弧菌甘露醇快慢发酵差异机制提供了必要的参考依据。     

以报告基因分析霍乱弧菌噬菌体VP1的预测启动子

VP1为感染并裂解霍乱弧菌的噬菌体,全基因组为环状双链DNA。通过测定该基因组序列,预测出15个可能的启动子区,利用报告基因质粒转化及全噬菌体共感染的策略分析了这些推测启动子在霍乱弧菌中的活性,将预测的启动子区分别克隆到启动子探测lacZ融合质粒载体pRS1274,在转化于大肠埃希氏菌受体菌株JM109中时,所有克隆子均呈现兰斑。同时将质粒电击到缺失了lacZ基因的霍乱弧菌菌株7743△Z,然后用噬菌体VP1感染转化菌株。在转化成功的13个含预测启动子片段的重组质粒中,通过检测β_半乳糖苷酶活性表达随感染后时间的变化,提示P17为早期启动子,P2、P3、P9等为中期启动子,P18为晚期启动子。     

噬菌体裂解细菌过程中冷光实时监测活菌方法的建立

产毒素的霍乱弧菌Vibrio cholerae可导致严重腹泻,已引起7次全球大流行.对于烈性噬菌体清除霍乱弧菌的效果评价上,一般使用传统的活细胞培养计数及噬菌斑进行观察分析,但操作费时耗力,尤其不能实时获得菌株被裂解及残存细胞的数量变化.进一步探索简便、能够实时监测噬菌体裂解霍乱弧菌的方法是非常必要的.利用荧光报告质粒...     

霍乱病与其它弧菌有关的腹泻(续二)

<正> A 非OI群霍乱弧菌 a 临床特微 这些细菌同胃肠疾病的暴发和散发有关,但临床上没有什么确切的特征。就散发病例来讲,从一个病例的分离的菌株不能确定它经常引起同种疾病。报导的各次暴发其其临床特征各异,可能反映出各个致病菌株的不同特性。一般病人有腹泻、恶心和呕吐,有些人有发烧或腹部痉挛,少数病人大便中有血和粘液。通常这种疾病持续不超过3天。 在孟加拉进行的广泛研究中,从病人分离的菌株如能产生类霍乱毒素肠毒素,该病人症状较重,分离出无毒性菌株的病人症状较轻。在这两类病人身上都证实了对同型菌株血清凝集效价明显升高,而且分离出毒性菌株的病人抗毒素效价也明显升高。 曾有报告说虚弱或免疫抑制的人胃肠外