植物遗传工程转化

将大分子导入完植物细胞的简易方法 美国弗古尼亚州立大学的F.-S.Wu、A.B.Cahoon及M.Shulleeta的研究证实:向完整植物细胞直接转移基因或其它大分子的困难不是由于其细胞壁本身的存在,而是由于细胞壁与质膜之间的紧密接触(限制了大分子通过细胞壁而进入质膜)引起的。他们发现,当利用渗透压变化使细胞壁与质膜之间产生空隙后,大分子就可通过细胞壁,利用直接转移技术(目前需用原生质体)就很容易把大分子导入细胞。 研究还报道,当洋葱表皮细胞或烟草茎细胞进行质壁分离时,蛋白质和DNA就能够穿透进入细胞壁,     

基因枪技术研究现状

利用特殊装置加速微粒子从而将物质转移到细胞或组织中的基因枪技术,由Sanford,J.C.等人于1987年发明以来,经过许多研究小组的大量创造性工作不断完善。到目前为止,其应用范围已包括细胞器、单细胞、组织乃致完整的机体。这些应用证明此方法有许多独特的优点:1.操作简便、迅速,可在较短时间内完成整个导入过程;2.可进行多次重复;3.费用低,可望成为普及型工具;4.传递效率高;5.无感染     

其它药物

920166大型动物细饱分裂素的分子生物学〔英〕/M alisz。“,ski,C.…/Ady.Vet.Sei.Comp.Med一1990,35一181~213〔译自DBA,1991,20(9),91一04983〕 内容如下:选择的细胞分裂素的生物学特性,用细胞分裂素调节血细胞生成和免疫应答,以及牛和猪的重组细胞分裂素,包括(i)牛重组白细胞介素一1,(ii)牛重组白细胞介素一2,(i 11)牛重组粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子,(iv)牛重组干扰素甲,(v)猪重组白细胞介素一1和(vi)它们的结构特征及其基因。可利用交又杂交技术克隆编码这些细胞分裂素的cDNA,并在酵母或细菌中得以表达。在基础水平上,大量重组…     

蛋白转导域研究进展

蛋白转导域(PTDs)是小分子多肽,又称为细胞渗透性蛋白(CPP)或转膜序列(MTS),它可以不依赖于经典的细胞内吞,将多种大分子物质导入细胞内。因此,PTDs被认为是一种理想的运载工具,在将蛋白和其他分子导入活细胞的研究中有着广泛的应用前景。本文着重综述PTDs的跨膜转运机制及其应用等方面的研究进展。     

细胞渗透肽的研究近况

细胞渗透肽是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽,其跨膜能力不依赖经典的胞吞作用,被认为是一种理想的运载工具,在将蛋白质和其他分子导入活细胞的研究中有着广泛的应用前景.该文着重介绍细胞渗透肽的跨膜转运机制及其应用等.     

PLGA人工抗原提呈细胞载体的制备

目的:目前常用的载体材料,在体内很难降解,限制了其在体内的应用,本文通过用PLGA微球制备人工抗原提呈细胞(AAPC)载体,对其功能进行验证.希望此方法能弥补传统方法的不足.方法:将软脂酸偶联到亲和素上,然后按照传统的复乳法来制备PLGA微球,并且通过使用荧光素(FITC)标记、生物素化的牛血清蛋白(BSA)对其功能进行验证.结果:通过该方法可以得到表面固定生物素的PLGA微球,并且证明软脂酸修饰并未影响到亲和素分子和生物素的结合,生物素化的BSA分子可以有效的结合到微球的表面.结论:PLGA微球表面很难引进合适的化学基团,导致其不能像聚苯乙烯微球那样通过化学反应来将亲和素分子固定在微球的表面上,通过将软脂酸偶联到亲和素分子上,可改变其表面很难引进合适的化学基团的不足,用其微球可用于制备AAPC载体.人工抗原提呈细胞是免疫学研究领域的新思路,可在基础免疫研究和临床治疗方面发挥较大的作用,但作为一门新兴技术,在制备、效果评价及应用方面需要逐渐完善和成熟,用PLGA微球为载体构建,弥补了磁珠、聚苯乙烯不能在体内降解的不足,且安全无毒,可供参考.     

利用动物细胞复制人的γ干扰素

钟渊化学工业公司在实验动物仓鼠的细胞中导入人的γ-IF(γ-干扰素)基因,确立了复制人的γ-IF的技术。以前,使用基因重组技术制造药品时,主要把人的基因导入大肠杆菌、酵母等微生物,但这种方法是有限度的。因为只能把目的物质(IF的情况下是糖蛋白)的一部分(蛋白部分)再生出来。钟渊化学工业公司的方法可完整地进行大量生产同人体内一样的免疫物质,正式地作为生物工程药品实际应用。该公司在进行这项技术开发时,是作成参入从人体细胞中取出来的γ-IF基因,称作嵌合     

生物素-亲和素系统及其应用(续二)

<正> 八、生物素衍生物 (一)生物素化大分子 用于生物素化的生物大分子物质最常见的是抗体。由于抗体分子上的氨基基团极易被活化生物素即生物素酸-N-羟基丁二酰亚胺(BNHS)所酰化,从而可使一个抗体分子接上多个抗生物素蛋白分子起反应。通常选用抗抗体(第二抗体)接上生物素,以便使用于不同的抗原-抗体反应体系。     

光生物素标记DNA探针检测感染细胞的BHV—1 DNA

将七株从不同地区、不同牛种或不同部位分离出的牛Ⅰ型疱疹病毒(BHV-1)培养于MDBK细胞中,从感染的细胞中提取病毒并抽提其DNA将克隆的BHV-1LA株DNA的HindⅢ—Ⅰ片段(11.7Kb)用光生物素标记作为探针,检测上述七株感染细胞的BHV-1 DNA,其中有六株(均属IBR临床型)呈阳性反应,另一株(属IPP临床型)呈阴性反应,这一探针将作为一种有效的检疫工具在本病的防制中起重要作用.     

生物素标记检测在基因探查中的应用

生物素标记检测技术用于分子杂交已有数年历史,并有很多成功的报道。其原理是用生物素标记的核酸探针进行分子杂交,尔后用免疫组化技术显示杂交结果。它具有快速、准确等优点,特别是避免了使用放射性同位索。它可用于细胞学、染色体及分子学标本,甚至石蜡切片。当然,此方法的灵敏度尚不及放射性探针,且常有本底过高。     

在被支持的膜筏上培养兰花组织

最近几年,由微孔聚丙烯膜或聚酯筛板制成的膜筏己被用来改进植物细胞和原生质体的培养.该技术(1)与固化的琼脂培养基相比能促进生长,(2)在培养基中容易从抑制物中移出,(3)对细胞次级代谢产物的回收仅有极微的阻碍作用,(4)简化了的无菌称量,(5)容易改变培养基,(6)能在同一容器中长期培养,(7)不需搅拌即可进行加氧作用和营养,(8)能够促进机械化.膜筏技术的一个缺点是该膜筏将会因植物组织生长所产生的重量而下沉. 在新加坡国立大学,C.S.Hew和同事们已经采用了修改的聚丙烯膜筏技术,培养兰     

异源Oct-4基因启动子在猪、兔和小鼠早期胚胎中的时空表达活性

Oct-4是一种哺乳动物早期胚胎中特异表达的转录因子,它与细胞多能性的维持有关．异源Oct-4基因在早期胚胎中的表达模式尚不明确．构建了一个以完整的牛Oct-4调控区指导GFP表达的转基因结构pOct-4(p)-GFP,通过单精子注射的方法将其导入猪、兔和小鼠的受精卵中,分析其在胚胎发育过程中的表达情况．结果显示：牛Oct-4启动子驱动的GFP基因在3个物种的2-细胞胚胎就已经开始表达,在囊胚期表达加强且只特异表达于内细胞团中,而不表达于滋养层．研究表明：牛的Oct-4启动子在其他物种中也具有表达活性,异源性Oct-4启动子在不同物种的早期胚胎中具有相似的表达模式．     

柯萨奇病毒B3 cDNA生物素探针的制备研究

本文将柯萨奇B组3型病毒(CVB3)cDNA的重组质粒DNA(pGP51B)转化到E.coli HB101菌株中.筛选转化阳性菌株,经培养扩增后,提取重组质粒DNA,用缺口求移法制备生物素标记探针,通过原位杂交技术检测CVB1.CVB3感染的Hela细胞及正常Hela细胞对照.结果该探针只与CVB杂交,而不与细胞对照杂交,且可检测出病毒感染5h尚未出现病变细胞中的病毒核酸.表明该探针具有良好的特异性和敏感性.     

基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化、纯化和检测方法

目的:建立并优化基于Avi-tag标签技术的人胚肾细胞增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的定点生物素化标记、纯化和检测方法。方法:分别构建具有Avi-tag标签的eGFP真核表达载体plenti-Avi-eGFP和BirA酶真核过表达载体pQCXIH-BirA,将plenti-Avi-eGFP和pQCXIH-BirA共转染人胚肾293T细胞,12 h后观察Avi-tag标签对eGFP蛋白在细胞内定位的影响;48 h后裂解细胞,用链霉亲和素珠子纯化生物素标记的eGFP,SDS-PAGE观察eGFP纯化和富集情况,并优化基于Western印迹的生物素化eGFP检测方法。结果:Avi-tag标签对eGFP在细胞内的定位无影响,同时BirA酶在293T细胞内可将带Avi-tag标签的eGFP标记上生物素;生物素化的eGFP可特异性地被链霉亲和素珠子纯化和富集,纯度可达95%;Western印迹检测生物素化蛋白的最终条件为5%的BSA作为封闭液和终浓度为100 ng/mL的链霉亲和素-HRP。结论:建立了基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化标记、纯化与检测方法,为该方法的广泛应用奠定了前期技术基础。     

离子束介导大豆DNA转化小麦后代高蛋白株的RAPD标记分析

利用离子束介导法将大豆DNA导入小麦,经过连续4代田间筛选和蛋白含量测定,获得高蛋白变异株系.采用RAPD分析技术,用34条随机引物对供体大豆、受体小麦和3个高蛋白小麦变异株的基因组DNA进行扩增.有29个引物扩增出清晰稳定的条带,其中18个引物扩增出的条带有不同程度的差异.高蛋白小麦突变株与受体小麦(对照)相比出现了条带的增加、缺失、扩增带深浅等变化,也出现了与受体小麦不同而与供体大豆相同的扩增带.实验结果表明,外源大豆DNA导入受体小麦可以引起后代基因组DNA序列变化,扩大小麦遗传基础.     

L-异亮氨酸生产新技术

<正> 日本三菱油化公司最近成功地开发了一种可高效率地生产必需氨基酸——L-异亮氨酸的新的生物技术,即:在生产过程中抑制菌体增殖,而不影响复合酶反应中的代谢能力。如,将乙醇同化菌——黄色短杆菌在添加生物素的培养基中进行增殖,然后再将其转移到去除了生物素等的培养基中,使菌体停止增殖,这时可高效率地将所添加的乙醇和2—酮基丁酸转化成正异亮氨酸,收率高达95%(纯度97%)。该工艺的优点是:(1)由于抑制了菌体的增殖,因此可降低原料的消耗;(2)由于去除生物素后杂菌难以生长,故培养基可不必灭菌;(3)菌体可反复循环使用,成本低;(4)副产物少,精制成本亦低。     

MAPPING重组噬菌体中插入片段的“分/合”策略

随着胚胎干细胞基因打靶技术不断推广应用,如何有效地从小鼠基因组DNA文库中筛选得到基因组DNA并进行结构分析(如限制性内切酶酶切图谱分析,即mapping等)已成为一个被普遍关心的问题.设计应用了“分/合”的策略,即先对重组噬菌体插入片段制备一套亚克隆,在对亚克隆进行详细的mapping的基础上,再对完整的大分子噬菌体DNA进行酶切分析,将两者相结合,可以分析得到完整的酶切图谱.应用此策略,简便准确地对所克隆的含有小鼠凝血因子IX基因组DNA的大分子插入片段进行了限制性内切酶酶切图谱分析,结果得到了DNA印迹等的验证.     

细胞内的大分子拥挤环境

所有的细胞中都存在着大量的蛋白质、核酸、多糖等各种生物大分子,它们大约占用细胞容积的20%～30%,总浓度高达80～200 g/L,因此任何一种大分子都处于一个充满其他大分子的拥挤环境中. 对源于排斥容积效应的拥挤理论分析表明它对所有大分子之间的反应在热力学和动力学上都有很大的影响. 可是以往人们在体外研究生物大分子的性质和相互作用时几乎都忽略了这样一个细胞大分子拥挤的实际环境. 最近几年建议把大分子拥挤与pH、离子强度和溶液组成等一样作为常规因素来研究生物大分子的呼声很高,在体系中添加大分子拥挤试剂以在体外模拟细胞内环境研究蛋白质折叠已有一些实验报道.     

植物组织培养的次生代谢产物 Ⅳ.生物素(诱导突变与生物测定)

1.实验材料生物素是一类维生素。可试用细胞筛选方法分离出生物素高产株。生物素在体内几乎均作为生物素酶的辅助因子以与蛋白质结合的形态存在,而参予CO_2固定与转移反应。缺乏生物素则毛发脱落、皮肤发炎。筛选生物素高产株必需先以多种富含生物素的植物细胞作为筛选高产株的试验材料,选出培养细胞种。     

基于亲和素-生物素双夹心体系测定外源性蛋白血清动态浓度的非抗体依赖新方法

建立一种非抗体依赖的检测外源性蛋白多肽分子代谢动力学血清浓度及动态变化的新方法．链亲和素为捕获分子,加入待测生物素标记蛋白或合成肽,辣根过氧化物酶标记链亲和素为检测分子,构成链亲和素-生物素标记大分子-酶链亲和素的双夹心体系,并进行特异性、敏感性、准确性及稳定性评价．本检测体系灵敏度高,可达0.3125 μg/L,且可通过改变亲和素包被浓度调整检出敏感度与检测范围．准确性回收率为97.82%～107.92%,批内、批间变异系数分别< 5.76% 和< 8.42%,并成功应用在生物素标记人血清白蛋白(biotin-HSA)与生物素标记鸡卵黏蛋白(biotin-OVM)的小鼠血清浓度动态检测．本方法不依赖抗体与放射性核素,可望在外源性蛋白多肽大分子及其药物的体内定量检测和代谢动力学研究中广泛应用．